1、第十一章 基于片斷的藥物設(shè)計(jì) Fragment-based drug discovery FBDD,魏丹丹,學(xué)習(xí)要求： 掌握：基于片段藥物設(shè)計(jì)的基本思路；基于片段藥物設(shè)計(jì)的優(yōu) 點(diǎn)；片段篩選的主要檢測(cè)技術(shù)；片段優(yōu)化的常用方法。 熟悉：磁共振檢測(cè)技術(shù)的分類和原理；SAR-by-NMR的原理 和應(yīng)用；Tether和二次Tether技術(shù)的原理；結(jié)晶篩選 的研究流程。 了解：基于片段藥物設(shè)計(jì)的發(fā)展歷史；基于片段藥物設(shè)計(jì)與高 通量篩選的比較；基于片段藥物設(shè)計(jì)的成功實(shí)例。,From Leach AR, Hann MM, Burrows JN et al. Fragment screening: an int

2、roduction. Mol. BioSyst., 2006, 2: 429-446,對(duì)靶標(biāo)認(rèn)識(shí)水平不同的藥物分子設(shè)計(jì),苗頭和先導(dǎo)物的發(fā)現(xiàn)途徑,天然活性物質(zhì) 基于結(jié)構(gòu)的分子設(shè)計(jì) 隨機(jī)篩選 虛擬篩選,問題的出現(xiàn),以靶標(biāo)為核心的新藥研發(fā)，切入點(diǎn)是用體外方法評(píng)價(jià)活性。 苗頭化合物(hit)多以活性強(qiáng)度為衡量標(biāo)準(zhǔn)。 hit-to-lead和先導(dǎo)物優(yōu)化，大都加入或變換基團(tuán)，以增加與靶標(biāo)結(jié)合的機(jī)會(huì)和強(qiáng)度。,一般“不敢”去除基團(tuán)或片斷，以免丟失參與結(jié)合的原子或基團(tuán)(即藥效團(tuán))。 高通量篩選的化合物過于“成熟”，留給后續(xù)的結(jié)構(gòu)變換的余地小，導(dǎo)致投入-產(chǎn)出比低。,基于片段分子設(shè)計(jì)的優(yōu)點(diǎn)(高通量篩選的不足),發(fā)現(xiàn)

3、苗頭的概率很低。理論計(jì)算，含有30個(gè)C、N、O、S原子的化合物有1060種，而高通量篩選的化合物數(shù)即使以百萬(wàn)計(jì)(106)，篩選也只占很少部分。 化合物分子量比較大，親脂性強(qiáng)，優(yōu)化成藥的難度大。組合化學(xué)庫(kù)尤甚。,1.可以探索更為廣闊的空間,片段分子，符合三規(guī)則的片段數(shù)目的分子量160的含上述原子化合物數(shù)為107，篩選的分子（片段庫(kù)）為103104 個(gè)。發(fā)現(xiàn)苗頭的幾率高。 公司之間的化合物的結(jié)構(gòu)類型相似，篩選靶標(biāo)相同，易有知識(shí)產(chǎn)權(quán)之糾葛。,2.命中率高 片段分子具有體積小和復(fù)雜程度低的特征，理論上更加容易與藥靶結(jié)合，加上片段篩選技術(shù)的靈敏度高，因此具有比較高的篩選命中率。,基于片段篩選的命中率是高

4、通量篩選的10-1000倍。從篩選的質(zhì)量上看，高通量篩選所得到的活性化合物雖然可能和藥靶具有比較高的親和力，但是當(dāng)具體到分子中各個(gè)子結(jié)構(gòu)，他們很難與對(duì)應(yīng)的藥靶活性位點(diǎn)區(qū)域有最佳的結(jié)合。 分子量比較低的片段分子相對(duì)比較容易能和藥靶局部區(qū)域形成較好的匹配。,0,100,200,300,400,500,600,700,1 mM,100 M 1M 10 nM 1 nM,藥物,HTS苗頭物,藥物候選物,片斷化合物,藥效強(qiáng)度,相對(duì)分子質(zhì)量,Rees et al., Nature Rev. Drug Disc. 2004,上市的口服藥物平均分子量為340。 處于 I 期臨床試驗(yàn)的候選藥物，分子 量小于400

5、的成功率為50%，分子量加大，成功率降低。,Fragment Rule of 3 MW 300 # H-Bond Donor = 3 # H-Bond Acceptors = 3 cLogP = 3 # Rotatable bonds = 3,3.發(fā)現(xiàn)新藥的可行性高,高通量篩選所得化合物的分子量范圍一般在250-600之間，高通量篩選活性一般在微摩爾級(jí)，而藥物分子的分子量范圍一般在300-500之間，活性一般為一至數(shù)十個(gè)鈉摩爾。如果將高通量篩選所得活性化合物優(yōu)化為候選新藥，既要在活性方面有較大幅度的提高，而分子量又不能有過大的跳躍，難度顯然比較大。,而片段的分子量范圍在120-250，活性一般

6、在鈉摩爾至微摩爾級(jí)，在片段優(yōu)化至候選藥物的優(yōu)化過程中，分子量和生物活性呈線性增長(zhǎng)關(guān)系，更加符合新藥發(fā)現(xiàn)的一般規(guī)律，可行性也強(qiáng)。,高通量篩選,高通量篩選(High throughput screening，HTS)技術(shù)是指以分子水平和細(xì)胞水平的實(shí)驗(yàn)方法為基礎(chǔ)，以微板形式作為實(shí)驗(yàn)工具載體，以自動(dòng)化操作系統(tǒng)執(zhí)行試驗(yàn)過程，以靈敏快速的檢測(cè)儀器采集實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)，以計(jì)算機(jī)分析處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，在同一時(shí)間檢測(cè)數(shù)以千萬(wàn)的樣品，并以得到的相應(yīng)數(shù)據(jù)庫(kù)支持運(yùn)轉(zhuǎn)的技術(shù)體系；,HTS具有微量、快速、靈敏和準(zhǔn)確等特點(diǎn)。簡(jiǎn)言之就是可以通過一次實(shí)驗(yàn)獲得大量的信息，并從中找到有價(jià)值的信息。,片 斷 及 其 特 征,片斷是比類藥分子

7、小的化合物，分子量或非氫原子數(shù)低于類藥性化合物。 化學(xué)結(jié)構(gòu)比類藥分子簡(jiǎn)單。 片斷應(yīng)易溶于水，因需要高濃度試液方呈現(xiàn)與靶標(biāo)的結(jié)合信號(hào)。 結(jié)構(gòu)上有可以延伸的位置、原子或基團(tuán)。,基于片斷分子設(shè)計(jì)的研究方法,一般來說，基于片段分子的設(shè)計(jì)研究可以分為三個(gè)階段：片段篩選、片段與藥靶復(fù)合物的結(jié)構(gòu)確證和基于片段構(gòu)建新分子。,1.片段庫(kù)的建立： 需要考慮三個(gè)因素：庫(kù)容量、化學(xué)結(jié)構(gòu)多樣性和類藥性，類藥性符合三規(guī)則。,Fragment Rule of 3 MW 300 # H-Bond Donor = 3 # H-Bond Acceptors = 3 cLogP = 3（# Rotatable bonds = 3）

8、,2.片段庫(kù)的篩選： 篩選和識(shí)別與靶蛋白弱結(jié)合的活性片段,3.結(jié)構(gòu)信息的確定 磁共振、質(zhì)譜和X-射線單晶衍射技術(shù)都能直接或者間接地進(jìn)行結(jié)構(gòu)信息的測(cè)定。 4.基于片段構(gòu)建新分子,由苗頭物發(fā)展成先導(dǎo)物的性質(zhì)變化,參數(shù) 苗頭物均值 先導(dǎo)物均值 增量 分子量 174.1 382.8 207.7 氫鍵給體 1.7 1.7 0 氫鍵接受體 2.9 5.6 2.7 非氫原子數(shù) 12.8 28.5 15.7,增量大,由先導(dǎo)物發(fā)展成藥物的性質(zhì)變化,參數(shù) 先導(dǎo)物均值 成藥后均值 增量 分子量 272.0 314.0 42.0 氫鍵給體 0.8 0.8 0 氫鍵接受體 2.2 2.5 0.3 Clog P 1.9

9、2.4 0.5 非氫原子數(shù) 19 22 3,增量小,FBDD的背景1,Andrews分析了200個(gè)藥物和抑制劑的結(jié)合常數(shù)與結(jié)構(gòu)的關(guān)系，得出了10 個(gè)常見功能基和原子對(duì)結(jié)合能的貢獻(xiàn)均值。,* kcal/mol,帶電荷的基團(tuán)與受體結(jié)合的貢獻(xiàn)強(qiáng)于極性基團(tuán)，極性基 團(tuán)又強(qiáng)于非極性基團(tuán)。,FBDD的背景2,Kuntz等分析了150個(gè)含有167個(gè)原子構(gòu)成的離子或化合物與受體的結(jié)合常數(shù)，按照下式計(jì)算了結(jié)合常數(shù)與系統(tǒng)自由能變化的關(guān)系，進(jìn)而推定出每個(gè)原子對(duì)結(jié)合的貢獻(xiàn)。 G結(jié)合 = G復(fù)合物 G參比態(tài) = RTlnK,當(dāng)非氫原子數(shù)在15個(gè)以內(nèi)，結(jié)合能隨原子數(shù)的增加而線性增高，平均每個(gè)原子的貢獻(xiàn)為1.5 kcal/

10、mol；超過15個(gè)原子后結(jié)合能的變化趨于不變，成為非線性變化，這種現(xiàn)象歸因?yàn)榉菬崃W(xué)因素。 Andrews和Kuntz的研究為配體效率概念奠定了基礎(chǔ)。,配體效率(ligand efficiency, LE),分子大小影響物化和藥代性質(zhì)。 減少苗頭、先導(dǎo)物中冗余原子的必要性。 配體效率是衡量苗頭物或先導(dǎo)物以及優(yōu)化的化合物的質(zhì)量的參數(shù)，表征化合物的活性效率。,系指配體(苗頭、先導(dǎo)物、優(yōu)化物等)中每個(gè)原子對(duì)結(jié)合能的貢獻(xiàn)，在選取先導(dǎo)物和優(yōu)化過程中是個(gè)有用的指標(biāo)。,計(jì)算方法： 首先是將復(fù)合物結(jié)合常數(shù)Kd轉(zhuǎn)換為在溫度300K的結(jié)合的自由能(G) 。 G -RT.lnKd = 1.37 pKd G除以非氫原

11、子數(shù)，得出每個(gè)原子的自由能貢獻(xiàn)即配體效率，用下式表示： LE = G/N非氫原子,配體親脂性效率,配體效率是將化合物的活性在分子大小的尺度上加以表征，是優(yōu)化過程中監(jiān)測(cè)化合物的活性、物化性質(zhì)和成藥性程度的一個(gè)指標(biāo)。,還可用配體-親脂性效率指數(shù)(ligand-lipophilicity efficiency, LLE)表征先導(dǎo)物和優(yōu)化的質(zhì)量。LLE 的定義是 pIC50 (或pKi) - CLogP (或 LogD),契 合 質(zhì) 量,在結(jié)構(gòu)優(yōu)化中，當(dāng)分子量的加大，即使活性增大，配體效率卻變化不大，甚至減小。以致不能反映和揭示優(yōu)化過程的實(shí)際狀態(tài)。 Reynolds等提出了配體的契合質(zhì)量的概念(fit

12、 quality, FQ)，以消除因分子量加大，LE的變化被掩飾和拉平的效應(yīng)。,計(jì)算方法是將化合物的非氫原子數(shù)歸一和標(biāo)度化，得到相應(yīng)的LE-Scale，分子中不同原子數(shù)，LE-Scale值不同，按如下定義： LE-Scale 0.064 + 0.873e(-0.026HA) 或?qū)缡秸归_： LE-Scale 0.0715 + (7.5382/HA) + (25.7079/HA2) + (361.4722/HA3),FQ將上述的非線性標(biāo)準(zhǔn)化，使配體之間的結(jié)合效率有可比性。,契 合 質(zhì) 量,若以非氫原子數(shù)與配體效率作圖，原子數(shù)在1025的化合物配體效率呈線性變化。,當(dāng)非氫原子低于20時(shí)，最大親和力

13、與原子數(shù)成線性關(guān)系；超過20后活性趨于不變或下降。,非氫原子數(shù) LE scale 相鄰差值 10 0.7204 11 0.6972 0.0232 12 0.6685 0.0287 13 0.6367 0.0318 14 0.6091 0.0276 15 0.5809 0.0282 16 0.5545 0.0264 17 0.5300 0.0245 18 0.5072 0.0228 19 0.4877 0.0195 20 0.4672 0.0205 21 0.4494 0.0178 22 0.4331 0.0167 23 0.4179 0.0152 24 0.4039 0.0149 25 0.3

14、908 0.0131 26 0.3787 0.0121 27 0.3674 0.0113 28 0.3568 0.0106 29 0.3471 0.0097 30 0.3378 0.0093,基于片斷的藥物設(shè)計(jì)：方法的整合性,片斷化合物庫(kù)(約1000-2000個(gè)化合物) 體外活性篩選 結(jié)構(gòu)生物學(xué)：復(fù)合物X-線晶體學(xué)或 NMR或MS 計(jì)算機(jī)分子設(shè)計(jì)輔助 藥物設(shè)計(jì)和化學(xué)合成 活性評(píng)價(jià) 結(jié)構(gòu)生物學(xué)或分子對(duì)接 構(gòu)效分析 確定先導(dǎo)物,片斷化合物庫(kù),體外篩選評(píng)價(jià),達(dá)到規(guī)定活性,復(fù)合物單晶結(jié)構(gòu),是,否,計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì),藥物化學(xué)合成,達(dá)到規(guī)定活性,是,否,確定先導(dǎo)物,片斷化合物舉例,片斷分子,受體結(jié)合部位,片

15、斷連接,片斷分子分別篩選與組合庫(kù)比較,6 X 6片斷組合庫(kù),隨機(jī)篩選,基于結(jié)構(gòu)的,新方法,篩選低分子量、低親和力片段,藥靶結(jié)構(gòu)信息,優(yōu)化或連接,與藥靶親和力高并且類藥性強(qiáng),FBDD需要有靈敏的檢測(cè)手段,NMR方法： Skinner AL, and Laurence JS. J Pharm Sci. 2008, 97: 4670 X-ray方法：Jhoti H et al. Curr Opin Chem Biol. 2007, 11: 48 SPR方法： Neumann T et al. Curr Top Med Chem.2007, 7: 1630 MS方法： Annis DA et al.

16、Curr. Opin. Chem. Biol. 2007, 11: 51,一、磁共振技術(shù) 基本原理在于配體與生物大分子結(jié)合后，許多NMR參數(shù)（如化學(xué)位移）會(huì)發(fā)生改變，通過檢測(cè)并分析這些數(shù)據(jù)，可以判定配體是否與受體結(jié)合、結(jié)合的強(qiáng)度以及結(jié)合的模式。,NMR篩選片段的方法一般可分為兩種：檢測(cè)配體的篩選 檢測(cè)受體的篩選,基態(tài),激發(fā)態(tài),基態(tài),時(shí)間不同,分子大小有關(guān),分子大，時(shí)間短 分子小，時(shí)間長(zhǎng),延長(zhǎng)預(yù)測(cè)時(shí)間，只檢測(cè)小分子藥物,檢測(cè)配體的篩選,普通條件,小分子化合物的NMR,靶蛋白,延遲,再次檢測(cè),未結(jié)合靶蛋白可檢測(cè),結(jié)合靶蛋白不可檢測(cè),混合物與靶蛋白結(jié)合，有的峰消失，表示有活性,提取分離,檢測(cè)受體的篩

17、選,先決條件是必須知道靶蛋白的結(jié)構(gòu)，要求靶蛋白需進(jìn)行15N標(biāo)記，這樣才能保證靶蛋白NMR譜能準(zhǔn)確識(shí)別每個(gè)酰胺結(jié)合位點(diǎn)的特征峰。,原理是當(dāng)小分子與靶蛋白結(jié)合后，會(huì)改變蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)的局部化學(xué)環(huán)境，通過15N標(biāo)記蛋白的二維15N和1H異核單量子相關(guān)譜，可以找出各酰胺信號(hào)15N和1H的化學(xué)位移變化。,如果片段有結(jié)合，相關(guān)氨基酸殘基的酰胺信號(hào)就會(huì)發(fā)生位移，因此這種方法不僅可檢測(cè)到片段是否有結(jié)合，而且還能檢測(cè)結(jié)合在靶蛋白的哪個(gè)位置。,通過二維15N異核單量子相關(guān)譜中15N和1H的化學(xué)位移的變化來檢測(cè)是否有小分子與靶蛋白結(jié)合。,配體與靶蛋白的結(jié)合常數(shù)可以通過化學(xué)位移的變化和配體濃度的關(guān)系測(cè)得，這樣可以篩選

18、得到結(jié)合于生物靶分子活性位點(diǎn)亞區(qū)域的低親和配體，將這些配體進(jìn)行連接可以得到具有較高親和力的配體，然后通過對(duì)作用于每個(gè)亞區(qū)域的片段進(jìn)行優(yōu)化和重新組裝便得到所期望的高親和性配體。,二、質(zhì)譜技術(shù)：非共價(jià)結(jié)合 1.電噴霧電離質(zhì)譜方法： 將所篩選的片段與靶蛋白配成混合液，然后設(shè)定合適的離子化條件，將片段-靶蛋白復(fù)合物從液相轉(zhuǎn)化為氣相，并測(cè)定復(fù)合物的質(zhì)荷比，這樣可以得到結(jié)合片段的分子量，進(jìn)而確定是哪一個(gè)片段與藥靶結(jié)合。,之后，用各種色譜技術(shù)分離得到片段-靶蛋白復(fù)合物，并將片段從復(fù)合物上解離下來，通過濃度測(cè)定，計(jì)算得到片段的親和力。,2.Tether方法：共價(jià)結(jié)合 靶蛋白的半胱氨酸殘基巰基與連有二硫鍵側(cè)鏈的

19、片段形成新的二硫鍵，一般來說，應(yīng)用Tether方法篩選的含有二硫鍵片段有三個(gè)部分組成：片段母體、連接基團(tuán)和離去基團(tuán)。,其次，將片段庫(kù)中的片段（各個(gè)片段分子量不同）都連上相同的巰基側(cè)鏈，然后將靶蛋白置入片段的高濃度溶液中。 當(dāng)活性片段和靶蛋白結(jié)合時(shí)，片段和靶蛋白間不僅能夠形成共價(jià)的二硫鍵，而且片段還會(huì)與半胱氨酸殘基附近的活性口袋結(jié)合，從而形成比其他片段更穩(wěn)定的片段-靶蛋白共價(jià)復(fù)合物，占主導(dǎo)地位。,這樣根據(jù)復(fù)合物的分子量就可以在質(zhì)譜圖上輕易地識(shí)別活性片段；而且根據(jù)插入的半胱氨酸殘基位置的不同，還可以判斷活性片段的結(jié)合位置。,三、X-射線單晶衍射技術(shù),片斷演化成先導(dǎo)物的三種模式,片斷的生長(zhǎng),片斷只結(jié)

20、合于受體的部分結(jié)合位點(diǎn),以受體結(jié)合的第一個(gè)片斷為核心，經(jīng)理性設(shè)計(jì)， 在鄰近處逐漸生長(zhǎng)成活性強(qiáng)的較大分子,片斷的連接,與受體結(jié)合的相鄰的兩個(gè)片斷經(jīng)連接基連接成 活性強(qiáng)的較大分子,片斷的融合,與受體結(jié)合的相互交蓋或甚近的兩個(gè)片斷 合并成活性強(qiáng)的較大分子,片斷生長(zhǎng)：蛋白激酶B(PKB)抑制劑先導(dǎo)物,優(yōu)化結(jié)構(gòu)要求化合物的配體效率保持在0.30 以上。 基于PKB與苗頭物的三維結(jié)合特征，發(fā)現(xiàn)在苯環(huán)對(duì)位的結(jié)合部位有負(fù)性基團(tuán)和較大的腔穴。,合成了含有堿性基團(tuán)的化合物，活性提高，雖分子量增大，仍保持了LE值。 加入新的苯環(huán)，仍維持了相同的配體效率。 最后在新的苯環(huán)上引入鹵素，得到高活性。,IC50(M) 80

21、 12 3.0 0.51 0.20 0.031 0.018 No HA 10 15 15 20 23 21 24 LE(kcal/mol) 0.47 0.48 0.61 0.43 0.40 0.49 0.44 FQ 0.70 0.83 1.05 0.92 0.96 1.09 1.09,片斷生長(zhǎng): 周期蛋白依賴的激酶抑制劑,周期蛋白依賴的激酶(CDK)活性取決于周期蛋白的存在，其表達(dá)水平與細(xì)胞周期相關(guān)。抑制CDK可抑制腫瘤生長(zhǎng)。,兩個(gè)氫鍵和芳環(huán)疏水作用,MW=316 IC50=0.66M LE=0.38 LQ=0.85,Leu81羰基形成氫鍵, Ile10 and Leu134與苯環(huán)的疏水作用,

22、MW=118 IC50=185M LE=0.57 FQ=0.76,MW=187 IC50=97M LE=0.39 FQ=0.64,另一思路是去除苯并環(huán),活性減弱, 但LE未降,MW=258 IC50=0.85M LE=0.44 FQ=0.90,簡(jiǎn)化后的吡唑4位可向外生長(zhǎng), 氫鍵給體有利于結(jié)合.活性明顯提高,LE大增,23,33,MW=337 IC50=0.14M LE=0.39 FQ=0.97,MW=373 IC50=0.003M LE=0.45 FQ=1.19,苯甲酰胺的活性略增, LE降低. 苯環(huán)離開羰基明面51, 說明不穩(wěn)定,苯環(huán)2,6位雙取代穩(wěn)定了構(gòu)象,活性提升, 但進(jìn)入細(xì)胞能力弱,

23、ClogP過大,分子內(nèi)氫鍵所致,.,MW=395 IC50=0.047M LE=0.42 FQ=1.06,二氯取代, 對(duì)酶和細(xì)胞活性均明顯增高,MW=362 IC50=0.14M LE=0.31 FQ=0.79,AT7519 于10M 對(duì) P450 1A2, 2D6, 3A4, 2C9, 2C19的抑制作用30% 水溶性(HCl鹽)：25mg/ml 進(jìn)入臨床研究,苯環(huán)換成哌啶, 酶活水平性降低, 但對(duì)細(xì)胞作用增強(qiáng),片斷生長(zhǎng) + 平行合成：甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑,Hajduk等研究紅霉素耐藥菌甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑 ，用NMR方法篩選片斷分子，發(fā)現(xiàn)氨基均三嗪的Ki=1 mM，均三嗪骨架適于平行合成，將甲硫基

24、替換成各種胺基，得到先導(dǎo)化合物，Ki = 8 M.,片斷生長(zhǎng)：極光激酶抑制劑,極光激酶(Aurora kinase)調(diào)節(jié)細(xì)胞有絲分裂起關(guān)鍵作用，是抗癌藥物的靶標(biāo)。 用蛋白浸泡技術(shù)發(fā)現(xiàn)吡唑基苯并咪唑可結(jié)合極光激酶A，X-線晶體學(xué)研究表明，該化合物結(jié)合于在激酶深部的ATP結(jié)合位點(diǎn)。,進(jìn)而發(fā)現(xiàn)苯甲酰氨基化合物活性增強(qiáng)，因?yàn)檎紦?jù)了一個(gè)疏水腔。 為了同時(shí)提高對(duì)于Aurora B的抑制作用，在苯并咪唑的5位引入嗎啉環(huán)，提高了對(duì)Aurora A和B的抑制活性。,該化合物的小鼠藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)為：Cl =43 (mL/min)/kg， F= 26%，而血漿蛋白結(jié)合率過高(99.5%)。 為了全面優(yōu)化藥效和藥代性

25、質(zhì)，分析該化合物的晶體結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)氟代苯基并未完全適配于結(jié)合腔內(nèi)，在不增加分子量和ClogP的原則下，保持分子骨架和藥效團(tuán)不變，將苯甲酰胺基變換成環(huán)丙脲基AT9283 ，藥效和藥代性質(zhì)均明顯優(yōu)化。,IC50(M) 0.091 0.070 0.010 0.003 LE 0.50 0.49 0.35 0.42 FQ 1.09 1.18 1.07 1.17,尿激酶型纖維蛋白溶酶原活化抑制劑,尿激酶型纖維蛋白酶原激活劑(uPA)與其受體(uPAR)結(jié)合，可催化裂解纖維蛋白酶原的Arg/Val酰氨鍵生成纖維蛋白酶，后者負(fù)責(zé)許多蛋白的水解過程，降解胞內(nèi)基質(zhì)的多種成份，引發(fā)細(xì)胞的遷移，所以，uPA介導(dǎo)了許多病

26、理過程如主動(dòng)脈瘤、多發(fā)性硬化癥和癌轉(zhuǎn)移等。,抑制uPA的作用可望治療這些疾病。篩選小分子弱堿性藥物美西律(mexiletine)對(duì)uPA的抑制作用IC501 mM，且只有R構(gòu)型與酶結(jié)合，,晶體衍射表明，伯氨基與Asp189的羧基、Ser190的羰基以及Gly219形成氫鍵，苯基與亞乙基與S1疏水強(qiáng)結(jié)合。美西律雖配體效率只有0.32，但水溶性很好，且口服生物利用度F=90%，pKa=9.2，堿性不象既有的uPA抑制劑過強(qiáng)，故是良好的起始物。,根據(jù)萘脒具有活性說明苯環(huán)的對(duì)位有空間，可引入酸性基團(tuán)，去掉側(cè)鏈甲基以消除手性原子，將2,6-二甲基換成二氯，IC5040 M，在晶體結(jié)構(gòu)的引導(dǎo)下，酰苯胺的

27、IC50=5.2 M，IC50=720 nM，最后經(jīng)SAR設(shè)計(jì)化合物活性提高10倍，IC50=72 nM。對(duì)大鼠具有良好藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)，半衰期t1/2=7.5 h，F(xiàn) =60%,IC50 1 mM 40 M 5.2 M 720 nM LE 0.32 0.40 0.29 0.29 FQ 0.57 0.76 0.74 0.84,IC50 =72 nM LE = 0.32 FQ = 0.97,片斷連接：FKBP抑制劑,用核磁共振研究FKBP抑制劑，稱作SAR by NMR。用15N 標(biāo)記的FKBP篩選片斷庫(kù)的結(jié)合作用，觀察和確定酰胺鍵的15N- 和1H化學(xué)位移的變化。 篩選兩種分子1和2有弱結(jié)合作用

28、。連接成3為強(qiáng)抑制劑。,1 2 3 Kd 2 M 100 M 49 nM 非氫原子數(shù) 26 17 45 LE(kcal/mol) 0.30 0.32 0.22 FQ 0.79 0.64 1.06,片斷連接：他克林形成攣藥,膽堿酯酶有兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)： 深部窄口處的催化部位和暴露于水相的外部位點(diǎn)。 將適宜長(zhǎng)度的碳鏈連接他克林，提高了活性。,Ki=0.018M(小鼠) IC50=0.59M(大鼠腦) HA No=15 LE=0.57 FQ=0.98,IC50=0.0004M(大鼠腦) HA No=37 LE=0.35 FQ=1.25,片斷連接：他克林與另一弱作用片斷形成強(qiáng)抑制劑,Sharpless等用

29、環(huán)加成反應(yīng)將兩個(gè)不同的抑制劑片斷經(jīng)連接基生成fmole級(jí)的高活性膽堿酯酶抑制劑,Ki=1.1M(小鼠) HA No=31 LE=0.26 FQ=0.80,Ki=0.018M(小鼠) HA No=15 LE=0.57 FQ=0.98,Ki=0.00000041M(小鼠) HA No=48 LE=0.35 FQ=1.80,片斷融合：自組裝碳酸酐酶抑制劑,兩個(gè)片斷獨(dú)立結(jié)合于鄰近的兩個(gè)位點(diǎn)，化學(xué)活性功能基自組裝成亞胺，還原生成高活性抑制劑,片斷融合：用質(zhì)譜方法研究U1061A RNA抑制劑,U1061A RNA是抗微生物感染的靶標(biāo)。 質(zhì)譜法可在高濃度下進(jìn)行。 可給出結(jié)合信息：化學(xué)計(jì)量性，競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合性。

30、化合物1和2可同時(shí)結(jié)合于靶標(biāo)，二者非競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，位點(diǎn)不同，相距鄰近。 1和2融合一起，提高了活性。,IC50 40 M 41 M 0.064M No HA 12 19 31 LE 0.32 0.50 0.31 FQ 0.48 1.02 0.97,分子量,分布系數(shù),藥代 過膜性 生物利用度,藥代 半衰期代謝穩(wěn)定性,藥效 配體效率,藥效 配體親脂效率,分子體積,雜原子數(shù),分子表面積,氫鍵接受 體,氫鍵給體,可旋轉(zhuǎn)性鍵,極性表面積,分子量和分布系數(shù)是優(yōu)化物化性質(zhì)、藥效學(xué)、藥代動(dòng)力學(xué)的高度概括,藥物代謝通常分為兩相： 第相（phase ）代謝。 第相（phase ）代謝。,（一）代謝,第相主要是官能團(tuán)

31、化反應(yīng)： 藥物在酶的催化下進(jìn)行氧化、還原、水解和羥化等過程，在藥物分子中引入或使藥物分子暴露出極性基團(tuán)，如-OH、-SH、-COOH和-NH2等。,第相為結(jié)合反應(yīng)： 相代謝產(chǎn)物或原型藥物在酶的影響下與內(nèi)源性小分子成分，如葡萄糖醛酸、硫酸、甘氨酸或谷胱甘肽，經(jīng)共價(jià)鍵結(jié)合，生成極性強(qiáng)或水溶性的藥理失活結(jié)合物，隨尿和膽汁排出體外。,1.1芳環(huán)的氧化 含芳環(huán)藥物的氧化代謝是以生成酚的代謝產(chǎn)物為主，羥基化反應(yīng)主要發(fā)生在芳環(huán)的對(duì)位。,苯妥英,1.2烯烴的氧化： 由于烯烴化合物比芳香烴的鍵活性高，因此烯烴化合物也會(huì)被代謝生成環(huán)氧化合物中間體，比前面的穩(wěn)定。例如抗癲癇藥物卡馬西平只有通過代謝轉(zhuǎn)化為環(huán)氧化物中間

32、體后才具有抗驚厥活性。,1.3胺的氧化 含氮藥物的氧化代謝主要發(fā)生在兩個(gè)部位：一是在和氮原子相連接的碳原子上，發(fā)生N-脫烷基化和脫氨反應(yīng)；另一是發(fā)生N-氧化反應(yīng)。,含伯胺基的化合物容易進(jìn)行脫氨基反應(yīng)，如苯丙胺易發(fā)生氧化脫氨。 若伯氨基直接與叔碳原子相連，則不能發(fā)生脫氨基反應(yīng)，因?yàn)椴荒苓M(jìn)行氨基-C的羥基化中間過程，如全身麻醉劑氯胺酮進(jìn)行N-脫甲基反應(yīng)后得到的代謝物不能再進(jìn)行脫氨反應(yīng)。,+NH3,苯丙胺,氯胺酮,對(duì)于叔胺和仲胺化合物，叔胺的脫烷基化反應(yīng)速度比仲胺快。,利多卡因,1.4醚及硫醚的氧化 含氧化物的氧化代謝以醚類藥物為主，醚類藥物在微粒體混合功能酶的催化下，進(jìn)行O-脫烷基化反應(yīng)。,1.5

33、醇和醛的氧化,醇羥基的藥物在體內(nèi)醇脫氫酶的催化下，脫氫氧化得到相應(yīng)的羰基化合物。,大部分伯醇在體內(nèi)很容易被氧化生成醛，但醛不穩(wěn)定，在體內(nèi)醛脫氫酶等酶的催化下進(jìn)一步氧化生成羧酸； 仲醇中的一部分可被氧化生成酮，也有不少仲醇不經(jīng)氧化而和叔醇一樣經(jīng)結(jié)合反應(yīng)直接排出體外。,2.還原反應(yīng),2.1羰基的還原 酮羰基是藥物結(jié)構(gòu)中常見的基團(tuán)，通常在體內(nèi)經(jīng)酮還原酶的作用，生成仲醇。 脂肪族和芳香族不對(duì)稱酮羰基在酶的催化下，立體專一性還原生成一個(gè)手性羥基，主要是S-構(gòu)型，即使有其他手性中心存在亦是如此。,2.2硝基和偶氮化合物的還原,芳香族硝基在代謝還原過程中，在CYP450酶系消化道細(xì)菌硝基還原酶等酶的催化下，

34、還原生成芳香氨基。,偶氮基的還原在很多方面和硝基還原相似，該反應(yīng)也是在CYP450酶系、NADPH-CYP450還原酶及消化道某些細(xì)菌的還原酶的催化下進(jìn)行的。 氧的存在通常也會(huì)抑制還原反應(yīng)的進(jìn)行。還原中，偶氮鍵先還原生成氫化偶氮鍵，最后斷裂形成兩個(gè)氨基。,3、水解反應(yīng)（hydrolysis） 水解反應(yīng)是具有酯和酰胺類藥物在體內(nèi)代謝的主要途徑，如羧酸酯、硝酸酯、磺酸酯、酰胺等藥物在體內(nèi)代謝生成相應(yīng)的酸及醇或胺。,4.結(jié)合反應(yīng) 是在酶的催化下將內(nèi)源性的親水反應(yīng)物如葡萄糖醛酸、硫酸、氨基酸、谷胱甘肽等結(jié)合到原藥物或第相的藥物代謝產(chǎn)物中。 通過結(jié)合使藥物去活化以及產(chǎn)生水溶性的代謝物，有利于從尿和膽汁中排泄。,實(shí)際上絕大多數(shù)藥物的代謝都比較復(fù)雜，其引用藥物的生物效應(yīng)變化多樣，綜合有以下幾種： 1.代謝滅活：將活性藥物代謝為無(wú)活性的物質(zhì)； 2.代謝活化：將無(wú)活性的藥物代謝為有活性的物質(zhì)； 3.活性不變：將活性物質(zhì)代謝為仍有活性的物質(zhì)； 4.毒性增加：將無(wú)毒性或毒性小的藥物代謝為毒性物質(zhì)； 5.導(dǎo)致藥理作用改變。,二、先導(dǎo)化合物的優(yōu)化 （一）先導(dǎo)化合物的一般優(yōu)化方法 1.剖裂與拼合 剖裂是指將先導(dǎo)化合物剖析成兩個(gè)或數(shù)個(gè)亞結(jié)構(gòu)，通過合成或構(gòu)效關(guān)系可以優(yōu)選出簡(jiǎn)化的基本結(jié)構(gòu)或藥物，嗎啡到哌替啶。,