1、1,細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù),Tissue culture,2,細(xì)胞培養(yǎng) cell culture 是從體內(nèi)取出組織的單個細(xì)胞或單一細(xì)胞群模擬體內(nèi)生理環(huán)境，在無菌、適當(dāng)溫度和一定營養(yǎng)條件下，使之生存和生長并保持細(xì)胞特性，為細(xì)胞培養(yǎng)。,3,各種液體要專人配制，并保證做到按規(guī)程行事；制備濃度精確、滅菌可靠。所有制備好的溶液和試劑瓶上都要有標(biāo)簽，注上名稱、濃度、消毒與否和制備日期。,組織培養(yǎng)是一種程序比較復(fù)雜、需求條件多而嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)性工作。由于工作環(huán)節(jié)多，為保證操作上的一致性，避免造成人為的差異，應(yīng)將所有操作程序制定統(tǒng)一規(guī)范，在一定時間內(nèi)保持相對穩(wěn)定和人人遵守。,實(shí)驗(yàn)室管理制度,4,培養(yǎng)用品要有固定的存放地點(diǎn)（

2、培養(yǎng)用品與非培養(yǎng)用品存放分開；已消毒與未消毒品嚴(yán)格分開存放）， 目的：避免各種雜質(zhì)混入細(xì)胞生存環(huán)境、防止微生物感染和細(xì)胞“污染”。,5,二、細(xì)胞生存條件及代謝,6,無污染環(huán)境 培養(yǎng)環(huán)境無毒和無菌是保證培養(yǎng)細(xì)胞生存的首要條件。 細(xì)胞被置于體外培養(yǎng)后，失去了對微生物和有毒物質(zhì)的防御能力，一旦被污染或自身代謝物積累等，可導(dǎo)致細(xì)胞死亡。,（一）基本條件,7,適宜溫度 人體細(xì)胞的適宜溫度為36.5+0.5，偏離這一溫度范圍，細(xì)胞的正常代謝會受到影響，甚至死亡。 培養(yǎng)細(xì)胞對低溫的耐受力比對高溫強(qiáng)。 溫度不低于0時，對細(xì)胞代謝雖有影響，但并無傷害作用； 對培養(yǎng)液中加一定量的保護(hù)劑（甘油或二甲基亞砜），封入安

3、瓿中，凍存于液氮中，能長期儲存，解凍后細(xì)胞復(fù)蘇，仍能繼續(xù)增殖生長，細(xì)胞生物性狀不受任何影響，成為保存細(xì)胞最主要的手段。,溫度對細(xì)胞生長的影響,8,氣體和pH值 O2參與三羧酸循環(huán)，產(chǎn)生能量供給細(xì)胞生長、增殖和合成各種所需成分。多數(shù)細(xì)胞缺氧不能生存。 開放培養(yǎng)時（碟皿或培養(yǎng)瓶松蓋培養(yǎng)），一般要把細(xì)胞置于95%的空氣加5%CO2混合氣體環(huán)境中。CO2既是細(xì)胞代謝產(chǎn)物，也是細(xì)胞所需成分，主要作用在于能維持培養(yǎng)基的pH值。大多數(shù)細(xì)胞要求7.2-7.4。,CO2 +H2O H2CO3 H+ + HCO3-,9,營養(yǎng)物質(zhì) 糖、無機(jī)鹽 氨基酸、維生素 促細(xì)胞生長因子 牛血清是提供生長因子和細(xì)胞所需物質(zhì)的來源

4、 滲透壓 離子強(qiáng)度：260-320 mOsm/Kg 人工培養(yǎng)基,10,二、實(shí)驗(yàn)設(shè)備,無菌間、超凈臺、洗刷間、儲存室、實(shí)驗(yàn)工作室 孵箱、CO2孵箱、顯微鏡、純水器、液氮罐、抽濾裝置、離心機(jī)、干烤箱、高壓滅菌器、加樣器 培養(yǎng)器皿、耗材（試管、吸管）,11,三、在腫瘤學(xué)中的應(yīng)用,12,腫瘤細(xì)胞生物特性學(xué)研究 比較腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞在體外培養(yǎng)條件下生長行為的差異，研究腫瘤細(xì)胞生物學(xué)特性的改變，對于建立診斷標(biāo)準(zhǔn)有益。 腫瘤細(xì)胞體外生長形態(tài)學(xué)研究 腫瘤細(xì)胞生長特性 細(xì)胞接觸抑制實(shí)驗(yàn),13,腫瘤發(fā)病機(jī)制研究 腫瘤產(chǎn)生誘發(fā)因素的研究 腫瘤細(xì)胞侵潤機(jī)制和過程的研究 腫瘤與正常細(xì)胞 共同培養(yǎng)法 研究腫瘤藥物篩選,

5、14,異種移植研究 裸鼠發(fā)現(xiàn)與應(yīng)用 建立了動物移植瘤模型 抗腫瘤藥物篩選 研究腫瘤細(xì)胞調(diào)亡以及腫瘤細(xì)胞體外分化又成為新熱點(diǎn),15,生物治療 活細(xì)胞-體細(xì)胞-體內(nèi) 活化細(xì)胞（LAK）-患者 組織-懸液-培養(yǎng)-回輸機(jī)體,16,細(xì)胞培養(yǎng)：,一、原代培養(yǎng) 二、傳代培養(yǎng),17,一 原代培養(yǎng),18,原代培養(yǎng)（primary culture） 從體內(nèi)取出組織或細(xì)胞的第一次培養(yǎng),19,原理 將動物機(jī)體的各種組織從機(jī)體中取出，經(jīng)各種酶（常用胰蛋白酶）、螯合劑（常用EDTA乙二胺四乙酸）或機(jī)械方法處理，分散成單細(xì)胞，置合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使細(xì)胞得以生存、生長和繁殖，這一過程稱原代培養(yǎng)。,20,儀器、材料及試劑 儀

6、器：培養(yǎng)箱（調(diào)整至37），培養(yǎng)瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、紗布、手術(shù)器械、血球計(jì)數(shù)板、離心機(jī)、水浴箱（37） 材料：動物組織塊 試劑：1640培養(yǎng)基（含20%小牛血清），0.25%胰酶，Hanks液，碘酒,21,初代消化培養(yǎng)法 1. 準(zhǔn)備：取各種已消毒的培養(yǎng)用品置于凈化臺面，紫外線消毒20分鐘。開始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。 2. 布局：點(diǎn)燃酒精燈，安裝吸管帽。 3. 處理組織：把組織塊置于燒杯中，用Hanks液漂洗23次，去除血污；如懷疑組織可能污染，可先置于含有青鏈霉素的混合液中3060分鐘。4. 剪切：用眼科剪把組織切成23毫米大小的塊，以便于消化。加入比組

7、織塊總量多3050倍的胰蛋白酶液，然后一并倒入三角燒瓶中，結(jié)扎瓶口或塞以膠塞。,22,5. 消化：或用恒溫水浴，或置于37溫箱消化均可，消化中每隔20分鐘應(yīng)搖動一次，如用電磁恒溫?cái)嚢杵飨谩Ｏ瘯r間依組織塊的大小和組織的硬度而定。6. 分離：在消化過程中見消化液發(fā)混濁時，可用吸管吸出少許消化液在鏡下觀察，如組織已分散成細(xì)胞團(tuán)或單個細(xì)胞，立即終止消化，隨即通過適宜不銹鋼篩，濾掉尚未充分消化開的組織塊。低速（5001000轉(zhuǎn)/分）離心消化液5分鐘，吸出上清，加入適量含有血清的培養(yǎng)液。7. 計(jì)數(shù)：用計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，如細(xì)胞懸液細(xì)胞密度過大，再補(bǔ)加培養(yǎng)液調(diào)整后，分裝入培養(yǎng)瓶中。對大多數(shù)細(xì)胞來說，pH要求

8、在7.27.4范圍，培養(yǎng)液呈微紅色，如顏色偏黃，說明液體變酸，可用NaHCO3調(diào)整。8. 培養(yǎng)：置于36.5溫箱培養(yǎng)，如用CO2溫箱培養(yǎng)，瓶口需用紗布棉塞或螺旋帽堵塞，紗布塞易生霉菌，每次換液時需要換新塞。,23,初代組織塊培養(yǎng)法1. 剪切：把組織小塊置于小燒杯或青霉素小瓶中，用Hanks液漂洗二三次以去掉表面血污，吸靜Hanks液，用眼科剪反復(fù)剪切1mm3塊為止。2. 擺布：用彎頭吸管吸取若干小塊，置于培養(yǎng)瓶中，用吸管彎頭把組織小塊擺布在培養(yǎng)瓶底部，小塊相互距離以0.5cm為宜，每一25ml培養(yǎng)瓶底可擺布2030塊。3. 輕輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，另瓶底向上，注意翻瓶時勿令組織小塊流動，塞好瓶塞，置3

9、6.5溫箱培養(yǎng)2小時左右（勿超過4小時），使小塊微干涸。4. 培養(yǎng)：從微箱中取出培養(yǎng)瓶，開塞，46度斜持培養(yǎng)瓶，箱瓶底腳部輕輕注入培養(yǎng)液少許，然后緩緩再把培養(yǎng)瓶翻轉(zhuǎn)過來，讓培養(yǎng)液慢慢覆蓋附于瓶地上的組織小塊。置溫箱中靜止培養(yǎng)。待細(xì)胞從組織塊游出數(shù)量增多后。再補(bǔ)加培養(yǎng)液。,24,二. 傳 代 培 養(yǎng),傳代培養(yǎng)（passage culture） 將細(xì)胞從一個培養(yǎng)器皿中轉(zhuǎn)移或移植到另一個培養(yǎng)器皿中。,25,原理 細(xì)胞在培養(yǎng)瓶長成致密單層后，已基本上飽和，為使細(xì)胞能繼續(xù)生長，同時也將細(xì)胞數(shù)量擴(kuò)大，就必須進(jìn)行傳代（再培養(yǎng)）。 傳代培養(yǎng)也是一種將細(xì)胞種保存下去的方法。同時也是利用培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行各種實(shí)驗(yàn)的必經(jīng)

10、過程。懸浮型細(xì)胞直接分瓶就可以，而貼壁細(xì)胞需經(jīng)消化后才能分瓶。,26,材料和試劑 1. 細(xì)胞：貼壁細(xì)胞株 2. 試劑：0.25胰酶、1640培養(yǎng)基（含10小牛血清） 3. 儀器和器材：倒置顯微鏡，培養(yǎng)箱、培養(yǎng)瓶、吸管、廢液缸等,27,二. 傳 代 培 養(yǎng),準(zhǔn)備及注意事項(xiàng) 換 液 傳 代 凍 存 復(fù) 蘇 MTT,28,換液,把細(xì)胞培養(yǎng)瓶從培養(yǎng)箱中拿出, 擰緊蓋子; 觀察瓶內(nèi)培養(yǎng)基的顏色, 是否渾濁等; 放在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長狀況。 放入超凈工作臺內(nèi),點(diǎn)燃酒精燈,拿培養(yǎng)瓶口在酒精燈火焰上轉(zhuǎn)兩圈以上,至少三秒. 取下蓋子,燒瓶口;倒掉培養(yǎng)基,燒瓶口; 拿出PBS液瓶子,燒瓶口和鑷子;用鑷子將塞

11、子取出,燒瓶口（至少10圈）。,29,準(zhǔn)備事項(xiàng),紫外燈照射細(xì)胞室30分鐘,風(fēng)機(jī)運(yùn)行10分鐘后方可進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室. 穿專用的口罩,帽子,拖鞋,工作衣等. 帶手套,并用酒精擦拭之. 準(zhǔn)備好實(shí)驗(yàn)必需用品. 超凈工作臺內(nèi)操作前用酒精棉球擦拭臺面. 超凈工作臺內(nèi)操作完成后， 要用酒精棉球擦拭臺面,除了酒精燈,鑷子,試管架等物品外,其他都要拿出工作臺外. 紫外燈照射30分鐘.,30,6.用吸管吸取3ml的PBS，打入培養(yǎng)瓶內(nèi)。燒培瓶口， 來回晃動PBS100次后到掉PBS。重復(fù)此操作一次。 7.拿出培養(yǎng)基瓶子，燒瓶口和鑷子；用鑷子將塞子取出， 燒瓶口（至少10圈）。 8.用吸管吸取5ml-8ml的培養(yǎng)基打入培

12、養(yǎng)瓶內(nèi)，燒瓶口， 鑷子和蓋子； 9.蓋上蓋子，倒置顯微鏡下觀察，之后標(biāo)明名稱和日期， 酒精棉球擦瓶口和瓶身，放入培養(yǎng)箱內(nèi)即可。 注意： 1.打開培養(yǎng)箱時盡量不要說話； 2.步驟9中培養(yǎng)瓶放入培養(yǎng)箱時，應(yīng)把蓋子擰開少許。,31,傳代,1.把細(xì)胞培養(yǎng)瓶從培養(yǎng)箱中拿出，擰緊蓋子； 2.觀察瓶內(nèi)培養(yǎng)基的顏色，是否渾濁等；放在 倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長狀況。 3.放入超凈工作臺內(nèi)，點(diǎn)燃酒精燈，拿培養(yǎng)瓶 口在酒精燈火焰上轉(zhuǎn)兩圈以上，至少三秒。 4.取下蓋子，燒瓶口；倒掉培養(yǎng)基，燒瓶口； 5.拿出PBS瓶子，燒瓶口和鑷子；用鑷子將塞 子取出，燒瓶口（至少10圈）。,32,6.用吸管吸取3ml的PBS，打入培

13、養(yǎng)瓶內(nèi)。燒培養(yǎng) 瓶口，來回晃動PBS100次后到掉PBS。重復(fù)此 操作一次。 7.拿出胰酶瓶子，燒瓶口和鑷子；用鑷子將塞子取 出，燒瓶口（至少10圈）。 8.用吸管吸取1ml的胰酶，打入培養(yǎng)瓶內(nèi)，燒培養(yǎng) 瓶口和蓋子，蓋上蓋子； 9.拿出工作臺外，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞，然后 用酒精棉球擦瓶口及瓶身，放入培養(yǎng)箱內(nèi)；5分鐘 后取出；,33,10.在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的消化情況。若 細(xì)胞變成單個圓形，則可進(jìn)行傳代。 11.拿到工作臺內(nèi)，燒瓶口，取下蓋子，燒瓶 口。用吸管吸出胰酶，燒瓶口。 12.拿出培養(yǎng)基瓶子，燒瓶口和鑷子；用鑷子 將塞子取出，燒瓶口（至少10圈）。 13.用吸管吸取5ml的培養(yǎng)基

14、打入培養(yǎng)瓶內(nèi)， 用吸管吹打成單個細(xì)胞懸液。計(jì)數(shù)，分裝 即可。,34,凍存,1.把細(xì)胞培養(yǎng)瓶從培養(yǎng)箱中拿出，擰緊蓋子； 2.觀察瓶內(nèi)培養(yǎng)基的顏色，是否渾濁等；放在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長狀況。 3.放入超凈工作臺內(nèi)，點(diǎn)燃酒精燈，拿培養(yǎng)瓶口在酒精燈火焰上轉(zhuǎn)兩圈以上，至少三秒。 4.取下蓋子，燒瓶口；倒掉培養(yǎng)基，燒瓶口； 5.拿出PBS瓶子，燒瓶口和鑷子；用鑷子將塞子取出，燒瓶口（至少10圈）。,35,6. 用吸管吸取3ml的PBS，打入培養(yǎng)瓶內(nèi)。燒培養(yǎng)瓶口，來回晃動PBS100次后到掉PBS。重復(fù)此操作一次。 7. 拿出胰酶瓶子，燒瓶口和鑷子；用鑷子將塞子取出，燒瓶口（至少10圈）。 8. 用吸管

15、吸取1ml的胰酶，打入培養(yǎng)瓶內(nèi)，燒培養(yǎng)瓶口和蓋子，蓋上蓋子； 9. 拿出工作臺外，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞，然后用酒精棉球擦瓶口及瓶身，放入培養(yǎng)箱內(nèi)；5分鐘后取出； 10. 在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的消化情況。若細(xì)胞變成單個圓形，則可進(jìn)行傳代。,36,11.拿到工作臺內(nèi)，燒瓶口，取下蓋子，燒瓶 口。用吸管吸出胰酶，燒瓶口。 12.拿出培養(yǎng)基瓶子，燒瓶口和鑷子；用鑷子 將塞子取出，燒瓶口（至少10圈）。 13.用吸管吸取5ml的培養(yǎng)基打入培養(yǎng)瓶內(nèi)，用吸管 吹打成單個細(xì)胞懸液。 14.用吸管將細(xì)胞懸液移至5ml離心管中，蓋上蓋 子，在離心機(jī)內(nèi)離心，1500轉(zhuǎn)/分鐘，時間為15 分鐘。 15.離心結(jié)束后

16、，拿至工作臺內(nèi)，燒離心管口。去掉 塞子，燒管口。,37,16.棄上清液，加凍存液2ml 吹打，使細(xì)胞均勻混在凍存液中，再加3ml凍存液，用吸管吸出打入多個凍存管中，每管1.5ml。 17.蓋上蓋子，用封口膜封好,標(biāo)上細(xì)胞名稱和日期 . 18.凍存方式：430分鐘，-2015分鐘，-8060分鐘，最后轉(zhuǎn)移到液氮罐內(nèi)。 注意： 凍存管移動時要夾在冰塊中間。,38,復(fù)蘇,1. 取一敞口瓶，內(nèi)裝蒸餾水，放入電熱恒溫水槽中，溫度設(shè)置為39.0。 2. 等達(dá)到39.030分鐘后，用鑷子將欲復(fù)蘇的細(xì)胞從液氮管中取出，快速放入敞口瓶內(nèi)，晃動，使凍存管內(nèi)完全液化。 3. 用酒精擦拭凍存管，放入工作臺內(nèi)。 4.

17、用鑷子將封口膜夾掉，輕燒管口； 5. 用吸管吸出凍存管內(nèi)的細(xì)胞懸液，打入已裝有5ml新鮮培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶內(nèi)。,39,6. 燒瓶口，鑷子和蓋子；蓋上蓋子， 在倒置顯微鏡下觀察。 7. 用酒精棉球擦瓶口及瓶身，放入培養(yǎng)箱內(nèi). 注意： 步驟2中，蒸餾水不要沒過凍存管口 所有步驟結(jié)束過24小時后一定要換液；,40,MTT法,1.實(shí)驗(yàn)開始前，96孔板應(yīng)在超凈臺紫外燈下照射2個小時以上。 2.從培養(yǎng)箱中拿出培養(yǎng)瓶，觀察，加PBS，加胰酶消化，加培養(yǎng)基，計(jì)數(shù)。 （方法及步驟同傳代1-13步。） 3.加培養(yǎng)基，調(diào)整細(xì)胞濃度為10000個/200l. 4.加到96孔板內(nèi),每板6行8列共48孔,每孔200l. 5.

18、蓋上96孔板的蓋子，拿出工作臺，倒置顯微鏡下觀察，標(biāo)明名稱，序號和日期。,41,6. 用酒精棉球擦板，放入培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng)24小時。 7. 從培養(yǎng)箱中取出，鏡下觀察，拿到工作臺內(nèi)， 用200l的槍將孔內(nèi)的培養(yǎng)基吸出； 8. 加入不同濃度的藥物的無血清培養(yǎng)基,每孔200l。 9. 蓋上96孔板的蓋子，拿出工作臺，倒置顯微鏡下 觀察，用酒精棉球擦板，放入培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng)24 小時。 10.從培養(yǎng)箱中取出，鏡下觀察，拿到工作臺內(nèi)， 每孔加MTT液20l。,42,11.蓋上96孔板的蓋子，拿出工作臺，倒置顯微鏡下 觀察，用酒精棉球擦板，放入培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng)4小時。 12.取出96孔板，倒掉孔內(nèi)的液體，每孔加

19、 DMSO150l，放入酶標(biāo)儀內(nèi)，振蕩600秒，讀數(shù)即可。,43,實(shí)驗(yàn)用品的洗滌,橡膠，塑料用品 玻璃器皿,44,橡膠，塑料用品,用自來水沖洗后放入專用燒杯內(nèi),加入蒸餾水，使之淹沒物品稍許，放在電爐上加熱； 等水開時開始記時，三十分鐘后取下，倒掉燒杯內(nèi)的水，自來水沖洗3遍，蒸餾水沖洗2遍，放烤箱下層中烘干； 烘干后浸泡在鹽酸中，至少30分鐘； 將鹽酸倒掉，用自來水沖洗十遍，蒸餾水沖洗三遍，放入烤箱上層烘干 烘干后放入飯盒內(nèi)高壓，之后放烤箱上層再次烘干即可使用,45,玻璃器皿,用自來水沖洗三遍，用蒸餾水洗三遍，放入烤箱下層烘干， 放入清洗缸即酸缸內(nèi)，讓整個器皿沒入清洗液中 ,時間為過夜或者至少8

20、個小時以上. 取出器皿，用自來水沖洗十遍，再用蒸餾水沖洗三遍后，放入烤箱上層烘干 。 取出器皿，高壓后，放烤箱上層，再次烘干即可使用。,46,污染的處理及預(yù)防,按現(xiàn)代的觀念，凡是混入培養(yǎng)環(huán)境中對細(xì)胞生存產(chǎn)生有害的成分和造成細(xì)胞不純的異物都應(yīng)該視為污染。根據(jù)這一概念，組織培養(yǎng)污染物應(yīng)包括生物（真菌、細(xì)菌、病毒和支原體）、化學(xué)物質(zhì)（影響細(xì)胞生存、非細(xì)胞所需的化學(xué)成分）、細(xì)胞（非同種的其他細(xì)胞）。其中微生物最為多見。另外，隨著使用細(xì)胞種類增多，不同細(xì)胞交叉污染，尤其是Hela細(xì)胞的污染也時有發(fā)生，從而造成細(xì)胞不純。,47,一、污染途徑,污染物，特別是微生物常通過下列途徑進(jìn)入培養(yǎng)體系，造成污染 1 空

21、氣：空氣是微生物及塵埃顆粒傳播的主要途徑?？諝饬鲃有源?，如果培養(yǎng)操作場地于外界隔離不嚴(yán)格或消毒不充分，外界不潔空氣很容易進(jìn)入造成污染。因此，培養(yǎng)設(shè)施不能設(shè)在通風(fēng)場所。無菌操作應(yīng)在凈化臺內(nèi)進(jìn)行，工作時要帶口罩，以免因講話、咳嗽等使外界污染進(jìn)入操作面，造成污染。,48,2 器材：各種培養(yǎng)器皿、器械消毒不徹底和洗刷不干凈導(dǎo)致污染，另外需要對培養(yǎng)箱進(jìn)行定期消毒，防止形成污染 3 操作：實(shí)驗(yàn)操作無菌觀念不強(qiáng)，技術(shù)不熟練，使用污染的器皿或封瓶不嚴(yán)等，都可以造成污染。培養(yǎng)兩種細(xì)胞以上時，操作不規(guī)范，交叉使用吸管或培養(yǎng)液、瓶等有可能導(dǎo)致細(xì)胞交叉污染。 4 血清：有些血清在生產(chǎn)時就已經(jīng)被支原體或病毒等污染，變成

22、了污染。 5 組織樣本：原代培養(yǎng)的污染多數(shù)來源于組織樣本；取材時碘酒消毒后脫碘不徹底，可造成碘混入組織，細(xì)胞或培養(yǎng)液中，影響細(xì)胞細(xì)胞生長。,49,二、污染對培養(yǎng)細(xì)胞的影響及污染的檢測,由于體外培養(yǎng)細(xì)胞自身沒有抵抗污染的能力，而且培養(yǎng)基中的抗生素抗污染能力有限，因而培養(yǎng)細(xì)胞一旦發(fā)生污染多數(shù)將無法挽回。細(xì)胞污染早期或污染程度較輕時，如果能及時去除污染物，部分細(xì)胞有可能恢復(fù)、但是當(dāng)污染物持續(xù)存在培養(yǎng)環(huán)境中，輕者細(xì)胞生長緩慢，分類象減少，細(xì)胞變得粗糙，輪廓增強(qiáng)細(xì)胞漿出現(xiàn)顆粒、污染較嚴(yán)重，細(xì)胞增值停止，分裂象消失，細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)大量堆積物，細(xì)胞變圓、脫壁。,50,（一）細(xì)菌污染對培養(yǎng)細(xì)胞的影響及污染物的檢

23、測 常見的污染細(xì)菌有大腸桿菌、假單孢菌、葡萄球菌等。細(xì)菌污染初期由于培養(yǎng)體系的抗生素作用，其繁殖處于抑制狀態(tài)，細(xì)胞生長不受明顯影響，污染情況用倒置顯微鏡觀察不易判斷。懷疑培養(yǎng)細(xì)胞有細(xì)菌污染時，取10ml細(xì)胞懸液離心1000轉(zhuǎn)5分鐘，沉淀中加入無抗生素培養(yǎng)液2ml,將細(xì)胞放培養(yǎng)箱培養(yǎng)。,51,如果培養(yǎng)無真的細(xì)菌污染，24小時內(nèi)可以獲得陽性結(jié)果。當(dāng)污染的細(xì)菌量比較大或者細(xì)菌增殖到一定基數(shù)時，大約每20分鐘一代，會使培養(yǎng)系統(tǒng)中很快產(chǎn)生大量細(xì)菌，后者不僅可以消耗培養(yǎng)系統(tǒng)中的養(yǎng)分，還能釋放大量代謝產(chǎn)物。幾個小時后，增殖的細(xì)菌就可以導(dǎo)致培養(yǎng)液外觀渾濁，肉眼就可以判斷。細(xì)菌污染大多數(shù)可以改變培養(yǎng)液pH，使培

24、養(yǎng)液變渾濁、變色。用相差顯微鏡觀察，可見滿視野都是點(diǎn)狀的細(xì)菌顆粒，原來的清晰培養(yǎng)背景變得模糊，大量的細(xì)菌甚至可以覆蓋細(xì)胞，對細(xì)胞的生存構(gòu)成威脅。用青霉素、鏈霉素可以預(yù)防細(xì)菌污染有效。,52,（二）真菌污染對細(xì)胞的影響及污染物的檢測 微生物污染中以真菌最多，真菌種類繁多，形態(tài)各異，但是污染后易于發(fā)現(xiàn)，大多呈白色或淺黃色小點(diǎn)漂浮于培養(yǎng)液表面，肉眼可見；有的散在生長，鏡下可見呈絲狀、管狀、樹枝狀，縱橫交錯穿行于細(xì)胞之間。念珠菌和酵母菌卵圓形，散在細(xì)胞周邊和細(xì)胞之間生長。真菌生長迅速，能在短時間內(nèi)抑制細(xì)胞生長、產(chǎn)生有毒物質(zhì)殺死細(xì)胞?？拐婢苿︻A(yù)防和排除真菌污染有效。,53,（三）支原體污染對細(xì)胞影響

25、及污染物的檢測 細(xì)胞培養(yǎng)（特別是傳代細(xì)胞）被支原體污染是個世界性問題,是細(xì)胞培養(yǎng)最常見的、干擾試驗(yàn)結(jié)果的一種污染。但由于不易被察覺，有些污染的細(xì)胞仍在被應(yīng)用。研究表明，95以上是以下四種：口腔支原體（M.orale）、精氨酸支原體（M.arginini）、豬鼻支原體（M.hyorhinis）和萊氏無膽甾原體（A.laidlawii），為牛源性。以上是最常見的污染細(xì)胞培養(yǎng)的支原體菌群，但能夠污染細(xì)胞的支原體種類是很多的，國外調(diào)查證明，大約有二十多種支原體能污染細(xì)胞，有的細(xì)胞株可以同時污染兩種以上的支原體。據(jù)查，目前各實(shí)驗(yàn)室使用的二倍體細(xì)胞和傳代細(xì)胞中約有11%的細(xì)胞受到支原體污染。,54,污染來

26、源包括工作環(huán)境污染、操作者本身污染（一些支原體在人體是正常菌群）、培養(yǎng)基污染、污染支原體的細(xì)胞造成的交叉污染、實(shí)驗(yàn)器材帶來的污染和用來制備細(xì)胞的原始組織或器官的污染。支原體污染后，因?yàn)樗鼈儾粫辜?xì)胞死亡可以與細(xì)胞長期共存，培養(yǎng)基一般不發(fā)生渾濁，細(xì)胞無明顯變化，外觀上給人以正常感覺，實(shí)則細(xì)胞手到多方面潛在影響，如引起細(xì)胞變形，影響DNA合成，抑制細(xì)胞生長等。,55,細(xì)胞培養(yǎng)中，主要從以下幾個方面來預(yù)防支原體的污染： 控制環(huán)境污染； 嚴(yán)格實(shí)驗(yàn)操作； 細(xì)胞培養(yǎng)基和器材要保證無菌； 在細(xì)胞培養(yǎng)基中加入適量的抗生素。,56,支原體污染細(xì)胞后，特別是重要的細(xì)胞株，有必要清除支原體，常用方法有抗生素處理、抗

27、血清處理、抗生素加抗血清和補(bǔ)體聯(lián)合處理。支原體最突出的結(jié)構(gòu)特征是沒有細(xì)胞壁，一般來講，對作用于細(xì)胞壁生物合成的抗生素，如 -內(nèi)酰胺類、萬古霉素等完全不敏感；對多粘菌素（polymycin）、利福平、磺胺藥物普遍耐藥。對支原體最有抑制活性及常用于支原體感染治療的抗生素是四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類及一些氟喹諾酮；其他類抗生素如氨基糖苷類、氯霉素對支原體有較小抑制作用，所以常不用來作為支原體感染的化學(xué)治療劑。,57,（四）細(xì)胞交叉污染對細(xì)胞的影響及污染物的檢測 細(xì)胞培養(yǎng)中，細(xì)胞間交叉污染并不罕見，多是由于在培養(yǎng)中操作時各種細(xì)胞同時進(jìn)行，混雜使用器皿和液體所致，這種污染能使細(xì)胞的生長特性、形態(tài)特征等發(fā)生變化

28、，有些變化較輕、不易察覺，有些可能由于污染的細(xì)胞具有生長優(yōu)勢最終壓過原來細(xì)胞而導(dǎo)致細(xì)胞的生長抑制，最終死亡。常用觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)、分析生長特性和核型、檢測細(xì)胞的標(biāo)記物等方法檢測交叉污染的細(xì)胞,58,三、污染的預(yù)防:防止污染，預(yù)防是關(guān)鍵，預(yù)防措施應(yīng)該貫穿整個細(xì)胞培養(yǎng)的始終。,1.器皿準(zhǔn)備中的預(yù)防：用于細(xì)胞培養(yǎng)的器皿應(yīng)該嚴(yán)格消毒，做到真正潔凈；應(yīng)該無菌的物品，要做到消毒嚴(yán)格、真正無菌；器皿的運(yùn)輸、貯存過程中，要嚴(yán)格操作，謹(jǐn)防污染。,59,2.開始操作前的預(yù)防：應(yīng)當(dāng)按廠家規(guī)定，定期清洗或更換超凈臺的空氣濾網(wǎng)，請專職人員定期檢查超凈臺的空氣凈化標(biāo)準(zhǔn)；檢查培養(yǎng)皿是否有消毒標(biāo)志，有條件得實(shí)驗(yàn)室可以使用一次性

29、用品；檢查新配置的培養(yǎng)液，確認(rèn)無菌方可使用；操作前提前半小時啟動超凈臺的紫外燈消毒；操作應(yīng)戴口罩，消毒雙手。,60,3.操作過程中的預(yù)防；主要包括：超凈臺內(nèi)放置的所有培養(yǎng)瓶瓶口不能與風(fēng)向相逆，不允許用手觸及器皿的無菌部分，如瓶口和瓶塞內(nèi)側(cè)；在安裝吸管冒、開啟或封閉瓶口操作時要經(jīng)過酒精燈燒灼，并在火焰附件工作；吸取培養(yǎng)液、細(xì)胞懸液等液體時，應(yīng)專管專用，防止污染擴(kuò)大或造成培養(yǎng)物的交叉污染；使用培養(yǎng)液前，不易較早開啟瓶口；開瓶后的培養(yǎng)瓶應(yīng)保持斜位，避免直立；不再使用的培養(yǎng)液應(yīng)立即封口；培養(yǎng)的細(xì)胞在處理之前不要過早的暴露空氣中；操作時不要交談、咳嗽，以防唾沫和呼出氣流引發(fā)污染；操作完畢后應(yīng)將工作臺面整

30、理好，并消毒擦拭工作面，關(guān)閉超凈臺。,61,4.其他預(yù)防：及早凍存培養(yǎng)物；重要的細(xì)胞株傳代工作應(yīng)有兩個人獨(dú)立進(jìn)行；購入的未滅活血清應(yīng)采取56度水浴滅活30分鐘使血清的補(bǔ)體和支原體滅活；為了避免誘導(dǎo)抗藥細(xì)菌，應(yīng)定期更換培養(yǎng)系統(tǒng)的抗生素，或盡可能不用抗生素；對新購入的細(xì)胞株應(yīng)加強(qiáng)觀察，防止外來的污染源；定期消毒培養(yǎng)箱。,62,四、污染的排除,培養(yǎng)的細(xì)胞一旦污染應(yīng)及時處理，防止污染其他細(xì)胞。通常選高壓滅菌被污染的細(xì)胞，然后棄掉。如果有價值的細(xì)胞被污染，并且污染程度較輕，可以通過及時排除污染物，挽救細(xì)胞恢復(fù)正常。常用的排除微生物污染的方法有以下幾種：,63,1 抗生素排除法：抗生素是細(xì)胞培養(yǎng)中殺滅細(xì)菌

31、的主要手段。各種抗生素性質(zhì)不同，對微生物作用也不同，聯(lián)合應(yīng)用比單用效果好，預(yù)防性應(yīng)用比污染后應(yīng)用好；如果發(fā)生微生物污染后再使用抗生素，常難以根除。有的抗生素對細(xì)菌僅有抑制作用，無殺滅效應(yīng)。反復(fù)使用抗生素還能使微生物產(chǎn)生耐藥性，而且對細(xì)胞本身也有一定影響，因此有人主張盡量不用抗生素處理，當(dāng)然，一些有價值的細(xì)胞被污染后，仍需要用抗生素挽救，在這種情況下，可采用510倍于常用量的沖擊法，加入高濃度抗生素后作用2448小時，再換入常規(guī)的培養(yǎng)液，有時可以奏效。,64,2 加溫除菌：根據(jù)支原體耐熱性能差的特點(diǎn)。有人將受支原體污染的細(xì)胞置于41度中作用510小時（最長可以達(dá)18小時）殺滅支原體。但是41度對

32、細(xì)胞本身應(yīng)有較大影響，故在處理前，應(yīng)先進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)，確定最大限度殺傷支原體而對細(xì)胞影響較小的處理時間。 3 動物體內(nèi)接種：受微生物污染的腫瘤細(xì)胞可以接種到同種動物皮下或腹腔，借動物體內(nèi)免疫系統(tǒng)消滅掉微生物，腫瘤細(xì)胞卻能在體內(nèi)生長，待一定時間，從體內(nèi)取出再進(jìn)行培養(yǎng)繁殖。,65,4 與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)：在良好的體外培養(yǎng)條件下巨噬細(xì)胞可以存活710天，并可以分泌一些細(xì)胞因子支持其他細(xì)胞的科隆生長。與體內(nèi)情況相似，巨噬細(xì)胞在體外條件下仍然可以吞噬微生物并將其消化。利用96孔板將極少培養(yǎng)細(xì)胞與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)，可以在高度稀釋培養(yǎng)細(xì)胞、極大地降低微生物污染程度地同時，更有效地發(fā)揮巨噬細(xì)胞清除污染地效能。本方法與

33、抗生素聯(lián)合應(yīng)用效果更佳。,66,無菌操作注意事項(xiàng) 1. 操作前要洗手，進(jìn)入超凈臺后手要用75%酒精或0.2%新潔爾滅擦試。試劑等瓶口也要擦試。 2. 點(diǎn)燃酒精燈，操作在火焰附近進(jìn)行，耐熱物品要經(jīng)常在火焰上燒灼，金屬器械燒灼時間不能太長，以免退火，并冷卻后才能夾取組織，吸取過營養(yǎng)液的用具不能再燒灼，以免燒焦形成碳膜。 3. 操作動作要準(zhǔn)確敏捷，但又不能太快，以防空氣流動，增加污染機(jī)會。 4. 不能用手觸已消毒器皿的工作部分，工作臺面上用品要布局合理。 5. 瓶子開口后要盡量保持45斜位。 6. 吸溶液的吸管等不能混用。,67,End！,68,69,70,71,72,溶液的配制,PBS RPMI1640培養(yǎng)基 消化液 凍存液 清潔液 MTT 其它溶液,73,PBS配制,之后，加1000ml三蒸水,調(diào)節(jié)PH值在 7