1、基因診斷與性傳播疾病 課件模板-18,基因診斷與性傳播疾?。喝?、艾滋病患者與腫瘤,三、艾滋病患者與腫瘤：,AIDS基于免疫功能缺陷導(dǎo)致腫瘤發(fā)生成為AIDS主要的致死原因之一，1986年曾在日本長畸召開“Kaposis肉瘤（KS）”及“AIDS”國際研究會(huì)中確認(rèn)AIDS并發(fā)KS與原始的KS有所不同，故AIDS與腫瘤的關(guān)聯(lián)性引起關(guān)注。 （一）Kaposis肉瘤（Kaposis Sarcoma，KS） KS是AIDS惡性腫瘤的代表病種，KS于1872年由Kaposis首先報(bào)道，他根據(jù)3例患者的觀察結(jié)果，描述了KS的臨床特點(diǎn)，以皮膚特發(fā)性，多發(fā)性，色素性肉瘤。,基因診斷與性傳播疾?。喝?、艾滋病患者與腫

2、瘤,三、艾滋病患者與腫瘤：,認(rèn)為是非洲大陸赤道地區(qū)一種地方多發(fā)病，在當(dāng)?shù)氐乩項(xiàng)l件下，主要侵犯中老年男性，在四肢發(fā)生多數(shù)的大小不同的結(jié)節(jié)，后人稱此病為Kaposis肉瘤。 1。Kaposis 肉瘤形成因素。 KS的形成因素目前尚不清楚，AIDS并發(fā)KS的原因，誘因以及與其關(guān)聯(lián)性有以下思考： （1） AIDS中約30%并發(fā)KS，此AIDS流行病型KS有90%為男性同性戀者，從地理病毒學(xué)病態(tài)象上分析原因，目前還不能明確有什么直接關(guān)聯(lián)，從學(xué)術(shù)角度觀察，感染AIDS病毒時(shí)可見單核細(xì)胞血管增殖性因子，有人認(rèn)為此因子是發(fā)生KS的重要因素。,基因診斷與性傳播疾?。喝?、艾滋病患者與腫瘤,三、艾滋病患者與腫瘤：,

3、1995年曾有學(xué)者對(duì)KS細(xì)胞的增殖因子有過記述，用KS細(xì)胞進(jìn)行長期培養(yǎng)在活性化的CD4陽性T細(xì)胞的培養(yǎng)上清中證明對(duì)KS細(xì)胞有劇烈的增殖，促進(jìn)活性作用。 （2） 免疫缺陷狀態(tài)，免疫缺陷發(fā)生KS是AIDS發(fā)病的重要癥狀之一。免疫缺陷與KS發(fā)病之間存在著密切的關(guān)系，如腎移植時(shí)在治療中進(jìn)行人工的免疫抑制狀態(tài)時(shí)或在麻風(fēng)病人等并發(fā)KS。,基因診斷與性傳播疾病：三、艾滋病患者與腫瘤,三、艾滋病患者與腫瘤：,在免疫抑制劑療法停止后可自然消退。AIDS患者免疫缺陷而KS發(fā)生較多見。 （3）CMV：AIDS并發(fā)KS病例，檢出巨細(xì)胞病毒（CMV）約80%以上，是否該病毒與KS發(fā)生有關(guān)系？最近，日本一學(xué)者從KS病人血

4、清中檢出CMV抗體，用熒光抗體法檢出異型細(xì)胞的核及胞體內(nèi)有與CMV有關(guān)的抗原。,基因診斷與性傳播疾?。喝?、艾滋病患者與腫瘤,三、艾滋病患者與腫瘤：,（4）EBV：EBV與KS的關(guān)系用間接方法對(duì)一非洲型淋巴細(xì)胞瘤及KS進(jìn)行檢測，認(rèn)為與地理病理學(xué)有關(guān)系，并指出EBV與KS關(guān)系是今后值得研究的課題。 2。Kaposis肉瘤臨床癥狀。 KS侵犯的部位很廣泛，四肢、顏面以及軀干等處，皮膚均可出現(xiàn)，口腔粘膜、眼瞼、粘膜處也有發(fā)生。此外，肺、肝、脾等臟器，尤其是消化道發(fā)生時(shí)易出現(xiàn)大出血危險(xiǎn)。,基因診斷與性傳播疾?。喝?、艾滋病患者與腫瘤,三、艾滋病患者與腫瘤：,總之，KS可在全身各處發(fā)生，其臨床表現(xiàn)： 結(jié)節(jié)型

5、：櫻桃紅色或紫色，表面平滑，突出皮膚表面，境界清楚，質(zhì)較硬。壓迫可使其體積縮小，放松后10秒內(nèi)恢復(fù)原狀。此征稱為Hayne氏征，結(jié)節(jié)可分布于全身各處，但以雙下肢、腳和前臂等處最常見。典型的病灶易出血，但無疼痛，病人多為年長者。病后存活期10年左右。,基因診斷與性傳播疾病：三、艾滋病患者與腫瘤,三、艾滋病患者與腫瘤：,浸潤型，皮損互相融合，潰瘍或疣狀增生，常累及皮下和骨組織，此型多發(fā)生于下肢和足部，皮損中有結(jié)節(jié)存在。該型進(jìn)展快，存活期不超過3年。 泛發(fā)型：是指除皮損外病變廣泛侵及內(nèi)臟器官組織，如胃腸道、肝、脾、呼吸道和淋巴組織等。淋巴組織被侵犯時(shí)，可稱淋巴腺樣Kaposis肉瘤。泛發(fā)型雖然只占全

6、部病例的5%左右，但病情發(fā)展快，預(yù)后不良，常因大出血而危及生命。,基因診斷與性傳播疾?。喝?、艾滋病患者與腫瘤,三、艾滋病患者與腫瘤：,KS肉瘤患者常有營養(yǎng)不良，兒童病人可有皮膚粗糙征，腸原性肢端皮炎，壞血病樣皮損及重癥口瘡等。還有50%的病人伴有甲黃癥。 3。 KS病理改變。 腫瘤結(jié)節(jié)是由梭形細(xì)胞和小血管組成，而且血管高度擴(kuò)張，管壁變薄，細(xì)胞增殖與梭形內(nèi)皮細(xì)胞浸潤，梭形細(xì)胞分化較好，細(xì)胞排列緊密呈編織狀，細(xì)胞間纖維組織豐富。,基因診斷與性傳播疾?。喝?、艾滋病患者與腫瘤,三、艾滋病患者與腫瘤：,小血管為毛細(xì)血管和血竇，并可見有一些以梭形細(xì)胞為界，充滿紅細(xì)胞的裂隙。小血管呈零散或片狀分布在梭形細(xì)胞

7、之間，二者緊密結(jié)合。這種損害在真皮的中下層，向外可向表皮侵犯形成潰瘍，內(nèi)可侵犯骨質(zhì)。結(jié)節(jié)中有時(shí)可見到出血及含鐵血黃素沉著。周圍可有小淋巴管擴(kuò)張，淋巴細(xì)胞浸潤，漿細(xì)胞反應(yīng)及肉芽增生現(xiàn)象，形狀很不規(guī)則。,基因診斷與性傳播疾?。喝?、艾滋病患者與腫瘤,三、艾滋病患者與腫瘤：,有時(shí)還可發(fā)現(xiàn)有淋巴管肉瘤、血管外皮瘤及微小Kaposis肉瘤內(nèi)多發(fā)的血管球瘤等改變。 4。 KS治療：AIDS相關(guān)型KS治療較傳統(tǒng)的KS困難。 （1）聯(lián)合治療 長春花堿（Vinblastine）對(duì)AIDS的KS有明顯療效，開始劑量4mg，生理鹽水或5%葡萄糖20-30ml靜脈注射，在維持白細(xì)胞在2.5-3109/L的情況下，漸增至

8、每次9mg，每周一次，6-8周。,基因診斷與性傳播疾?。喝?、艾滋病患者與腫瘤,三、艾滋病患者與腫瘤：, 春新堿（Vincristine）與長春花鹼相似，對(duì)AIDS的KS有一定療效，1.4-2.0mg/次，用生理鹽水20-30ml靜脈注射，每周一次。 足葉乙甙（etoposide vepesid， VP-16）是治療AIDS的有效藥物。 博來霉素，阿霉素。 （2）放射療法，可緩解癥狀，有效劑量1800-3000rad。,基因診斷與性傳播疾?。喝?、艾滋病患者與腫瘤,三、艾滋病患者與腫瘤：,（3）局部液氮冷凍。 （4）免疫調(diào)節(jié)劑：干擾素、異丙肌苷、胸腺素、白細(xì)胞介素等。 （二）淋巴瘤 HIV感染出現(xiàn)

9、非何杰金淋巴瘤是診斷AIDS的一個(gè)指標(biāo)。AIDS患者中大約有5%-10%的人可能發(fā)生非何杰金淋巴瘤，其中包括腦的原發(fā)性細(xì)胞淋巴瘤。大部分患者為分化不良型的淋巴瘤，包括小分裂細(xì)胞型和大細(xì)胞免疫母細(xì)胞型，這些病人常出現(xiàn)淋巴結(jié)外病變，并常侵犯骨髓，中樞神經(jīng)系統(tǒng)和胃腸道、肝、皮膚和粘膜等部位，大多數(shù)患者表現(xiàn)淋巴結(jié)迅速腫大，淋巴結(jié)外腫塊，或出現(xiàn)嚴(yán)重的發(fā)熱、盜汗、體重減輕，有些患者常出現(xiàn)原發(fā)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的淋巴瘤。,基因診斷與性傳播疾?。旱诹?jié) 診斷,第六節(jié) 診斷：,一、診斷依據(jù)： （一）流行病學(xué)及臨床表現(xiàn) （二） 實(shí)驗(yàn)室檢查 （1）主要是中度以上細(xì)胞免疫缺陷包括：CD4+T 淋巴細(xì)胞耗竭：T淋巴細(xì)胞功能

10、下降，外周血淋巴細(xì)胞顯著減少，CD4200/l，CD4/CD81.0，（正常人為1.252.1），遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)皮試陰性，有絲分裂原刺激反應(yīng)低下。,基因診斷與性傳播疾?。旱诹?jié) 診斷,第六節(jié) 診斷：,（2）B淋巴細(xì)胞功能失調(diào)：多克隆性高球蛋白血癥，循環(huán)免疫復(fù)合物形成和自身抗體形成。 （3）NK細(xì)胞活性下降 （4）各種致病性感染的病原體檢查如PCR。組織學(xué)證實(shí)的惡性腫瘤，如KS； （三）HIV抗體檢測 1.酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）；2.明膠顆粒凝集試驗(yàn)（PA）；3.免疫熒光檢測法（IFA）；4.免疫印跡檢測法（Western Blot，簡稱WB法）；5.放射免疫沉淀法（RIP）。,基因診斷與

11、性傳播疾?。旱诹?jié) 診斷,第六節(jié) 診斷：,其中前三項(xiàng)常用于篩選試驗(yàn)，后二者用于確證試驗(yàn)。HIV感染后數(shù)周或數(shù)日內(nèi)常不能檢出抗體，95%的受染者在5個(gè)月內(nèi)可測出抗體。但也有感染后3-4年仍不能檢出抗體者，此時(shí)有必要檢測HIV病毒。 （四）PCR技術(shù)檢測HIV病毒 1。標(biāo)本的采集與模板核酸的制備。從懷疑為AIDS和ARC患者以及無癥狀的同性戀者采集血液標(biāo)本，分成兩份，其中一份送往檢測實(shí)驗(yàn)室與Glyciegel混合進(jìn)行常規(guī)檢驗(yàn)或者在-20-80保存。,基因診斷與性傳播疾?。旱诹?jié) 診斷,第六節(jié) 診斷：,另一份可在凍存之前通過聚蔗糖（Ficoll）離心分離，收集沉積細(xì)胞。此法亦適用于疑為HIV感染的母

12、親及出生6個(gè)月以上的新生兒的血液標(biāo)本。 可采用下述方法自血液標(biāo)本中分離外周血單核細(xì)胞（PMC）： 取4ml血液用Hanks液1：1稀釋。 向含有1份淋巴細(xì)胞分離液的試管內(nèi)輕輕加入兩分稀釋的血液，勿攪亂分層。,基因診斷與性傳播疾?。旱诹?jié) 診斷,第六節(jié) 診斷：, 2500r/min離心20min。 吸出介于淋巴細(xì)胞分散液和血漿層間的PMC層，再用Hanks液洗兩遍。 加入RPMI-1640生長液（10%胎牛血清，10%白介素-2，2g/mlpolyberen 及2.5g/ml的植物血凝集素P）,使細(xì)胞濃度為2106/ml。,基因診斷與性傳播疾?。旱诹?jié) 診斷,第六節(jié) 診斷：, 置5%CO2的孵箱

13、內(nèi)于37培養(yǎng)23d，作為HIV分離的靶細(xì)胞。 2。模板核酸的提取。制備PCR模板核酸有多種方法，但其基本原理大致相同，使用的試劑因采取的方法不同而異。這里分別介紹兩種從外周血單核細(xì)胞中提取DNA和RNA的方法。 （1）從外周血單核細(xì)胞中提取DNA 方法A： 取1ml經(jīng)37快速解凍的Glyciegel凍存細(xì)胞置一支小離心管內(nèi)。,基因診斷與性傳播疾?。旱诹?jié) 診斷,第六節(jié) 診斷：,加入2ml含有10%胎牛血清的RPMI-1640溶液洗一次。 2500r/min離心10min，棄上清。 沉淀的細(xì)胞用PBS洗兩次，最后將細(xì)胞懸浮在溶液A（100mmol/KCl，10mmol/LTris-HCl，pH8

14、.3）中，使細(xì)胞濃度為6106/ml。 加入等體積的溶液B（10mmol/LTris-HCl，pH8.3，2.5mmol/l MgCl2，10%Tween20，10%NP-40）。,基因診斷與性傳播疾?。旱诹?jié) 診斷,第六節(jié) 診斷：, 于37保濕后置冰箱保存。 該方法也適用于無Glyciegel保存的肝素標(biāo)本及新鮮樣品經(jīng)聚蔗糖-400離心制備的淋巴細(xì)胞DNA的提取。 方法B： 取4ml經(jīng)37快速解凍的Glyciegel標(biāo)本。 2500r/min離心10min，收集沉淀的細(xì)胞，上清液可作血清學(xué)研究用。,基因診斷與性傳播疾?。旱诹?jié) 診斷,第六節(jié) 診斷：,用10ml0.9%NaCl（含50%葡萄糖

15、）將沉淀的細(xì)胞洗一次。 再用10ml 0.9%NaCl（含50%葡萄糖）洗兩次。 通過聚蔗糖-400離心，分離單核細(xì)胞。 將單核細(xì)胞懸浮于0.5ml裂解緩沖液（10mmol/L，Tris-HCl pH8.3，10mmol/L EDTA，10mmol/L NaCl，0.5%SDS，100g/ml蛋白酶K）中使細(xì)胞裂解。,基因診斷與性傳播疾?。旱诹?jié) 診斷,第六節(jié) 診斷：,用酚一氯仿抽提兩次，將水相轉(zhuǎn)移到一支新的離心管內(nèi)。 加入3倍體積的無水乙醇，于-20放置20min，13000r/min離心10min，棄上清，沉淀物經(jīng)真空干燥后，用100l蒸H2O溶解，于-20保存。 該方法也適用于標(biāo)本經(jīng)聚蔗

16、糖-400離心制備的單核細(xì)胞DNA的提取。,基因診斷與性傳播疾?。旱诹?jié) 診斷,第六節(jié) 診斷：,（2）從外周血單核細(xì)胞中提取RNA及其反轉(zhuǎn)錄 方法A： 5ml血液標(biāo)本，通過聚蔗糖-400離心制備外周血單核細(xì)胞。 將細(xì)胞懸浮于10mlRPMI-1640離心制備外周血單核細(xì)胞。 2500r/min離心20min，收集沉積細(xì)胞。 把細(xì)胞懸浮于一定體積的預(yù)冷的裂解緩沖液（0.4mmol/L NaCl，10mmol/l Tris-HCl，pH8.3，1.5mmol/L MgCl2,0.5% NP-40）中,使細(xì)胞濃度為104/ml。,基因診斷與性傳播疾?。旱诹?jié) 診斷,第六節(jié) 診斷：, 13000r/m

17、in，于4離心10min，收集上清液。 把含有RNA的上清液轉(zhuǎn)移到一支新管內(nèi)，立即置-80保存，備用。 在RNA反轉(zhuǎn)錄前，先將RNA樣品用DNase處理，除去樣品中殘留的DNA。經(jīng)反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA即可進(jìn)行PCR擴(kuò)增。RNA反轉(zhuǎn)錄操作如（7）（9）。,基因診斷與性傳播疾?。旱诹?jié) 診斷,第六節(jié) 診斷：, 取10lRNA樣品加2.7UDNase I。 于37保溫10min,9310min,立即放入冰浴中冷卻。 另將一份DNase I處理過的RNA樣品，加入RNase A（15g/份），37保溫10min，置-20保存。 方法B： 取5ml新鮮血漿置一支離心管內(nèi)。,基因診斷與性傳播疾?。旱诹?jié)

18、診斷,第六節(jié) 診斷：,40000r/min，4離心10min，收集沉淀。 將沉淀物溶于變性液（4.0mmol/L異硫氰酸胍,25mmol/L檸檬酸緩沖液pH7.0,0.5sarcosyl,0.1mmol/L2-巰基乙醇）中充分混勻. 加入30l2mmol/L乙酸鈉緩沖液pH4.2,400l酚和80l氯仿/異戊醇混合液(24:1),萃取1min,冰上放置20min. 13000r/min離心20min. 輕輕將水相轉(zhuǎn)移到一支新管中. 加入3倍體積的無水乙醇,-20放置1h左右. 13000r/min,4離心15min,收集沉淀. 沉淀物用75%乙醇洗滌兩次,真空干燥. 加入10l 水溶解,立即置

19、-80保存或者反轉(zhuǎn)錄. 取10l RNA樣品. 加入10l 1PCR緩沖液(50mmol/LNaCl，10mmol/L Tris - HCl，pH8.3,1.5mmol/L MgCl2 0.01%明膠),各0.2mmol/L四種dNTP,10pmol/GN GHd QLP GX PUH R XHHTR 39,20URNA酶抑制劑(RNsin),10U的AMV逆轉(zhuǎn)錄酶。,基因診斷與性傳播疾?。旱诹?jié) 診斷,第六節(jié) 診斷：, 42保溫3060min,然后935min. 立即置冰浴中冷卻，備用。 由上述方法制得的RNA反轉(zhuǎn)錄樣品，通過10%聚丙烯酰胺凝膠電泳可鑒定其特異性。 二、PCR擴(kuò)增步驟 （一

20、）引物的設(shè)計(jì)與合成 HIV PCR引物設(shè)計(jì)應(yīng)遵尋引物設(shè)計(jì)的一般原則。由于HIV基因易發(fā)生變異，因而引物應(yīng)在保守區(qū)內(nèi)設(shè)計(jì)，一般在pol、evn、gag、tat基因中的核酸序列內(nèi)設(shè)計(jì)，HIV感染的細(xì)胞往往很少，要從106個(gè)正常細(xì)胞中檢出1個(gè)HIV感染細(xì)胞，PCR擴(kuò)增的引物首先要具有特異的結(jié)合HIV相應(yīng)基因能力，同時(shí)一般要采用巢式-PCR方法，來提高檢測的靈敏性。,基因診斷與性傳播疾?。旱诹?jié) 診斷,第六節(jié) 診斷：,檢測HIV引物的第二步驟就是擴(kuò)增HIV感染細(xì)胞中的原病毒DNA。感染細(xì)胞與未感細(xì)胞混合得到連續(xù)的10倍感染細(xì)胞的稀釋液。通常由103/106個(gè)感染細(xì)胞稀釋至1/106個(gè)感染細(xì)胞。同時(shí)用其

21、它逆轉(zhuǎn)錄病毒感染細(xì)胞的DNA作對(duì)照，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。然后通過Southern雜交及DNA序列分析，進(jìn)一步確定擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。,基因診斷與性傳播疾?。旱诹?jié) 診斷,第六節(jié) 診斷：,已經(jīng)被確定的保守區(qū)是gag，tat，evn，pol基因中的某些核苷酸序列。在用于臨床標(biāo)本檢測之前，要對(duì)引物的特異性進(jìn)行鑒定。通常取100pg含有HIV基因組序列的質(zhì)粒DNA稀釋和2g載體鯡魚精DNA。如引物是特異的，它們就會(huì)指導(dǎo)單一的雙股DNA片段的合成。合成的DNA片段相對(duì)應(yīng)于兩引物5末端之間距離。,基因診斷與性傳播疾?。旱诹?jié) 診斷,第六節(jié) 診斷：,如果是另一種DNA模板，就不會(huì)合成任何DNA片段。如果合成的DN

22、A片段不是所預(yù)期的或除了有所預(yù)期的片段還有其它的DNA片段，那么可以考慮對(duì)PCR的條件進(jìn)行某些改進(jìn)，看是否能改善其特異性，否則要另選引物。 表6-20 用于HIV PCR擴(kuò)增的引物及探針 引物及探針序列（53）基 因區(qū)片段（bp）SK38ATAACCACCTATCCCAGTAGGATAAATgag115(HIV1)SK39TTTGGTCCTTGTCTTATGTCCAGAATGCSK19(P)ATCCTGGGATTAAATAAAATAGTAAGAATGTATAGCCCTACSK145AGTGGGGGGACATCAAGCAGCCCATGCAAATgag141(HIV1)SK101GCTATGTCA

23、GTTCCCCTTGGTTCTC139(HIV2)SK102(P)GAGACCATCAATGAGGAAGCTGCAGAATGGGATSK145AGTGGGGGGACATCAAGCAGCCCATGCAAATgag142(HIV1)SK150TGCTATGTCACTTCCCCTTGGTTCTCTC139(HIV2)SK102(P)GAGACCATCAATGAGGAAGCTGCAGAATGGGATO-1GGGCAAATGGTACATCAGGCCATATCACgag525(HIV1)O-2TTTTACCTCCTGTGAAGCTTGCTCGGTCI-2TTGGTCCTTGTCTTATGTCCgag422

24、(HIV1)I-1TTAATACGACTCACTATAGGGTAGAAGAGAAGGCTTTCAGCGK55CCTGCTATGTCACTTCCCCTgag190(HIV1)GK56TTATCAGAAGGAGCCACCCCP-1TTCTGTCAATGGCCATTGTTTAACTTTTGGGCCATpol355(HIV1)P-2TAAAGGAAGCAAGCTCTATTAGATACAGGAGCAGCTGASK29ACTAGGGAACCCACTGCTItr105(HIV1)SK30GGTCTGAGGGATCTCTASK31(P)ACCAGAGTCACACAACAGACGGGCACACACTACTP13

25、TGGCGCCCGAACAGGGACLTR168P14TACCCACGCTCTCGCAGSK89AGGAGCTGGTGGGGAACGLTR165(HIV2)SK90GTGCTGGTGAGAGTCTAGCASK91(P)TTGAGCCCTGGGAGGTTCTCTCCAGCACTAGCAGGTAGSK68AGCAGCAGGAAGCACTATGGenv142(HIV1)SK69CCAGACTGTGAGTTGCAACAGSK70(P)ACGGTACAGGCCAGACAATTATTGTCTGGTATAGTCO1ACAATTATTGTCTGGTATAGenv135(HIV1)CO2AGGTATCTTTCC

26、ACAGGCAGCO3(P)TGAGTTGCAACAGATGCTGTTGCGCCTCAATAGCCCTCAGCO71TGTGGAGGGAATTCTTCTACTGTAAenv320(HIV1)CO72TATAGAATTCACTTCTCCAATTGTCCCTCATCO75(P)GAAATATTACAGGGCTGCTATTAACAAGAGATGGTGGTAA （二）PCR擴(kuò)增步驟 1。,基因診斷與性傳播疾?。旱诹?jié) 診斷,第六節(jié) 診斷：,擴(kuò)增條件 當(dāng)選擇的引物影響其特異性和擴(kuò)增效果時(shí)，首先應(yīng)考慮擴(kuò)增的條件是否適宜。這些條件包括退火溫度，PCR循環(huán)數(shù)，反應(yīng)物濃度等。擴(kuò)增的條件通常是14mmol/LMg

27、Cl2，0.51.0mmol/ldNTP,每100l反應(yīng)體積24U Taq DNA聚合酶,2gBSA,10pg靶DNA,擴(kuò)增2530循環(huán),退火溫度為37,引物濃度6g/ml。,基因診斷與性傳播疾?。旱诹?jié) 診斷,第六節(jié) 診斷：,在3755之間變更退火溫度可以找到提高產(chǎn)量和特異性的最佳溫度.盡管每個(gè)實(shí)驗(yàn)室使用的擴(kuò)增條件略有差異,但它們的原理都是相似的。 2.擴(kuò)增的步驟 (1)取10l (1.2g)HIV-DNA樣品。 (2)用10l 1PCR緩沖液(100mmol/LTris-HClpH8.8,500mmol/l KCl，2mmol/L MgCl2,16mmol/LDTT)。,基因診斷與性傳播疾

28、?。旱诹?jié) 診斷,第六節(jié) 診斷：,(3)加入10l ,各1mmol/LdNTP,6.6g/ml引物。 (4)反應(yīng)混合物于93變性處理7min。 (5)冷卻至室溫,加入4UTaqDNA聚合酶,反應(yīng)最終體積為100l。 (6)加入50l礦物油,離心10s。 (7)置70保溫5min。 (8)PCR擴(kuò)增25個(gè)循環(huán),951min,551min,70 1min,最后于70延伸10min。,基因診斷與性傳播疾?。旱诹?jié) 診斷,第六節(jié) 診斷：,PCR檢測出現(xiàn)假陰性的原因有：標(biāo)本中的HIV-DNA量極少，未能有效地?cái)U(kuò)增或擴(kuò)增產(chǎn)物達(dá)不到檢測水平；DNA模板和PCR產(chǎn)物未能完全變性，使得引物不能或較少與DNA片段

29、結(jié)合，從而降低了最終產(chǎn)物的產(chǎn)量。如果臨床標(biāo)本中的HIV基因發(fā)生變異，也會(huì)出現(xiàn)假陰性。PCR假陽性的原因主要有：標(biāo)本的交叉污染；重復(fù)使用不干凈的器具。,基因診斷與性傳播疾?。旱诹?jié) 診斷,第六節(jié) 診斷：,此外還要合理設(shè)置對(duì)照，陰性對(duì)照用無HIV-DNA標(biāo)本的反應(yīng)混合液，陽性對(duì)照用已知的HIV-DNA。 三、擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測和分析 擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測和分析可采用凝膠電泳，限制性內(nèi)切酶圖譜，DNA序列分析及分子雜交等技術(shù)。 （一）凝膠電泳分析 根據(jù)所采用的引物對(duì)之間DNA片段的長度，預(yù)計(jì)PCR產(chǎn)物的分子大小。,基因診斷與性傳播疾?。旱诹?jié) 診斷,第六節(jié) 診斷：,通過與凝膠電泳后的DNA片段相比較，可初步判

30、斷PCR產(chǎn)物的特異性，然后將產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶水解，進(jìn)一步確定擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。 （二）分子雜交分析 分子雜交既是檢測PCR產(chǎn)物特異性的一種較好的方法，也是檢測擴(kuò)增產(chǎn)物的非限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)上堿基突變的有效方法。分子雜交法是根據(jù)標(biāo)記探針與兩條引物鏈之間特異DNA片段的互補(bǔ)性進(jìn)行的。,基因診斷與性傳播疾?。旱诹?jié) 診斷,第六節(jié) 診斷：,結(jié)果陽性說明PCR產(chǎn)物是特異性的?？衫枚喾N等位基因特異性寡核苷酸探針與PCR產(chǎn)物進(jìn)行分子雜交，檢測PCR產(chǎn)物的堿基突變?，F(xiàn)將檢測HIV-DNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物常用的幾種分子雜交技術(shù)分別介紹如下： PCR擴(kuò)增技術(shù)和分子雜交的敏感性。 PCR技術(shù)檢測HIV具有敏感性高

31、，特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)。,基因診斷與性傳播疾?。旱诹?jié) 診斷,第六節(jié) 診斷：,該方法可檢測血液及組織標(biāo)本中微量的HIV及前病毒序列。如對(duì)HIV-1感染H9細(xì)胞的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行液相雜交和EB染色的電泳凝膠來檢測PCR技術(shù)的靈敏性?？蓹z測到0.05感染細(xì)胞的RNA量(相當(dāng)于5個(gè)感染H9細(xì)胞的HIV-1-RNA/5106個(gè)未感染細(xì)胞)。 四、PCR技術(shù)在HIV檢測中的應(yīng)用 PCR可用來追蹤HIV的自然感染史。,基因診斷與性傳播疾?。旱诹?jié) 診斷,第六節(jié) 診斷：,可在其它血清學(xué)和病毒學(xué)標(biāo)志出現(xiàn)前檢測病毒序列，這樣可判定無癥狀而且血清陰性患者潛在的HIV的傳播性；可用來監(jiān)測長潛伏期（47年）病人，以及在抗病毒治

32、療期間病毒的水平；也可用于HIV-1血清陽性母親的嬰兒的HIV檢測。在嬰兒出生后最初的69個(gè)月期間，他們的血液中存在母體的抗體，因此用PCR可判定嬰兒是否真正被HIV感染。,基因診斷與性傳播疾?。旱诹?jié) 診斷,第六節(jié) 診斷：,（一）血清抗體陽性病人HIV序列的檢測 有人從AIDS或ARC病人的外周血單核細(xì)胞培養(yǎng)物，精液細(xì)胞和精液上清制備DNA。然后用PCR法和逆轉(zhuǎn)錄酶測定法分別檢測HIV-1。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與32P標(biāo)記的探針退火之后用BstNI消化。再進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳和自顯影。結(jié)果表明，在逆轉(zhuǎn)錄酶陰性的28個(gè)細(xì)胞系中有9個(gè)以及用逆轉(zhuǎn)錄酶法不能確定的9個(gè)細(xì)胞系中有2個(gè)為陽性。,基因診斷與性

33、傳播疾?。旱诹?jié) 診斷,第六節(jié) 診斷：,這說明過去許多細(xì)胞培養(yǎng)物認(rèn)為是陰性者，實(shí)際上用更敏感的PCR測定時(shí)則為陽性。 從血清陽性的HIV感染者的外周血單核細(xì)胞中可檢測出前病毒序列。通過共培養(yǎng)分離出病毒的血清陽性的同性戀男人血液制備的DNA，用PCR可100%檢出病毒序列；用血清陰性共培養(yǎng)陰性同性戀者的標(biāo)本，經(jīng)PCR擴(kuò)增檢出病毒序列者為64%，血清陰性正常人標(biāo)本PCR檢測也為陰性，表明未出現(xiàn)假陽性結(jié)果。,基因診斷與性傳播疾?。旱诹?jié) 診斷,第六節(jié) 診斷：,由于HIV-1基因組的廣泛的異源性，為提高檢測的陽性率可采用多種引物（如LTR，gag和env基因的引物）。利用PCR法從313份已證實(shí)為抗體

34、陽性的標(biāo)本中檢測出310份HIV陽性（99%）。 (二)血清抗體陰性病人的HIV序列的檢測 由于在感染HIV后到出現(xiàn)免疫反應(yīng)之前有一段滯后期,這個(gè)血清學(xué)陰性的滯后期通常長達(dá)6周至6個(gè)月,而且無抗體產(chǎn)生期能更長些.在此期間受感染者往往檢測不到抗體,因此,血清陰性的人也可能已感染HIV.PCR法在高危人群中檢測到HIV-1比由血清學(xué)轉(zhuǎn)陽確診的時(shí)間可以提高6個(gè)月.對(duì)少數(shù)初次共培養(yǎng)呈陰性的人,甚至可在血清轉(zhuǎn)陽之前2439個(gè)月就能確診為HIV-1感染.對(duì)血清學(xué)試驗(yàn)結(jié)果不能確定者,也可通過PCR作進(jìn)一步分析和確診。,基因診斷與性傳播疾?。旱诹?jié) 診斷,第六節(jié) 診斷：,(三)新生兒HIV序列的檢測 HIV感染的母親其嬰兒由于母體抗體的存在,用抗體檢測法通常為陽性.但實(shí)際上只有20%60%的嬰兒受到H