1、Lowrys法（Folin-酚試劑法）測(cè)定蛋白質(zhì)含量,Determination of protein content by Lowrys method,怎樣測(cè)定血清中蛋白質(zhì)的含量,蛋白質(zhì)含量測(cè)定的常用方法比較,選擇測(cè)定方法時(shí)應(yīng)考慮,1、實(shí)驗(yàn)對(duì)測(cè)定所要求的靈敏度和精確度； 2、蛋白質(zhì)的性質(zhì)； 3、溶液中存在的干擾物質(zhì)； 4、測(cè)定所花費(fèi)的時(shí)間等。,Lowrys法（Folin-酚試劑法）測(cè)定蛋白質(zhì)含量,Determination of protein content by Lowrys method,實(shí)驗(yàn)?zāi)康?1、掌握Folin-酚試劑法測(cè)定蛋白質(zhì)含量的原理 及其實(shí)驗(yàn)操作技術(shù)。 2、掌握制作標(biāo)準(zhǔn)曲

2、線的要領(lǐng)和通過標(biāo)準(zhǔn)曲線 求樣品溶液中待測(cè)定物質(zhì)含量的方法 。,原理,1921年，F(xiàn)olin 首創(chuàng)，利用蛋白質(zhì)分子中酪氨酸 和色氨酸殘基（酚基）還原酚試劑（磷鎢酸-磷鉬酸）起藍(lán)色反應(yīng)。 1951年，Lowry對(duì)此法進(jìn)行了改進(jìn)，先于標(biāo)本中加堿性銅試劑，再與酚試劑反應(yīng)，提高了靈敏度。,原理,第一步：雙縮脲反應(yīng) 在堿性溶液中,雙縮脲(H2NOCNHCONH2)能與Cu2+作用,形成紫色或紫紅色的絡(luò)合物,這個(gè)反應(yīng)叫做雙縮脲反應(yīng)。由于蛋白質(zhì)分子中含有與雙縮脲結(jié)構(gòu)相似的多個(gè)肽鍵, 因此有雙縮脲反應(yīng)。 即在堿性溶液中，蛋白質(zhì)分子中的肽鍵與堿性銅試劑中的Cu2+作用生成紫紅色的蛋白質(zhì)- Cu2+復(fù)合物。,原理,

3、第二步：Folin-酚顯色反應(yīng) Folin-酚試劑在堿性條件下極不穩(wěn)定，其磷鉬酸鹽-磷鎢酸鹽易被酚類化合物還原而呈藍(lán)色反應(yīng)(鉬藍(lán)和鎢藍(lán)的混合物)。由于蛋白質(zhì)中含有帶酚羥基的酪氨酸( Tyr ) ，故有此顯色反應(yīng)。 即蛋白質(zhì)- Cu2+復(fù)合物中所含的酪氨酸或色氨酸殘基還原酚試劑中的磷鉬酸和磷鎢酸，生成藍(lán)色的化合物。,在一定濃度范圍內(nèi)，藍(lán)色的深淺度與蛋白質(zhì)濃度呈線性關(guān)系，故與同樣處理的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液比色即可求出蛋白質(zhì)的含量。 即根據(jù)預(yù)先繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線求出未知樣品中蛋白質(zhì)的含量。,原理,樣品,健康人血清 正常人血清蛋白質(zhì)含量：6080g/L,試劑,1、牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)液（200g/ml） 2、堿性硫酸

4、銅溶液（當(dāng)日有效） 3、Folin-酚試劑,儀器和器材,1、V-1100分光光度計(jì) 2、恒溫水浴箱 3、試管6支、試管架 4、加樣槍、加樣槍架 5、坐標(biāo)紙,操作,各管混勻，室溫放置10min。 向各管內(nèi)加入Folin-酚試劑0.20mL, 2s內(nèi)迅速混勻！ 40放置10min。 冷卻至室溫后，以500nm波長比色，用1號(hào)管作空白，讀取各管吸光度。,注意事項(xiàng),Folin-酚試劑在酸性條件下較穩(wěn)定，而堿性硫酸銅試劑是在堿性條件下與蛋白質(zhì)作用生成堿性的銅-蛋白質(zhì)溶液。 故當(dāng)Folin-酚試劑加到堿性的銅-蛋白質(zhì)溶液中后，必須立即混勻（加一管混勻一管），使還原反應(yīng)發(fā)生在磷鉬酸-磷鎢酸試劑被破壞之前。,

5、注意事項(xiàng),因Lowry反應(yīng)的顯色隨時(shí)間不斷加深，因此各項(xiàng)操作必須精確控制時(shí)間。 即第1支試管加入2.0mL堿性硫酸銅試劑后，開始計(jì)時(shí)，1分鐘后，第2支試管加入2.0mL堿性硫酸銅試劑，2分鐘后加第3支試管，以此類推。 全部試管加完堿性硫酸銅試劑后若已到10分鐘，則第1支試管可立即加入0.20mL Folin-酚試劑，1分鐘后第2支試管加入0.20mL Folin-酚試劑，2分鐘后加第3支試管，以此類推。 水浴10min，冷卻后，每一分鐘測(cè)一管。,蛋白樣品,堿性銅試劑,混勻， 放10min,加酚試劑,2s混勻,水浴10min,放至室溫,比色,數(shù)據(jù)處理,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線步驟,1、選擇合適的坐標(biāo)紙 2、

6、畫坐標(biāo)軸 3、根據(jù)測(cè)得的數(shù)據(jù)描點(diǎn) 4、連線 5、求實(shí)驗(yàn)結(jié)果,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,以A500值為縱坐標(biāo)，牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)液濃度為橫坐標(biāo)，用鉛筆繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,根據(jù)所描點(diǎn)的分布情況，作直線或光滑連續(xù)的曲線，該線表示實(shí)驗(yàn)點(diǎn)的平均變動(dòng)情況，因此該線不需全部通過各點(diǎn)，但應(yīng)盡量使未經(jīng)過線上的實(shí)驗(yàn)點(diǎn)均勻分布在曲線或直線兩側(cè)。,計(jì)算,根據(jù)未知樣品溶液的吸光度值，在繪制好的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖中查出樣品溶液中的蛋白質(zhì)含量。 然后乘以稀釋倍數(shù)（300），得出每毫升未稀釋血清含蛋白質(zhì)的微克數(shù)，即每毫升血清中蛋白質(zhì)的微克數(shù)(g/ml)。 血清蛋白濃度(g/ml)=樣品蛋白質(zhì)濃度2300,本方法的特點(diǎn)：,優(yōu)點(diǎn)：1.靈敏度高，比雙縮脲法靈敏約100倍。 2.操作簡單，不需特殊儀器設(shè)備。 缺點(diǎn)：1.費(fèi)時(shí)間較長，要精確控制操作時(shí)間 2.標(biāo)準(zhǔn)曲線也不是嚴(yán)格的直線形式 3.專一性較差，干擾物質(zhì)較多。,復(fù)習(xí)思考題,1、試述Folin-酚試劑法的優(yōu)點(diǎn)？ 2、應(yīng)用本方法有哪些干擾作用？為什么？應(yīng)如何注意？ 請(qǐng)將答案附在實(shí)驗(yàn)報(bào)告上！,V-1100分光光度計(jì)操作步驟,開機(jī)，預(yù)熱30分鐘 轉(zhuǎn)動(dòng)波長旋鈕，調(diào)所需波長。按 鍵切換到T檔 將黑體放入光路中，合上蓋，按 鍵校零 開蓋，將參比液按空白液、標(biāo)準(zhǔn)液、待測(cè)液順序放入比色杯架上，合上蓋，按 鍵切換到A檔 拉動(dòng)比色架拉桿，將空白液放入光路中，合上蓋