1、分子克隆技術,分子克?。╩olecular cloning） 又稱為基因克隆、基因工程、DNA克隆、重組DNA技術,克隆（Clone） 指通過無性繁殖過程所產生的與親代完全相同的子代群體。,分子克隆 指按照人的意愿，在體外將某種生物的DNA片斷插入到載體（質粒、病毒等）中，形成遺傳物質的新組合-重組DNA分子（重組子），然后將重組子轉移到宿主細胞中進行復制或表達，即對DNA分子進行克隆，以獲得該DNA分子的大量拷貝。,基本原理： 將編碼某一多肽或蛋白質的基因（外源基因）組裝到細菌質粒（質粒是細菌染色體外的雙鏈環(huán)狀DNA分子）中，再將重組質粒轉入大腸桿菌，這樣重組質粒就隨大腸桿菌的增殖而復制，從

2、而克隆基因或表達出外源基因編碼的相應多肽或蛋白質。,As a result of this work, Paul Berg shared the 1980 Nobel Prize in Chemistry with Walter Gilbert and Frederick Sanger for fundamental studies of the biochemistry of nucleic acids, with particular regard to recombinant-DNA.,At Stanford Berg and his colleagues spliced two DNA

3、 molecules together in vitro and were able to insert a set of three genes responsible for metabolizing galactose in Escherichia coli into the SV40 DNA genome.,This work led to the emergence of recombinant DNA technology and provided a major tool for analyzing mammalian gene structure and function.,大

4、腸桿菌轉化體系的建立：感受態(tài)菌制備 經氯化鈣處理的大腸桿菌能夠攝取質粒DNA。,1.雙抗性（TerKar)重組質粒DNA及雙抗性轉化大腸桿菌細胞的獲得。,2.真核動物非洲爪蟾的基因在原核細胞中轉錄,意義：1.解決了無復制能力的DNA片斷在宿主細胞中進行繁殖克隆的關鍵問題；2.質粒分子可作為基因克隆的載體將外源DNA分子導入宿主細胞；3.真核細胞的基因可被轉移到原核細胞中進行克隆及表達。,分子克隆中的關鍵技術： DNA分子的分離和富集技術；DNA分子的切割與連接技術； 載體構建技術；大腸桿菌轉化技術； 重組DNA分子的篩選和鑒定技術,分子克隆的基本步驟： 1.目的基因的獲得 2.目的基因與載體的連接 3.重組DNA分子導入受體細胞 4.篩選出含重組DNA分子的受體細胞克隆 5.克隆基因、克隆基因的表達,載體特征： 1.能自主復制的復制子 2.可供篩選的遺傳標記 3.適當大小的分子量 4.合適的限制性內切酶位點，方便外源基因的插入 5.在受體細胞中高效復制,TA克隆的idea最初來自1994年。幾位學者發(fā)現(xiàn)TaqDNA聚合酶在PCR產物的3末端加上一個脫氧腺苷（A），而且這種特性與模板無關。之后，invitrogen公司發(fā)明了TA克隆技術，并擁有全球TA cloning商標的專利權。線