1、,第五章細(xì)胞融合與體細(xì)胞雜交,雜交,1.通過不同的基因型的個體之間的交配而取得某些雙親基因重新組合的個體的方法。2.兩條單鏈DNA或RNA的堿基配對。雜交優(yōu)勢：性狀均優(yōu)于雜交雙親。一般情況下，通過生殖細(xì)胞相互融合而達(dá)到這一目的過程稱為雜交。較多的是種間、種內(nèi)雜交。由體細(xì)胞相互融合達(dá)到這一結(jié)果的過程稱為體細(xì)胞雜交。,部分野生品種的塊莖、果實雖不能食用，但它們的植株具有較強(qiáng)的抗病蟲害、抗鹽堿性和耐寒能力。因此，用野生馬鈴薯和番茄分別與馬鈴薯、番茄作物雜交，培育出了生存能力較強(qiáng)的雜交系植物。雜交玉米等雜交植物比它們的親本更為健壯，產(chǎn)量更高。,雜交擬南芥（中間）比其親本（左和右）要大,自然（Natur

2、e）2008年11月23日：中美科學(xué)家近日研究發(fā)現(xiàn)雜交植物比其親本生長更大更好的原因：負(fù)責(zé)光合作用和淀粉代謝的基因在白天要更為活躍。,騾子：雄驢和雌馬交配所產(chǎn)的雜種叫驢騾。雌驢和雄馬交配所產(chǎn)的雜種叫馬騾。狼狗：狗與狼的雜交后代。雜交斑馬：由斑馬和馬科動物雜交產(chǎn)物獅虎：獅子和老虎的雜交產(chǎn)物。豹獅：美洲豹與獅子的后代。,不親和性,不親和性：在有性生殖過程中，由于生物個體的細(xì)胞或組織水平上的不協(xié)調(diào)而使受精或接合不能正常進(jìn)行，或是受精后不能產(chǎn)生后代的現(xiàn)象。是雙親個體間基因型的不協(xié)調(diào)或是染色體組非同源性在生殖生理表型上的一種反映。不親和性是穩(wěn)定物種的重要機(jī)理之一。種間不親和性：異種、異屬生物個體之間的生

3、殖不親和現(xiàn)象常由染色體組的不同所造成。一般地說，越是遠(yuǎn)緣則不親和性越高，直到完全不能受精。種內(nèi)不親和性：種內(nèi)個體間的不親和現(xiàn)象往往是受不親和基因所制約而并不是染色體組不同的結(jié)果。,遠(yuǎn)緣雜交,遠(yuǎn)緣雜交：不同種屬之間，或是地理上遠(yuǎn)緣的種內(nèi)亞種之間個體的交配稱為遠(yuǎn)緣雜交。由于種屬間存在著種種隔離機(jī)制，致使遠(yuǎn)緣雜交常表現(xiàn)不親和或獲得的遠(yuǎn)緣雜種表現(xiàn)不育。體細(xì)胞雜交是解決遠(yuǎn)源雜交不親和性的有力手段之一，更好地利用自然界基因資源，培育新物種。,問題：有沒有可能培育出地下結(jié)土豆，地上結(jié)番茄的超級植物？1978年德國科學(xué)家梅歇爾斯將番茄與馬鈴薯進(jìn)行體細(xì)胞雜交育成薯番茄“泡馬豆”（po(tato)-(to)mat

4、o）。馬鈴薯與番茄兩種原生質(zhì)體的融合率竟高達(dá)4050。,本章主要內(nèi)容：1細(xì)胞融合2體細(xì)胞雜交及其在育種中的應(yīng)用關(guān)鍵問題：細(xì)胞融合的原理、方法與關(guān)鍵環(huán)節(jié),一定義與意義,細(xì)胞融合（Cellfusion）是指使用人工方法使兩個或兩個以上的細(xì)胞合并形成一個細(xì)胞的技術(shù)。對于植物也叫“原生質(zhì)體融合”。親本細(xì)胞是體細(xì)胞，也叫“體細(xì)胞雜交（somaticcellhybridization）”。,第一節(jié)細(xì)胞融合,由于它不僅能產(chǎn)生同種細(xì)胞融合，也能產(chǎn)生種間細(xì)胞的融合，因此細(xì)胞融合技術(shù)在創(chuàng)造新細(xì)胞、培育新品種方面意義重大。,二細(xì)胞融合的分類,1.材料：原生質(zhì)體（去除了細(xì)胞壁的裸露的細(xì)胞）、動物細(xì)胞2.從親本來源：（

5、1）同核體（Homokaryon）：基因型相同的細(xì)胞融合而成。（2）異核體（Heterokaryon）：來自不同基因型的融合細(xì)胞。3.從融合效果：（1）對稱融合（Symmetricfusion）：兩個完整細(xì)胞間的融合。（2）不對稱融合（Asymmetricfusion）：利用物理或化學(xué)方法使某親本的核或細(xì)胞質(zhì)失活后再與另外一個完整細(xì)胞進(jìn)行融合。,三發(fā)展歷史,自發(fā)融合現(xiàn)象最初在動物細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)。1858年發(fā)現(xiàn)正常組織、發(fā)炎組織以及腫瘤組織中的多核細(xì)胞情況。動物體內(nèi)的破骨細(xì)胞也是自發(fā)融合形成的多核細(xì)胞。1962年日本學(xué)者發(fā)現(xiàn)一種叫日本血凝性病毒(HVJ)能引起艾氏腹水瘤細(xì)胞融合成多核細(xì)胞的現(xiàn)象。20

6、世紀(jì)70年代初，華裔加籍科學(xué)家高國楠發(fā)現(xiàn)聚乙二醇(PEG)能促使植物原生質(zhì)體融合，開拓了植物細(xì)胞融合的研究。20世紀(jì)80年代，齊默曼（Zimmerman）等建立電場誘導(dǎo)細(xì)胞融合方法。,1、細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)與功能,細(xì)胞膜磷脂分子,擾動出現(xiàn)通道,細(xì)胞橋,四細(xì)胞融合原理,2.主要環(huán)節(jié),（1）親本選擇（單細(xì)胞或原生質(zhì)體制備）（2）兩原生質(zhì)體或細(xì)胞互相靠近，粘附（3）質(zhì)膜融合形成細(xì)胞橋（4）胞質(zhì)滲透（5）細(xì)胞核融合（6）融合細(xì)胞篩選,原生質(zhì)體及其制備,（1）定義：去除細(xì)胞壁后裸露的細(xì)胞稱之為原生質(zhì)體（protoplast）。（2）特點(diǎn)：無細(xì)胞壁，可以方便地進(jìn)行遺傳操作、人工誘變、細(xì)胞器轉(zhuǎn)移、細(xì)胞融合等操作。

7、具有全能性，能再生細(xì)胞壁。,（3）制備與純化,酶解法的建立1960年，英國科金第一次采用酶方法從番茄幼苗大量制備出原生質(zhì)體。使植物細(xì)胞融合技術(shù)得以建立。,植物細(xì)胞的細(xì)胞壁主要成分是纖維素（纖維素微纖絲Cellulosemicrofibrils）、果膠（pectin）、多糖glycan）。果膠酶、纖維素酶等處理植物組織，可以破壞胞間層和去掉細(xì)胞的纖維素外壁，得到游離的裸露原生質(zhì)體。,（4）分離、鑒定與活力分析,分離飄浮法：常用的飄浮劑有蔗糖、Percoll、Ficoll等。離心法：低速離心，收集沉淀。鑒定與活力分析低滲爆破：爆破后是無形的。滲透壓調(diào)節(jié)劑：葡萄糖、甘露醇、山梨醇等。染色法：FDA（

8、二乙酸熒光素）在活細(xì)胞內(nèi)，F(xiàn)DA被酯酶裂解即發(fā)熒光。,關(guān)鍵：細(xì)胞核的融合,沒發(fā)生細(xì)胞核的融合，僅發(fā)生了細(xì)胞質(zhì)的融合，則可能成為嵌合細(xì)胞。含有多個核的異核細(xì)胞合并后形成的單核細(xì)胞稱為合核細(xì)胞。細(xì)胞核的合并發(fā)生在有絲分裂過程中。但是這種有絲分裂只有當(dāng)兩個核的DNA合成基本同步時才能發(fā)生。,五細(xì)胞融合方法,1.生物法病毒誘導(dǎo)細(xì)胞融合：研究最早的細(xì)胞融合誘導(dǎo)方法。主要是由于病毒會與宿主細(xì)胞膜直接融合，同時進(jìn)入兩個細(xì)胞就會打破兩個細(xì)胞膜的隔閡，引發(fā)細(xì)胞質(zhì)的交流，進(jìn)而達(dá)到細(xì)胞融合的目的。原因可能是病毒的磷脂外衣與動物細(xì)胞膜相似，病毒外殼上的某些糖蛋白有促進(jìn)細(xì)胞融合的功能。,仙臺病毒、皰疹病毒、牛痘病毒和副

9、黏液病毒等。仙臺病毒（HAJ）是兩層磷脂組成的外膜包裹著RNA與蛋白質(zhì)的復(fù)合體，因其毒力弱，易被滅活而常采用。缺點(diǎn)：提前大量培養(yǎng)病毒；滅活后才能作為融合劑使用；操作繁瑣；滅活不充分的話，病毒還可能感染操作者與親本細(xì)胞。很少使用病毒誘導(dǎo)法進(jìn)行細(xì)胞融合。,原理與過程,（1）足夠量的病毒顆粒附著在細(xì)胞膜上起搭橋作用，使細(xì)胞聚集在一起。（2）通過病毒與原生質(zhì)體或細(xì)胞膜的作用使兩個細(xì)胞膜間互相滲透，胞質(zhì)互相融合。粘結(jié)部位質(zhì)膜被破壞，不同細(xì)胞間形成通道，細(xì)胞質(zhì)流通并融合（病毒也隨之進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)）。（3）有絲分裂，細(xì)胞核融合，形成雜種細(xì)胞。,2、化學(xué)法,可以采用的化學(xué)誘導(dǎo)劑包括：NaNO3、高pH的高濃度Ca

10、2+離子、聚乙二醇（PEG）、溶菌酶、明膠、抗體、植物凝血素伴刀豆球蛋白A等。細(xì)胞膜電荷平衡被打破。,（1）NaNO3誘導(dǎo)融合,1909年，凱斯特（Kuster）發(fā)現(xiàn)機(jī)械分離的發(fā)生了質(zhì)壁分離的洋蔥表皮細(xì)胞原生質(zhì)體在NaNO3溶液中可以恢復(fù)并伴隨著細(xì)胞融合。1972年，卡爾森（Carlson）利用NaNO3誘導(dǎo)融合了粉蘭煙草和郎氏煙草原生質(zhì)體，培育出世界第一株體細(xì)胞雜種植物。NaNO3的鈉離子可以中和原生質(zhì)體表面負(fù)電荷，引起原生質(zhì)體聚集，促進(jìn)細(xì)胞融合。NaNO3對原生質(zhì)體無損害，但融合效率低，一般小于4%。,（2）高pH的高濃度Ca2+離子誘導(dǎo)融合,1973年，凱勒（Keller）和梅爾切斯（M

11、elchers）發(fā)現(xiàn)采用強(qiáng)堿性（例如pH10.5）的高濃度鈣離子溶液（50mmol/LCaCl22H2O）在37下處理兩個品系的煙草葉肉原生質(zhì)體，很容易促使融合，融合率可以達(dá)到10%。鈣離子中和原生質(zhì)體膜或細(xì)胞膜表面電荷，使彼此緊密接觸，決定質(zhì)膜的穩(wěn)定性和可塑性；高pH能改變質(zhì)膜的表面電荷，利于細(xì)胞融合。,（3）PEG誘導(dǎo),聚乙二醇(Polyethyleneglycol,PEG)是一種多聚化合物，分子式為H(OHCH2-CH2)nOH)。常用的PEG平均分子量在20020,000之間，分子量1,000以下者為液體，1,000以上者為固體。PEG分子具有輕微的負(fù)極性，可以與具有正極性基團(tuán)的水分子

12、、蛋白質(zhì)、碳水化合物形成氫鍵，在相鄰的原生質(zhì)體間起到分子橋的作用，使原生質(zhì)體接觸。當(dāng)PEG分子被洗脫時，膜電荷發(fā)生紊亂而重新分配。此時，一種原生質(zhì)體上帶正電的基團(tuán)可能與另外一個原生質(zhì)體中帶負(fù)電的基團(tuán)相連，導(dǎo)致原生質(zhì)體融合。,（4）高Ca2+和pH誘導(dǎo)PEG結(jié)合誘導(dǎo),在高Ca2+和pH溶液的作用下，將與質(zhì)膜結(jié)合的PEG分子洗脫，將進(jìn)一步加劇電荷平衡失調(diào)，從而提高融合的幾率。因此，PEG結(jié)合高pH的高濃度Ca2+離子誘導(dǎo)融合方法成為一種較常用的細(xì)胞融合方法。優(yōu)點(diǎn)：基于PEG的誘導(dǎo)融合優(yōu)點(diǎn)是融合成本低，勿需特殊設(shè)備；融合子產(chǎn)生的異核率較高；融合過程不受物種限制。缺點(diǎn)：是融合過程繁瑣，PEG可能對細(xì)胞

13、有毒害。,細(xì)胞融合例子1:甘藍(lán)與大白菜的化學(xué)誘導(dǎo)融合,3物理法,電融合誘導(dǎo)法（Electrofusion）：利用電場來誘導(dǎo)細(xì)胞彼此連接成串，再施加瞬間強(qiáng)脈沖促使質(zhì)膜發(fā)生可逆性電擊穿，促進(jìn)細(xì)胞融合的技術(shù)。,原理：在直流電脈沖的刺激下，細(xì)胞膜或原生質(zhì)體質(zhì)膜表面的電荷和氧化還原電位發(fā)生改變，使異種細(xì)胞或原生質(zhì)體粘合并發(fā)生質(zhì)膜瞬間破裂，進(jìn)而連接，直到閉和成完整的膜形成融合體。優(yōu)點(diǎn)：融合率高、重復(fù)性與可控制性強(qiáng)。缺點(diǎn)：可能會造成不可恢復(fù)的細(xì)胞損傷。,棉花細(xì)胞電融合,（1）聚集：在直流電脈沖的誘導(dǎo)下，極化產(chǎn)生偶極子，彼此靠近，定向排列成串球狀。（2）細(xì)胞膜融合：在直流電脈沖的誘導(dǎo)下，原生質(zhì)體膜兩側(cè)產(chǎn)生電勢

14、，正負(fù)電荷相吸，細(xì)胞膜變薄，觸發(fā)膜的穿孔（質(zhì)膜瞬間破裂）。（3）異核體：膜之間形成通道，細(xì)胞質(zhì)等得以交換、融合。（4）融合細(xì)胞：細(xì)胞核融合。,BLS細(xì)胞融合儀,細(xì)胞融合舉例2薄荷的電誘導(dǎo)融合,親本：E33、E47兩個薄荷親本原生質(zhì)體（5-9105），0.7M山梨醇。儀器：Eppendorf電轉(zhuǎn)儀、融合杯（-250微升，-50微升）觀察：DAPI染色：4，6-聯(lián)脒-2-苯基吲哚是一種常用的熒光染料，與DNA的雙鏈緊密結(jié)合。結(jié)合后產(chǎn)生的熒光基團(tuán)的吸收峰是358nm而散射峰是461nm，正好UV（紫外光）的激發(fā)波長正好是356nm。染色標(biāo)記細(xì)胞核的位置。參數(shù)：電壓：1.5-3V，超過2V破裂，選1.

15、5V。脈沖電壓：0-300V。脈沖時間：30-60S，每次增加10S，40S最佳。,融合率達(dá)到16-27%，原生質(zhì)體存活率97%,1篩選的原因與必要性,細(xì)胞融合是一個隨機(jī)的物理過程，經(jīng)融合后細(xì)胞將以多種形式出現(xiàn)，需要通過培養(yǎng)和篩選，除去不需要的細(xì)胞，分離出需要的雜種細(xì)胞，從而解決融合細(xì)胞的選擇問題。問題：A與B融合過程中，你能預(yù)見有哪些形式的細(xì)胞嗎？A-B，A-A，B-B。A-A-A，B-B-B，A-A-B,B-B-A等多聚體。未融合的A，B。,六融合細(xì)胞篩選,2雜種細(xì)胞篩選方法,（1）細(xì)胞形態(tài)大小差異（2）選擇性培養(yǎng)基篩選法：利用原生質(zhì)體對培養(yǎng)基成分要求與反應(yīng)的差異選擇雜種細(xì)胞的方法。例如：

16、利用抗性標(biāo)記、酶缺陷型、激素需求差異等。親本原生質(zhì)體生長要求外源激素，而有的雜種細(xì)胞由于雙親互補(bǔ)作用會產(chǎn)生內(nèi)激素，從而使雜種細(xì)胞能在無激素的培養(yǎng)基上生長。（3）再生后雜種與親本形態(tài)、性質(zhì)差異,異硫氰酸熒光素（FITC）和異硫氰酸羅丹明（RITC）,分別發(fā)出綠色和紅色,熒光染料法,兩個親本原生質(zhì)體在融合前用能發(fā)不同顏色熒光的熒光染料進(jìn)行染色。,細(xì)胞分類器辨別和收集發(fā)兩種熒光的異核體。但儀器價格昂貴，不常用。,細(xì)胞融合例子3：利用抗性標(biāo)記進(jìn)行的融合細(xì)胞篩選,七細(xì)胞融合的應(yīng)用,植物：體細(xì)胞雜交培育新品種動物：單克隆抗體生產(chǎn)（動物細(xì)胞生物制藥講授）,一體細(xì)胞雜交育種的意義1克服有性不親和性，實現(xiàn)遠(yuǎn)源遺傳重組。2問題：與基因工程改造相比有什么優(yōu)點(diǎn)？植物的抗逆性多為多基因控制，因此易于實現(xiàn)多基因控制性狀。,第二