1、臨床病原學檢查,主講人：,目的要求,掌握：感染性疾病的診斷和治療原則 熟悉：感染性疾病病原學實驗診斷及抗生素治療的主要實驗室監(jiān)測方法 了解：病原學診斷的重要性，現(xiàn)代感染的類型和病原微生物的變遷,病原體檢查的作用,1.感染性疾病的明確診斷 2.通過藥敏試驗指導臨床合理用藥 3.病原體監(jiān)控和耐藥性監(jiān)控,第一節(jié) 標本采集、運送和檢查方法,一.標本采集和運送,采集標本注意點： 1.標本容器必須無菌或清潔容器 2.選擇最佳時間采集標本，在抗菌藥物使用前 3.獲取標本時，須嚴格無菌操作 4.標本采集后，應盡快送實驗室,血 液,發(fā)熱初期和高峰期采集 抗菌藥物治療前 成人每次10-20ml，嬰幼兒1-2ml

2、標本不用抗凝劑 24小時內(nèi)，可在不同部位采血3次,尿 液,無菌采集清潔中段尿 導尿或膀胱穿刺獲得,糞 便,取含膿、血或粘液糞便置于清潔容器內(nèi) 排便困難者或嬰幼兒可用直腸拭子 對傳染性腹瀉須三次送檢,呼吸道標本,1.痰：自然咳痰法 氣管鏡采集法 2.鼻咽拭標本：同痰標本用清水漱口后采集,腦脊液與其他無菌體液,腦脊液標本應立即保溫送檢 胸腹水等體液標本應抽取2-5ml送檢,泌尿生殖道標本,性傳播疾病取尿道口分泌物、陰道宮頸口分泌物 生殖道皰疹常穿刺取皰疹液,創(chuàng)傷、組織和膿腫標本,開放性膿腫：無菌棉拭采集膿液 封閉性膿腫：無菌注射器穿刺抽取,二.病原體檢查的基本方法,1.臨床標本細菌檢驗一般程序,一

3、般程序,標本,直接涂片，染色鏡檢 分離培養(yǎng) 增菌培養(yǎng) 需氧培養(yǎng),二氧化碳培養(yǎng) 厭氧培養(yǎng) 觀察菌落形態(tài) 單個菌落 涂片、染色鏡檢,血清學鑒定 生化鑒定 藥敏試驗,確定致病菌發(fā)出報告,2.病原體診斷的基本方法,直接顯微鏡檢測（microscopic examination） 染色標本檢查法：革蘭染色和抗酸染色 不染色標本檢查法：懸滴法和壓滴法,2.病原體診斷的基本方法,病原體分離培養(yǎng)(isolation and culture)和鑒定(identification) 培養(yǎng)基選擇 生長條件：一般大氣條件 厭氧條件 微需氧條件,2.病原體診斷的基本方法,鑒定技術： 生化鑒定 血清學鑒定 數(shù)碼鑒定 自動

4、化鑒定,2.病原體診斷的基本方法,血清學診斷：查特異性抗體肥達氏試驗 病原體特異性抗原檢測 病原體核酸檢測：查特異基因片段DNA/RNAPCR、DNA探針雜交技術,第二節(jié) 細菌耐藥性檢查,一.抗微生物藥物敏感性試驗（AST）,1.定義：對敏感性不能預測的臨床分離菌株進行藥敏試驗，以指導臨床選擇治療藥物和了解區(qū)域或醫(yī)院內(nèi)常見病原菌耐藥性變遷，有助于臨床經(jīng)驗性治療選藥。,一.抗微生物藥物敏感性試驗（AST）,2.常用敏感性試驗方法 手工試驗:K-B紙片瓊脂擴散法 結(jié)果表示:S-Susceptible I-Intermediate R-Resistant 稀釋法（MIC） Etest 聯(lián)合藥敏試驗,

5、一.抗微生物藥物敏感性試驗（AST）,自動化儀器 Vitek，Microscan 分子試驗 PCR直接檢測mecA基因 補充試驗 Nitrocefin,一.抗微生物藥物敏感性試驗（AST）,3.藥敏試驗結(jié)果與臨床抗生素劑量關系 敏感(S)一般劑量有效，推薦使用該抗生素用于臨床治療 中介(I)大劑量有效，提示藥物MIC接近體液或組織可達到藥物濃度 耐藥(R)大劑量無效,即常規(guī)用藥劑量不能達到MIC,一.抗微生物藥物敏感性試驗（AST）,4.K-B紙片擴散試驗的影響因素 瓊脂厚度 與抑菌圈直徑成反比 菌液濃度 與抑菌圈直徑成反比 藥敏試紙 含量與抑菌圈直徑成反比 保存溫度20，使用前室溫平衡 30

6、min后開啟 濕度-密封容器，硅膠防潮 NCCLS標準 培養(yǎng)種類(MH),厚度(4mm) 接種量(0.5MF) 選藥標準,判讀標準,質(zhì)控標準,質(zhì)控參考菌,金黃色葡萄球菌 ATCC 25923 大腸埃希菌 ATCC 25922 銅綠假單胞菌 ATCC 26853,二.耐藥機制及耐藥性監(jiān)測試驗,1.耐藥菌株： 耐甲氧西林葡萄球菌（MRS） 耐青霉素肺炎鏈球菌（PRSP） 耐萬古霉素腸球菌（VRE） 質(zhì)粒介導的超廣譜-內(nèi)酰胺酶（ESBL） 多重耐藥的銅綠假單胞菌、嗜麥芽假單胞菌和不動桿菌,二.耐藥機制及耐藥性監(jiān)測試驗,2.耐藥機制： 藥物滲入細菌減少 產(chǎn)生滅火酶和鈍化酶(-內(nèi)酰胺酶) 細菌抗生素結(jié)合

7、蛋白發(fā)生改變（PBP） 代謝拮抗劑產(chǎn)生,二.耐藥機制及耐藥性監(jiān)測試驗,3.耐藥性監(jiān)測的特殊試驗 -內(nèi)酰胺酶檢測 方法:頭孢哨噻吩濾紙片法(nitrocefin) 意義: -內(nèi)酰胺酶檢測陽性,即對青霉素、氨卞西林等抗生素耐藥,二.耐藥機制及耐藥性監(jiān)測試驗,超廣譜-內(nèi)酰胺酶檢測（ESBL） 定義：是水解青霉素，一代、二代和三代頭孢菌及單酰胺類藥物的酶，產(chǎn)生ESBL的細菌對上述抗生素耐藥。 ESBL主要存在于大腸桿菌和肺炎克雷伯菌等革蘭陰性菌中。,二.耐藥機制及耐藥性監(jiān)測試驗,超廣譜-內(nèi)酰胺酶檢測（ESBL） 方法：紙片擴散法和稀釋法 意義：ESBL陽性預示對頭孢泊肟、頭孢他啶、頭孢噻肟、頭孢曲松和

8、氨曲南等抗菌藥物無效。,二.耐藥機制及耐藥性監(jiān)測試驗,瓊脂篩選試驗（agar screen test） 是以單一藥物單一濃度檢測細菌耐藥性，如耐甲氧西林葡萄球菌和耐萬古霉素腸球菌檢測。,二.耐藥機制及耐藥性監(jiān)測試驗,耐藥基因檢測 如MRSA中mecA基因檢測,耐藥性統(tǒng)計和分析,WHONET 建立本院、本地區(qū)和本國的細菌耐藥性監(jiān)測數(shù)據(jù)庫和網(wǎng)絡,第三節(jié) 醫(yī)院感染檢查（Nosocomial Infection）,醫(yī)院感染檢查,1.定義:病人入院時不存在,也不處于潛伏期，而在醫(yī)院內(nèi)發(fā)生的感染，包括醫(yī)院內(nèi)獲得而在出院后發(fā)病的感染。,醫(yī)院感染檢查,2.醫(yī)院感染常見病原體（細菌）：革蘭陰性桿菌、革蘭陽性球菌

9、（MRSA）、厭氧菌和深部真菌等,醫(yī)院感染檢查,3.感染源: 外源或內(nèi)源性病原體 外源性：其他住院患者、醫(yī)務人員、探望者（多為條件致病菌） 內(nèi)源性：患者自身皮膚、口腔、咽部和胃腸道固有的正常菌群等（免疫力低下患者）,醫(yī)院感染檢查,4.常見臨床類型 下呼吸道感染 尿路感染 手術切口感染 胃腸道感染 血液感染 皮膚和組織感染,醫(yī)院感染檢查,5.感染途徑： 接觸傳播 空氣、飛沫傳播 經(jīng)注射或輸液、輸血傳播 經(jīng)口傳播,醫(yī)院感染檢查,6.易感因素： 年齡：老年和嬰幼兒 慢性疾病患者 基礎疾病或醫(yī)源性 燒傷或創(chuàng)傷產(chǎn)生壞死性組織 大量使用抗生素 接受侵襲性治療操作,醫(yī)院感染檢查,7.醫(yī)院感染常見病原菌監(jiān)測

10、尿液標本 病原菌大腸埃希菌，變形桿菌，肺炎克雷伯氏菌，腸球菌，金黃色葡萄球菌，銅綠色假單胞菌 菌落計數(shù)104/ml以上尿路感染,醫(yī)院感染檢查,7. 醫(yī)院感染常見病原菌監(jiān)測 痰（咽拭子）培養(yǎng) 病原菌肺炎鏈球菌，肺炎克雷伯氏菌，大腸埃希菌，腸球菌，金黃色葡萄球菌，銅綠色假單胞菌等 半定量3+4+為致病菌，1+2+懷疑為污染菌,醫(yī)院感染檢查,7. 醫(yī)院感染常見病原菌監(jiān)測 痰（咽拭子）培養(yǎng) 甲型溶血性鏈球菌是亞急性細菌性心內(nèi)膜炎的主要致病菌,醫(yī)院感染檢查,7. 醫(yī)院感染常見病原菌監(jiān)測 糞培養(yǎng) 病原菌金黃色葡萄球菌，傷寒及其他沙門氏菌，志賀氏菌屬，致病性大腸埃希菌，霍亂弧菌，副溶血性弧菌，彎曲菌，念珠菌等,醫(yī)院感染檢查,7.醫(yī)院感染常見病原菌監(jiān)測 血培養(yǎng)： 病原菌：金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌等 單次血培養(yǎng)不易區(qū)分污染菌或感染菌。 兩次培養(yǎng)均為同種皮膚正常菌群可認為感染菌。,醫(yī)院感染檢查,8.醫(yī)院環(huán)境監(jiān)測和消毒滅菌監(jiān)測 空氣培養(yǎng)：沉降法采樣 物體表面監(jiān)測：壓印法 醫(yī)務人員手部細菌監(jiān)測 消毒滅菌效果監(jiān)測,小 結(jié),復習思考題： 名詞解釋：微生物直接檢測、微生物非培養(yǎng)檢測、醫(yī)院感染、