1、1,視網(wǎng)膜中視神經(jīng)細胞研究的概述,摘選論文：1.不同強度光照對母雞離頂蓋通路c-fos基因表達的影響2.c-fos基因表達的相關機制和意義3.視網(wǎng)膜中的自主感光神經(jīng)節(jié)細胞,2,3,一、前人研究,參考文獻：胥佳利師姐等人的關于不同光照條件對母雞離頂蓋通路c-fos基因表達的影響,4,1.目的及意義,c-fos基因是即早基因家族最重要成員之一,普遍存在于中樞神經(jīng)細胞,正常情況下表達水平很低且難以檢測,但在多種刺激因素下可誘導該基因迅速的一過性表達。因此,c-fos基因的表達產(chǎn)物可作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)活動的標志物,并可據(jù)此描繪出一個參與該信息傳遞過程的中樞通路,獲得腦部相應部位功能活動數(shù)據(jù)。注：即早基因

2、家族為細胞受刺激或激活后立即轉錄的基因，一般15-30min，如T細胞激活中參與信號轉導的原癌基因c-fos和轉錄因子基因NF-AT等。,5,鳥類的90%視網(wǎng)膜節(jié)細胞的投射由中腦視頂蓋接受,是非常重要的視覺中樞;從視頂蓋中央灰質(zhì)層經(jīng)丘腦圓核到大腦外紋體組成的離頂蓋通路是鳥類最重要的視覺通路,但目前未見有關家禽腦部重要視覺通路對不同光照刺激引起的c-fos基因表達的報道,雞腦離頂蓋視覺通路對不同強度光刺激的反應有待于進一步研究。,6,光照對母雞產(chǎn)蛋性能有較顯著影響,進一步探討光信息對雞生產(chǎn)性能的影響及作用機理,對養(yǎng)雞業(yè)科學利用光照提高雞的生產(chǎn)性能有重要意義。本研究利用神經(jīng)通路追蹤法的HRP逆行標

3、記技術,由丘腦圓核注入微量30%HRP標記離頂蓋通路,用c-fos法檢測該通路對不同光照刺激的反應,為進一步探究光照對母雞生產(chǎn)性能影響的神經(jīng)調(diào)節(jié)機制打下基礎。,7,簡要介紹,本實驗采用神經(jīng)標記和免疫組化技術相結合的方法,對不同光照對母雞離頂蓋通路c-fos基因表達的影響進行了觀察研究。將120日齡母雞右眼遮光5d后向丘腦圓核引入微量30%HRP,48h后解除遮光并給予不同強度的光照刺激11.5h,暗適應1.5h后灌流固定,取腦制作連續(xù)冰凍切片,用TMB法檢測離頂蓋通路HRP逆行標記神經(jīng)細胞,通過Fos蛋白免疫組化方法檢測c-fos基因在這些部位的表達。,8,結果顯示,母雞離頂蓋通路各核團對不同

4、強度的光刺激有不同的反應,SGC層和ROT核對30lx光照最為敏感,而SP/IPS核對40lx光照反應較為明顯。注：1.HRP，辣根過氧化物酶(horseradishperoxidase，簡稱HRP)2.TMB,3,3,5,5-四甲基聯(lián)苯胺,為一種色原試劑,9,禽類的視覺系統(tǒng)主要分為2個平行通路:離頂蓋通路和離丘腦通路,對于包含雞在內(nèi)的眼球側置的單眼視覺的大多數(shù)鳥類來說,視頂蓋接受90%對側神經(jīng)的投射,是非常重要的視覺中樞。視頂蓋具有明顯的由細胞和纖維相間排列構成的分層構造。,視頂蓋分層構造,10,從其淺表到深部可區(qū)分為分為5層，分別為：視神經(jīng)層(Stratumopticum,SO)、表面灰質(zhì)

5、纖維層(Stratumgriseumetfibrosumsuperficiale,SGFS,又分為A-J層10個亞層)、中央灰質(zhì)層(Stratumgriseumcentrale,SGC)、中央白質(zhì)層(Stratumalbumcentrale,SAC)和室周灰質(zhì)層(Stratumgriseumperiventriculare,SGP)。,11,有研究證明,視頂蓋的視覺傳出神經(jīng)主要從SGC層投到同側和對側丘腦的圓核(Nucleusrotundus,Rt),且SGC不同亞層的細胞投射向圓核的不同部位,圓核投射到同側的外紋體(Ectostriatum)。,12,ECT：外紋體RT：圓核SP：頂蓋前下核

6、IPS：頂蓋前間下核SGC：中央灰質(zhì)層,13,光照對母雞產(chǎn)蛋性能有較顯著影響,探討光信息對雞生產(chǎn)性能的影響及作用機理,對養(yǎng)雞業(yè)科學利用光照提高雞的生產(chǎn)性能有重要意義。,14,本研究利用神經(jīng)通路追蹤法的HRP逆行標記技術,由丘腦圓核注入微量30%HRP標記離頂蓋通路,用c-fos法檢測該通路對不同光照刺激的反應,為進一步探究光照對母雞生產(chǎn)性能影響的神經(jīng)調(diào)節(jié)機制打下基礎。,15,實驗過程,材料與方法1材料1.1動物120日齡健康雌性白來航雞1.2主要試劑HRP，TMB，兔抗鼠C-FOS，SP免疫組化試劑盒,16,1.2方法,17,1.HRP的引入用速眠新將動物麻醉后固定于腦立體定位儀上,向母雞左側

7、丘腦圓核緩慢注入0.5L30%HRP,維持右眼遮光狀態(tài)48h。2.光照刺激試驗組：右眼眼罩移至左眼,右下眼瞼保持睜開狀態(tài),光照刺激11.5h。對照組：維持右眼遮光。3.取材麻醉，灌流，取左腦4.切片冰凍切片,18,5.HRP組織化學顯色TMB呈色顯示HRP標記神經(jīng)細胞,部分中性紅輕度復染以顯示腦部組織構造。6.FOS蛋白免疫組化檢測兔抗鼠C-FOS為第一抗體進行孵育,采用鏈霉卵白素-過氧化物酶連接法(SP法）進行免疫組化染色,DAB顯色,部分用Unna氏多色性美蘭染液輕度復染。陰性對照:用001mol/LPBS(pH73)替代一抗,進行上述試驗。7.結果分析略,19,結果與分析,2.1TMB法

8、顯示的HRP逆行標記神經(jīng)細胞從ROT注入HRP后,經(jīng)TMB呈色反應法顯示的HRP逆行標記神經(jīng)細胞呈圓形、橢圓形或多角形,其陽性細胞主要分布在左側中腦視頂蓋SGC層。其中注射部位與標記細胞的出現(xiàn)位置有一定對應關系。,20,Fos樣免疫反應呈棕黃色顆粒,位于胞核,復染的切片可見這些核團的神經(jīng)細胞胞體主要呈三角形、卵圓形和紡錘形。試驗組左側離頂蓋通路中腦視頂蓋SGC層、SP/IPS核和間腦ROT均見有Fos樣免疫反應陽性神經(jīng)細胞分布,SP/IPS核內(nèi)分布少些。對照組少見或未見陽性神經(jīng)細胞分布,陰性對照切片未見陽性神經(jīng)細胞分布。,21,SGC和SP/IPS核內(nèi)許多Fos樣免疫反應陽性細胞與相鄰切片的H

9、RP標記細胞重疊,表明這些細胞是投射向ROT核的離頂蓋通路細胞。不同強度光照后母雞腦左側離頂蓋通路不同部位Fos樣免疫反應陽性神經(jīng)細胞平均光密度不同。證明不同光照刺激對產(chǎn)生fos蛋白有不同結果,22,我的總結,TMB法顯示的HRP逆行標記神經(jīng)細胞是定位實驗，將神經(jīng)投射區(qū)域找出來Fos樣免疫反應是定量實驗，光照具體通過影響離頂蓋通路中的那部分來影響的，同時測fos蛋白定量分析，來分析不同強度的光照對fos蛋白產(chǎn)生的影響，以決定那種光照對雞影響最大，從而得出影響雞產(chǎn)蛋的最佳光照強度。,23,離頂蓋通路,24,離頂蓋通路,離頂蓋通路是鳥類視覺系統(tǒng)的一條主要途徑,由視網(wǎng)膜頂蓋圓核外紋體等組成。視網(wǎng)膜接

10、受外界視覺后主要沿這條通路直接傳送到端腦,也有些視覺信息通過一些側支回路間接地投射到端腦。頂蓋峽核回路構成離頂蓋通路的一個側支,峽核大細胞部頂蓋的興奮性通路和峽核小細胞部頂蓋的抑制性通路構成了峽核頂蓋之間的正負反饋回路.,25,視網(wǎng)膜-視頂蓋鳥類的視頂蓋是視覺信息的整合和傳遞中樞，鳥類的視頂蓋雖然仍重要,但紋狀體在許多方面已占統(tǒng)治地位，視頂蓋有一對前葉稱視葉。視頂蓋-圓核(Rt)鳥類視頂蓋的投射纖維大多投射到同側的丘腦圓核。主要是從視頂蓋的SGC層的不同亞層有次序的投射到圓核的不同亞區(qū)。圓核在離頂蓋系統(tǒng)中不只是信息傳送結構,也是信息加工的重要場所。,26,中腦分為背側的四迭體和腹側的大腦腳四迭

11、體(Corporaquardrigemina)：又稱頂蓋(Tectum)，由前后2對圓丘組成。前丘(Colliculusrostralis)較大，是光反射的聯(lián)絡站，為灰質(zhì)和白質(zhì)相間的分層結構。后丘(Colliculuscaudalis)是聲反射的聯(lián)絡站，其表面為白質(zhì)、深部為灰質(zhì)的后丘核，,27,丘腦(Thalamus)：占間腦的最大部分，為一對卵圓形的灰質(zhì)團塊，由白質(zhì)髓板分隔為許多不同機能的核群組成。左、右兩丘腦的內(nèi)側部相連，斷面呈圓形，稱丘腦間粘合，其周圍的環(huán)狀裂隙為第3腦室。丘腦是皮質(zhì)下的主要感覺中樞。在丘腦后部的背外側，有外側膝狀體和內(nèi)側膝狀體。外側膝狀體位于前方較外側，接受視束來的纖維

12、，是視覺沖動傳向大腦皮質(zhì)的聯(lián)絡站。,28,人腦可分為5個部分端腦，指大腦兩半球；間腦、中腦、后腦，由延髓和腦橋組成；小腦。,29,30,31,圓核-外紋體(鳥類)圓核到外紋體的投射只是外紋體的局部區(qū)域,但明顯地不直接進入外紋體周圍的圍外紋體(Ep),從圓核投射到外紋體是由至少5個并行的亞集團伴著從圓核的各個亞核投射到外紋體各亞核過程。外紋體雖然沒有直接的端腦外投射,但其核心部(Ec)發(fā)出纖維投射到圍外紋體和新紋體中間外側部(EIL),中繼后再投射到古紋體中間部(Ai)。以上這些結構都屬背側室峙。從Ai又發(fā)出纖維投射到同側視頂蓋深層。這樣就形成了一個回路即:視頂蓋RtEcEpAi視頂蓋,32,外

13、紋體（EctostriatumE）：為鳥類特有。呈三角形，位于背側髓板背側，從后者突入新紋體，含深染細胞。它接受來自圓核、圓下核、三角核、丘腦背外側核、腹側上紋體和感覺主核的纖維，在鴿子還接受發(fā)自中腦和延髓廣泛區(qū)域的纖維；傳出纖維參與組成紋體被蓋束河紋體小腦束，投射至新紋體、背側皮質(zhì)樣區(qū)和丘腦背外側核。外紋體為視覺中樞。,33,離丘腦通路：略可參考：沈端文的爬行類鳥類離頂蓋通路和離丘腦通路的比較唐宗湘,馬殷華的鳥類視覺系統(tǒng)的離頂蓋通路唐宗湘的離頂蓋通路鳥類離頂蓋通路的結構和電生理特性,34,C-fos基因表達的相關機制,參考文獻：盧靜等的C-fos基因表達的相關機制和意義宋毅等的靈杞黃斑顆粒對

14、光損傷大鼠視網(wǎng)膜cfos、caspase3及bclxL表達的影響沈蔚的視網(wǎng)膜損傷與c-fos基因表達,35,C-fos基因表達的相關機制和意義,c-fos基因是一種即刻早期基因,誘導其表達的相關機制主要與NMDA、NO、Ca和GABA等因素有關。c-fos基因的表達產(chǎn)物Fos蛋白與靶基因的特異序列結合,調(diào)節(jié)其轉錄水平發(fā)揮信使作用。,36,c-fos基因概述,近年來發(fā)現(xiàn)一種c-fos基因參與重要腦功能活動的信號轉導和調(diào)控過程,多種刺激因子,如缺氧、光線刺激、機械刺激、疼痛刺激等均可誘導中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)中c-fos基因的表達。細胞受刺激后,胞核內(nèi)的c-fos基因被激活,轉錄形成mRNA,后者

15、進人胞漿,翻譯合成分子量為55kD的核磷蛋白,即Fos蛋白。,37,FoS蛋白經(jīng)磷酸化修飾后返回胞核內(nèi)與另一家族原癌基因c一jun編碼的Jun蛋白形成復合物。Jun與哺乳動物基因轉錄因子AP-1結構、功能相似,故以Jun/AP-1表示。Fos和Jun/AP-1通過各自的a螺旋區(qū)以光價鍵結合形成亮氨酸拉鏈,Fos-Jun/Ap-l復合物與目的基因結合,激活目的基因的轉錄活性。,38,通過上述過程,細胞外刺激信號轉化為調(diào)節(jié)細胞核內(nèi)基因表達的信號,產(chǎn)生細胞的遠期效應,可作為接受一定刺激的神經(jīng)元激活的標志,是目前較為理想的腦功能活動的定位標記。,39,c-fos表達的意義,多種刺激均可誘導c-fos基

16、因表達，F(xiàn)os-Jun/AP-l復合體可能作用于許多靶基因,如前強啡膚基因、神經(jīng)膚-Y基因、神經(jīng)生長因子基因等，因此，F(xiàn)os蛋白不僅是神經(jīng)元刺激后的激活標志，而且介導了其后的一系列反應。目前較為肯定的是:阿片肽基因可能是FoS蛋白的靶基因。,40,在正常神經(jīng)細胞中有低水平的表達。當前的研究已將該基因的表達作為神經(jīng)細胞受損情況和可恢復性的標記物之一。研究證實C-fos基因在光性感光細胞凋亡中有必不可少的作用。光損傷后C-fos的快速誘導要早于損傷的形態(tài)學改變。,41,許多刺激都能誘導c-fos表達,而且隨著刺激的種類、強度、持續(xù)時間的不同,c-fos基因在CNS表達的時程、分布和數(shù)量有差異。,4

17、2,試驗中研究了這個通路傳導，但是通路中的第一部分視網(wǎng)膜細胞是將光信號轉化成電信號，這樣才進行后續(xù)的信號傳導的，怎樣轉化的？,離頂蓋通路,43,眼球壁,內(nèi)容物,外膜,（纖維膜）,角膜,鞏膜,中膜,（血管膜）,虹膜,睫狀體,脈絡膜,內(nèi)膜,（視網(wǎng)膜）,虹膜部,睫狀體部,視部,房水,晶狀體,玻璃體,盲部,一、眼球的外形前、后極，赤道，眼軸，視軸,二、眼球的構造,44,45,（一）眼球壁,1、眼球纖維膜即外膜,（1）角膜（cornea）,（2）鞏膜（sclera)鞏膜靜脈竇,2、眼球血管膜即中膜,（1）脈絡膜(choroid),（2）睫狀體：(ciliarybody)睫狀突、睫狀環(huán)、睫狀肌,（3）虹膜

18、：(iris)瞳孔、瞳孔括約肌、瞳孔開大肌,3、眼球內(nèi)（感覺）膜即視網(wǎng)膜(retina),視部,盲部,睫狀體部,虹膜部,46,睫狀突,睫狀小帶,睫狀肌,虹膜角膜角,鞏膜靜脈竇,瞳孔,虹膜,47,視神經(jīng)盤（視神經(jīng)乳頭）（盲點）,黃斑,中央凹,48,外層,內(nèi)層,49,（二）眼球的內(nèi)容物,包括房水、晶狀體和玻璃體，它們和角膜一樣透明而無血管分布，共同構成了眼的屈光系統(tǒng)。,1、眼球房和房水(aqueousfluid),睫狀體產(chǎn)生,眼球后房,瞳孔,眼球前房,虹膜角膜角,鞏膜靜脈竇,睫前靜脈,眼靜脈,鞏膜靜脈竇,虹膜角膜角,50,作用,屈光,營養(yǎng)角膜、晶狀體,維持眼壓：循環(huán)障礙時眼壓增高，稱青光眼（gla

19、ucoma）,51,2.晶狀體(lens)雙凸透鏡狀，無色透明，有彈性，外面有晶狀體體囊。老年時出現(xiàn)老視；晶狀體渾濁時稱白內(nèi)障（cataract）。,52,vs,53,3、玻璃體(vitreousbody),為膠狀物質(zhì)，表面為玻璃體囊，具有屈光和支撐視網(wǎng)膜的作用。支持作用減弱時，造成視網(wǎng)膜剝離。,54,眼底重要解剖結構：,視盤無視覺（NF）黃斑中心凹，視覺敏銳區(qū)(錐c)血管視網(wǎng)膜,1,55,56,色素層(外1)：色素上皮層神經(jīng)層(內(nèi)9)：錐、桿細胞層外界膜外顆粒層外網(wǎng)狀層內(nèi)顆粒層內(nèi)網(wǎng)狀層神經(jīng)節(jié)細胞層神經(jīng)纖維層內(nèi)界膜,I,II,III,57,視網(wǎng)膜的功能：感光錐c明亮光、形、色桿c暗光傳導(錐、

20、桿c；雙極c；神經(jīng)節(jié)細胞)光IIIIII,光神經(jīng)沖動,視中樞,58,視網(wǎng)膜建模的研究進展,視覺是一個非常復雜的神經(jīng)生理活動過程。光信息從13億個光感受細胞輸入,通過復雜的處理由100多萬個神經(jīng)節(jié)細胞產(chǎn)生相應神經(jīng)沖動,經(jīng)視神經(jīng)、視交叉、視束傳到外側膝狀體,再經(jīng)視中樞的復雜處理,最終形成視覺。,59,視網(wǎng)膜的結構非常復雜。根據(jù)其細胞的功能的不同可以分為5類,即光感受細胞、水平細胞、雙極細胞、無長突細胞和神經(jīng)節(jié)細胞。神經(jīng)節(jié)細胞的軸突穿過眼球組成了視神經(jīng)。而光感受細胞還可被分為視桿細胞和視錐細胞。,60,視網(wǎng)膜上視覺最敏銳的區(qū)域叫黃斑區(qū),其中央有一直徑1.5mm的中央凹。在中心凹處主要集中的是視錐細胞

21、,在中央凹以外視桿細胞逐漸增多。視網(wǎng)膜的刺激傳遞是從光感受細胞到雙極細胞最后傳到神經(jīng)節(jié)細胞產(chǎn)生放電。,61,外層,內(nèi)層,62,水平細胞和無長突細胞則構成視網(wǎng)膜傳遞的橫向結構。光感受細胞的主要功能是接受光刺激。視錐細胞主要對強光敏感,而視桿細胞主要對弱光敏感。光感受細胞的電反應強度與細胞膜色素分子吸收的光子個數(shù)有關。,63,水平細胞位于光感受細胞下方,通過化學傳遞來接受光感受細胞的信號以及和其相鄰層的電信號。水平細胞的作用相當于一個低通濾波器,為雙極細胞提供一低頻信號。雙極細胞可以接受或抑制水平細胞和光感受細胞傳來的信號,雙極細胞根據(jù)其感受野的中心極性可以分為on和off兩類。,64,無長突細胞

22、和水平細胞一樣都是橫向結構的細胞。無長突細胞接受雙極細胞及其他無長突細胞的信號,它是首先產(chǎn)生神經(jīng)沖動的細胞。它的反應與所給刺激的特性有關,并且各個細胞體都有所差異。無長突細胞對運動較為敏感。神經(jīng)節(jié)細胞分為瞬時和持續(xù)兩類,它主要接受雙極細胞和無長突細胞的信號然后產(chǎn)生神經(jīng)沖動,通過軸突傳遞到視神經(jīng)。,65,對于某些有視覺障礙的人(如老年黃斑變性、色素性視網(wǎng)膜炎)來說,他們的大部分視網(wǎng)膜細胞和視神經(jīng)細胞都保存完好。所以可以嘗試在視網(wǎng)膜上設計視覺假體,通過將視覺信息轉換為電刺激來刺激視網(wǎng)膜上未受損的部分來部分重建視覺。,66,視網(wǎng)膜建?？煞譃椋阂暰W(wǎng)膜上(epiretinal)視覺假體、視網(wǎng)膜下(sub

23、retinal)視覺假體和視神經(jīng)(opticnerve)視覺假體的設計服務。,67,視網(wǎng)膜上視覺假體需要從外界如攝像頭獲取圖像,通過處理后轉換為電刺激傳給植于視網(wǎng)膜最上層的微電極陣列來刺激神經(jīng)節(jié)細胞。視網(wǎng)膜下視覺假體通過光電二極管把光轉換為電流來刺激色素上皮層與雙極細胞之間的區(qū)域。視神經(jīng)視覺假體,68,基于算法的模型基于算法的模型是應用人工神經(jīng)網(wǎng)絡、實驗數(shù)據(jù)及數(shù)學算法等通過調(diào)節(jié)模型中的參數(shù)達到最優(yōu)效果來模擬視網(wǎng)膜功能。用硬件實現(xiàn)的模型用硬件實現(xiàn)的模型主要是用晶體管、電阻、電極等硬件來模擬視網(wǎng)膜的各層結構以實現(xiàn)視覺信息處理功能。目前已有不少研究小組設計出了成型的芯片。雖然各個小組所設計的芯片的像

24、素不同,尺寸也不同,分層和算法也不完全相同,但是都應用了視網(wǎng)膜的濾波等特性以實現(xiàn)對視網(wǎng)膜的模擬。,69,不論是硬件模型還是算法模型基本上都由3層結構組成,即輸入層、信號處理層和視覺輸出層。所以說視網(wǎng)膜模型應該包括對應于輸入層的傳感器、對應于信號處理層的編碼器及對應于視覺輸出層的轉換器。,70,模型中的電刺激應該由脈沖寬度、脈沖頻率、脈沖形狀等多個參數(shù)來控制。視網(wǎng)膜視覺假體的設計需要考慮到很多方面,諸如圖像的編碼、信號的壓縮和傳遞、參數(shù)的設置、訓練學習過程等。隨著我們對神經(jīng)刺激和視網(wǎng)膜結構了解的不斷加深以及生物兼容性材料研究的進展,相信在不久的將來可以設計出較為有效的模型來實現(xiàn)視覺修,71,視網(wǎng)

25、膜中的自主感光神經(jīng)節(jié)細胞,在20世紀末，人們發(fā)現(xiàn)視網(wǎng)膜中少數(shù)神經(jīng)節(jié)細胞可以表達一種感光色素黑視素(OPN4)，因此具備自主對光產(chǎn)生反應的能力，這類細胞被稱為自主感光視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞(ipRGCs)或者含黑視素神經(jīng)節(jié)細胞(mcRGCs)。與其他類型的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞不同，ipRGCs除了能夠接受來源于光感受器的信號輸入，還能通過自身表達的感光色素直接對光產(chǎn)生反應。,72,在視覺系統(tǒng)當中，ipRGCs主要參與了非成像視覺的形成，如光線引起的晝夜節(jié)律調(diào)控和瞳孔收縮反應。少數(shù)ipRGCs的軸突可以投射到外膝體等視覺相關腦區(qū)，從而參與調(diào)控成像視覺。近年來，得益于分子生物學和遺傳學的快速發(fā)展，出現(xiàn)了許多與

26、ipRGCs相關的轉基因動物模型和標記ipRGCs細胞的方法，ipRGCs的分類和功能研究也因此取得了很多重要進展，許多關鍵問題已經(jīng)或正在得到解決。,73,例如，在ipRGCs中，樹突分布在撤光亞層的細胞為何具有給光輸入？在光感受器缺失、或者光感受器和下級神經(jīng)元沒有功能連接的情況下，晝夜節(jié)律和瞳孔反射的相關回路是否可以獨立工作？本文將回顧ipRGCs的發(fā)現(xiàn)過程，對其分類、生理和功能進行概述。,74,視網(wǎng)膜中少數(shù)神經(jīng)節(jié)細胞能夠合成感光蛋白黑視素（melanopsin），因此具備了自主感光的能力，被稱為自主感光神經(jīng)節(jié)細胞（ipRGCs）。ipRGCs可根據(jù)樹突形態(tài)和分層位置的差異分為五個不同的亞型

27、，其軸突主要投射到視交叉上核、橄欖頂蓋前核等腦區(qū)，參與調(diào)控晝夜節(jié)律、瞳孔對光反射等非成像視覺功能。,75,此外，部分ipRGCs的軸突投射到外側膝狀體和上丘，可能在調(diào)節(jié)成像視覺中發(fā)揮功能。下面將介紹一下ipRGCs的發(fā)現(xiàn)過程和最新研究進展。,76,ipRGCs的發(fā)現(xiàn),根據(jù)經(jīng)典的哺乳動物視覺理論，環(huán)境中的光線到達視網(wǎng)膜后，首先會激活光感受器中的視蛋白(opsin，一種G蛋白偶聯(lián)受體)，經(jīng)一系列細胞內(nèi)信號轉導，造成光感受器的超極化，其末端神經(jīng)遞質(zhì)釋放減少。遞質(zhì)釋放變化所包含的信息，通過光感受器的下級神經(jīng)元雙極細胞，傳遞到神經(jīng)節(jié)細胞，在此產(chǎn)生動作電位，將信號傳遞到更加高級的視覺中樞。,77,視網(wǎng)膜中

28、除了光感受器，其它類型的神經(jīng)元并不表達能夠感光的視蛋白，所以不具備直接對光線產(chǎn)生反應的能力，其光反應的產(chǎn)生都需要來自光感受器的信號輸入。但是，Keeler1927年通過在視網(wǎng)膜變性小鼠上進行的實驗發(fā)現(xiàn)，成年的視網(wǎng)膜變性小鼠光感受器完全缺失，但是仍然能夠在接受光刺激時產(chǎn)生瞳孔收縮反應盡管瞳孔收縮的速度比正常小鼠慢，幅度也有所減小。,78,上世紀90年代，F(xiàn)oster等人發(fā)現(xiàn)照明變化能夠影響視網(wǎng)膜變性小鼠的晝夜節(jié)律性等生理反應；同時，他們發(fā)現(xiàn)缺失光感受器的視網(wǎng)膜在較短波長的光照射下，11-cis-retinal仍然可以在感光色素介導下被轉化為反式，說明除光感受器以外的其它類型視網(wǎng)膜細胞中表達了某些

29、類型的感光色素。,79,這些實驗都顯示，在缺失光感受器的情況下，小鼠依然能夠感知環(huán)境中的光照信息，提示在視網(wǎng)膜中除了光感受器之外還存在其他類型的感光神經(jīng)元。由于實驗技術和條件的限制，光感受器之外的感光神經(jīng)元一直沒有被鑒定出來，所以上述實驗結果很大程度上還是被歸因于視網(wǎng)膜變性小鼠中可能殘留了少量光感受器。,80,1998年，Provencio實驗室在非洲爪蟾的表皮感光載黑素細胞中發(fā)現(xiàn)了一類新的感光色素，稱其為黑視素，利用原位雜交的方法，他們發(fā)現(xiàn)黑視素的mRNA在非洲爪蟾視網(wǎng)膜的內(nèi)核層細胞中有表達。2000年，Provencio實驗室再次利用原位雜交的方法，發(fā)現(xiàn)小鼠和靈長類動物的視網(wǎng)膜中存在黑視素

30、，而且表達在內(nèi)核層和神經(jīng)節(jié)細胞層的非光感受器細胞中。,81,Gooley等人將大鼠視交叉上核逆向標記與原位雜交技術結合，發(fā)現(xiàn)黑視素主要表達在一類投射到SCN的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞中。2002年，研究人員利用轉基因小鼠和抗體染色的方法，發(fā)現(xiàn)在嚙齒類動物的視網(wǎng)膜中，少數(shù)神經(jīng)節(jié)細胞表達黑視素；在使用鎘離子阻斷突觸傳遞(即來自光感受器的信號輸入)、甚至脫離視網(wǎng)膜后，這類神經(jīng)節(jié)細胞依然能夠保持對光反應的能力，因此稱這類細胞為自主感光視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞,82,ipRGCs表達感光色素黑視素，所以能夠不依賴于光感受器而直接對光反應。作為視蛋白家族(opsins)的成員，黑視素也是一種G蛋白偶聯(lián)受體，依賴11-ci

31、s-retinal吸收光子，但是其具體的感光通路目前并不清楚。在哺乳動物視網(wǎng)膜中，已發(fā)現(xiàn)黑視素有兩種異構體，可能具有不同的生理性質(zhì),83,已有的實驗指出，在培養(yǎng)的哺乳動物細胞系中(轉染了TRPC3通道的HEK293細胞)表達黑視素，并在培養(yǎng)基中加入11-cis-retinal，可以有效地誘導細胞在光照條件下產(chǎn)生去極化反應。與光感受器不同，ipRGCs不能直接從視網(wǎng)膜色素上皮層獲得11-cis-retinal（11-順式-視黃醛）。在不持續(xù)添加11-cis-retinal的情況下，ipRGCs可以長時間保持對光反應的能力，在體外培養(yǎng)的細胞系中也是如此。,84,一個較為合理的假說是，黑視素可視素蛋

32、白，只是轉化成all-trans-retinal（全反視黃醛）；當其他波長的光子照射后，自動恢復原來的狀態(tài)。但是，這個假說只在頭索動物(文昌魚)的黑視素同源蛋白中得到證實，在哺乳動物方面仍然缺少直接證據(jù)，需要更加有說服力的生理學或結構生物學結果來證明。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，利用攜帶黑視素的病毒轉染其它類型的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞，可以有效地使其產(chǎn)生光反應，為治療視網(wǎng)膜色素變性等疾病提供了一種可能的方法,85,ipRGCs的分類、樹突分層和生理特性,ipRGCs的分類、樹突分層和生理特性：，小鼠的ipRGCs可以分為五個不同的亞型，分別以M1M5表示，目前常用的標記ipRGCs的小鼠模型包括：標記M1亞型

33、ipRGCs的Opn4:tau-LacZ或者Opn4:tdTamato；標記M1、M2兩個亞型的Opn4-EGFP；標記全部五個亞型且通過Cre來誘導報告基因表達的轉基因小鼠Opn4Cre/+:Z/AP。,86,ipRGCs的投射和功能,利用原位雜交、免疫組化染色、轉基因小鼠表達報告基因和逆向標記等方法，ipRGCs軸突投射的靶部位也逐漸被揭示。早期發(fā)現(xiàn)的一類轉基因小鼠模型中(Opn4:tau-LacZ)，只有M1亞型的ipRGCs表達LacZ報告基因。通過對LacZ軸突終末在不同腦區(qū)的分布進行分析，發(fā)現(xiàn)投射比較密集的區(qū)域包括視交叉上核(SCN)、膝狀體間小葉(IGL)及橄欖頂蓋前核(OPN)

34、.前兩者主要負責晝夜節(jié)律的調(diào)節(jié)，后者是瞳孔反射回路的重要部分。,87,注：Opn4:tau-LacZ-黑視素：Tau蛋白-乳糖Z微管系統(tǒng)是神經(jīng)細胞骨架成分，可參與多種細胞功能。微管由微管蛋白及微管相關蛋白組成，Tau蛋白是含量最高的微管相關蛋白,88,Opn4:tau-LacZ小鼠只有M1細胞表達LacZ，因此在該小鼠的不同腦區(qū)進行逆標，逆標到的M2亞型ipRGCs的胞體能夠被抗體染色，但不表達LacZ，從而可以獲得M2亞型ipRGCs的投射區(qū)域。研究發(fā)現(xiàn)：M1是投射到SCN的主要亞型，而M2則是投射到OPN的主要亞型，提示M1在晝夜節(jié)律調(diào)控中、而M2在瞳孔反射中發(fā)揮更重要的作用。由于M3M5

35、這些亞型的ipRGCs缺少各自獨立的標記方法，目前的研究還沒有對其投射的差異做出細致分析。,89,光線照射ipRGCs產(chǎn)生光反應后，其軸突末梢可以釋放包括谷氨酸和垂體腺苷酸環(huán)化酶激活肽(PACAP)在內(nèi)的神經(jīng)遞質(zhì)，從而調(diào)節(jié)晝夜節(jié)律等相關的功能。在正常情況下，可以利用單次光照改變暗養(yǎng)后的內(nèi)源節(jié)律(約23h)，使其產(chǎn)生相位后；在缺失PACAP的情況下，則這種效應消失。此外，PACAP的受體在視網(wǎng)膜中也有表達，但是ipRGCs是否可以通過旁分泌的方式激活這些受體，以及其生理功能，目前還沒有明確的解釋，可能和神經(jīng)元的保護相關。,90,缺少了光感受器的小鼠，由于ipRGCs能夠直接對光反應，因此小鼠依然

36、能夠產(chǎn)生晝夜節(jié)律調(diào)節(jié)和瞳孔反射。但是，如果利用遺傳學方法殺傷ipRGCs，光感受器不受影響，成像視覺不受影響，但小鼠的晝夜節(jié)律調(diào)節(jié)和瞳孔反射幾乎完全消失，證明來自光感受器的信號在調(diào)控非成像視覺時，也必須通過ipRGCs。,91,在胚胎期大鼠視網(wǎng)膜上就能檢測到黑視素的表達，其投射的腦區(qū)SCN中，神經(jīng)元活動的標志物c-FOS在光照后表達增加。如果敲除黑視素基因，c-FOS在SCN中的表達不再隨光照變化。實驗證明了出生時，ipRGCs已經(jīng)具有感光功能且投射回路已經(jīng)建立。這種黑視素蛋白的早表達、ipRGCs感光能力的產(chǎn)生和對相關腦區(qū)的有效輸入，對新生動物形成晝夜節(jié)律具有重要意義。,92,研究人員還發(fā)現(xiàn)

37、，新生小鼠已經(jīng)具備了對光照的回避反應，而敲除了黑視素的新生小鼠失去光照回避反應，證明ipRGCs在光感受器出觀感光功能前的新生小鼠具有重要的生物學意義。,93,ipRGCs也能夠參與成像視覺的形成。在靈長類動物中，ipRGCs可以投射到成像視覺的相關腦區(qū)，如dLGN和SC；并且，ipRGCs的感受野具有對中心-周邊顏色拮抗的特性，可能參與了顏色視覺的形成。利用水迷宮等行為學方法檢驗缺失光感受器的小鼠，發(fā)現(xiàn)其依然具有區(qū)分不同模式圖像的視覺能力(patternvision)。如果對這種缺失光感受器的小鼠呈現(xiàn)模式視覺的刺激，視皮層等成像視覺相關的腦區(qū)中會檢測到c-FOS表達的顯著增加。,94,如果同

38、時缺少光感受器和黑視素，小鼠的模式視覺能力就會完全消失；同時，視皮層中c-FOS的表達也不再隨模式視覺相關的刺激增加。ipRGCs介導了不依賴于光感受器的模式視覺，這與ipRGCs能夠投射到dLGN和上丘等成像視覺相關腦區(qū)的結果相一致。,95,總結,從黑視素的發(fā)現(xiàn)開始，人們對ipRGCs的研究取得了迅猛進展。黑視素感光機制的研究，揭示了哺乳動物中可能存在著不依賴于11-cis-retinal循環(huán)的感光能力。與channelrhodopsins等光控離子通道不同，黑視素屬于G蛋白偶聯(lián)受體，其調(diào)控通道開放的途徑和自身表達水平的調(diào)節(jié)機制仍然有待闡明。,96,利用分子生物學、遺傳學提供的實驗技術，ipRGCs可以被有效地標記出來。不同亞型的ipRGCs具有獨特的形態(tài)特征和投射模式，以及不同的生理反應特性。這些發(fā)現(xiàn)將更好地揭示晝夜節(jié)律調(diào)節(jié)和瞳孔反應的神經(jīng)調(diào)控過程，并進一步探明整個回路的功能。同時，ipRGCs在成像視覺中的作用，也逐漸被認識到。,97,利用遺傳學標記并調(diào)控ipRGCs的活動，可以對視覺信息的傳遞及處理過程有更多理解。作為一類重要的神經(jīng)