1、.,1,SDS-PAGE原理及結(jié)果分析技巧 20161111,.,2,聚丙烯酰胺凝膠,聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺單體（acrylamide,Acr）和交聯(lián)劑NN-甲叉雙丙烯酰胺（methylene-bisacrylamide, Bis）以29:1的比例在聚合劑過(guò)硫酸銨(ammonium persulfate，APS)和催化劑TEMED的作用下聚合交聯(lián)成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠。 優(yōu)點(diǎn)：,凝膠孔徑可調(diào)節(jié)（改變單體和交聯(lián)劑的濃度），因此可根據(jù)被分離物的分子量范圍選擇合適的濃度 靈敏度可達(dá)1mg 分辨率高，可分離大小相差僅3%的多肽。尤其在不連續(xù)凝膠電泳中，集濃縮、分子篩和電荷效應(yīng)為一體 無(wú)電滲作用，只要

2、純度高，操作條件一致，樣品分離重復(fù)性好 凝膠透明，有彈性，機(jī)械效能好 化學(xué)性能穩(wěn)定，與分離物不發(fā)生化學(xué)反應(yīng); 對(duì)pH和溫度變化較穩(wěn)定,.,3,PAGE 電泳原理,分子篩效應(yīng): 分子大小和形狀 電荷效應(yīng)：大部分的蛋白質(zhì)在pH8.3電泳緩沖液的條件下帶有負(fù)電荷，表面負(fù)電荷多的蛋白質(zhì)遷移快，反之則慢 （強(qiáng)陰離子去污劑SDS使蛋白結(jié)構(gòu)松散，并帶上大量負(fù)電荷，導(dǎo)致本身電荷差別消失，因此SDS-PAGE分離蛋白主要依賴(lài)分子大小，而非電荷或形狀） 不連續(xù)系統(tǒng)具有對(duì)樣品的濃縮效應(yīng),pH值的不連續(xù) 緩沖液離子成分的不連續(xù) 電位梯度的不連續(xù) 凝膠濃度的不連續(xù)以及電壓的不連續(xù).,.,4,分離膠 (8-15%, pH

3、8.8),濃縮膠 (5%, pH6.8),加樣,加電場(chǎng)，樣品濃縮在界面上,電泳結(jié)束,+,.,5,電泳的應(yīng)用,測(cè)定蛋白質(zhì)分子量（亞基）；結(jié)合凝膠過(guò)濾層析可用來(lái)測(cè)定蛋白質(zhì)的分子量和聚合狀態(tài) 分析純度 測(cè)定蛋白質(zhì)的含量 蛋白質(zhì)水解分析 鑒定修飾（糖基化） 分離純化 結(jié)合Western Blot、免疫共沉淀等方法可用來(lái)鑒別蛋白質(zhì)相互作用,.,6,電泳的應(yīng)用,.,7,測(cè)定分子量,蛋白質(zhì)分子量在15,000200,000之間時(shí)，電泳遷移率與分子量的對(duì)數(shù)值線性相關(guān)：若將已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的遷移率對(duì)分子量的對(duì)數(shù)作圖，可以獲得一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，而從未知蛋白質(zhì)在相同電泳條件下的遷移率即可在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求得其分子量。 注意：SDS單體的濃度，為保證蛋白質(zhì)與SDS的充分結(jié)合，它們的重量比應(yīng)該為1:4或1:3； 樣品緩沖液的離子強(qiáng)度；二硫鍵是否完全被還原，許多蛋白質(zhì)是由亞基或兩條以上肽鏈組成的，這一類(lèi)蛋白質(zhì)，測(cè)定時(shí)只是它們的亞基或單條肽鏈的分子量；使用軟件分析需要圖片調(diào)正；上樣量少，條帶越寬分析偏差（偏?。┰酱蟆?.,8,測(cè)定分子量,非還原/還原蛋白質(zhì)狀態(tài)的比較：為什么要用還原性電泳測(cè)分子量？,.,9,測(cè)定分子量,.,10,測(cè)定分子量,.,11,測(cè)定分子量,.,12,測(cè)定分子量,.,13,測(cè)定分子量,.,14,純度分析,.,15,含量測(cè)定,.,16