1、第1章 酶,Enzyme,第一部分基礎(chǔ)復(fù)習(xí) 1.1 概述 1.2酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué),第二部分食品酶 1.3 酶的研究新方法 酶的分析新技術(shù) 1.4 酶促褐變 1.5 酶在食品加工中的 應(yīng)用,食品酶研究的內(nèi)容和意義,研究食品原料體內(nèi)酶的變化與作用。通過(guò)控制來(lái)減少食物貯藏時(shí)成分的損失，同時(shí)使食品具有更好的品質(zhì)。 研究酶學(xué)原理及酶制劑在食品工中的應(yīng)用。達(dá)到控制和改善品質(zhì)及貯藏性的目的。,1.1.1 酶的化學(xué)本質(zhì),酶是由生物活細(xì)胞產(chǎn)生的有催化能力的蛋白質(zhì)。 酶的組成 寡聚酶 酶蛋白 多酶體系 全酶輔酶 輔因子輔基 金屬離子,1.1.2 酶的分類,水解酶 氧化-還原酶 轉(zhuǎn)移酶 裂合酶 異構(gòu)酶 合成酶,1.1.

2、3酶活力P240,酶活力（enzyme activity)就是酶催化能力，用酶催化反應(yīng)的速度來(lái)表示。 在25及其他酶最適條件下，在1min內(nèi)1mol的底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的酶量稱為。 單位時(shí)間內(nèi)催化反應(yīng)生成產(chǎn)物的量稱為。 每毫克酶蛋白含有的酶活力單位。,A酶的國(guó)際單位（IU） B比活力 C酶活力單位,A,C,B,7.2.1 專一性機(jī)制: 7.2.2 高效性機(jī)制: 7.2.3 影響酶促反應(yīng)速度的因素,1.2 酶的反應(yīng)動(dòng)力學(xué),P240,誘導(dǎo)契合學(xué)說(shuō),降低反應(yīng)活化能,1.2.1影響酶促反應(yīng)速度的因素,在低底物濃度時(shí), 反應(yīng)速度與底物濃度成正比。 當(dāng)?shù)孜餄舛冗_(dá)到一定值，幾乎所有的酶都與底物結(jié)合后，反應(yīng)速度達(dá)

3、到最大值（Vmax），此時(shí)再增加底物濃度，反應(yīng)速度不再增加。 此曲線符合方程,1，底物濃度的影響,米氏,1.2.1.2酶濃度的影響,在底物濃度充足、反應(yīng)條件適宜時(shí)，反應(yīng)速度與酶濃度成 比。,正,1.2.1.3. 溫度的影響,最大。一方面是溫度升高，酶促反應(yīng)速度加快。另一方面，溫度升高，酶的高級(jí)結(jié)構(gòu)將發(fā)生變化或變性，導(dǎo)致酶活性降低甚至喪失。,大多數(shù)酶都有一個(gè)最適溫度。 在最適溫度條件下，反應(yīng)速度,因此，酶促反應(yīng)的最適溫度于酶活力的最適溫度。,高,1.2.1.4. pH 的影響,在一定的pH 下, 酶具有最大的催化活性,通常稱此pH 為最適 pH。,1.4 酶促褐變Enzymic Browning

4、,一定義和意義 酶促褐變當(dāng)果蔬受到損傷時(shí)，組織和氧接觸，由酶催化造成變色的作用。 意義: 利: 不利: 7.4.1 機(jī)理 7.4.2控制,茶葉、可可豆,影響食品色澤和風(fēng)味。,1.4.1 機(jī)理,什么酶？ 什么底物？ 什么產(chǎn)物？ 此酶的特性？ 反應(yīng)機(jī)理小結(jié)：主要是酚酶催化酚類物質(zhì)形成醌及其聚合物的結(jié)果。,多酚氧化酶,酚類物質(zhì),氧化成醌再聚合成褐色物。,需氧，高熱酸性可抑活。,什么產(chǎn)物與機(jī)制,Machanism of Enzymic Browning 植物中的酚類物質(zhì)在酚酶及過(guò)氧化物酶的催化下氧化成醌，醌再進(jìn)行非酶促反應(yīng)生成褐色的色素。,果蔬酶促褐變機(jī)理及酶促褐變抑制研究進(jìn)展,PPO的酶促褐變問(wèn)題已

5、經(jīng)研究了一個(gè)多世紀(jì)，很多問(wèn)題依然懸而未決，如：褐變機(jī)理3。 控制果蔬的酶促褐變，提高果蔬的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和外觀 品質(zhì)是人們長(zhǎng)期關(guān)注的問(wèn)題。理化方法雖然在一定程度上控制PPO活性，但果蔬的感官品質(zhì)、營(yíng)養(yǎng)被破壞。利用反義RNA技術(shù)、DNA雜交、PCR擴(kuò)增技術(shù)和轉(zhuǎn)基因技術(shù)修飾和控制轉(zhuǎn)基因植株中多酚氧化酶基因的表達(dá)，成為多酚氧化酶控制活性的新手段。利用X-射線結(jié)晶和定位誘變將揭開活躍位點(diǎn)的復(fù)雜機(jī)理,1.5 酶在食品加工中的應(yīng)用,1.5.1食品加工中常用的酶 1.5.1.1水解酶類 （1）淀粉酶 （8）果膠酶 （10）蛋白酶,1.5.2酶在食品加工中的應(yīng)用 1.5.1.1淀粉加工 1.5.1.3水果加工 1.

6、5.1.5肉蛋魚類加工,1.6 酶的研究新方法與分析新技術(shù) 一、酶的分離純化與活力測(cè)定 二、酶的催化反應(yīng)動(dòng)力學(xué) 三、酶在食品中的作用 四、食品加工中的固定化酶 五、 食品加工中的酶制劑 六、酶在食品分析中的應(yīng)用,一、酶的分離純化與活力測(cè)定,1、酶的分離純化 純度：研究酶的結(jié)構(gòu)、功能、生物學(xué)作用和理化性質(zhì)，對(duì)酶進(jìn)行鑒定，必須采用純酶，作為生化試劑和藥物酶對(duì)酶的純度要求也高。 分布：根據(jù)酶在體內(nèi)作用的部位，可以將酶分為胞外酶和胞內(nèi)酶兩大類。胞外酶易于分離，而胞內(nèi)酶存在于細(xì)胞內(nèi)，必須破碎細(xì)胞才能進(jìn)行分離。根據(jù)酶是蛋白質(zhì)這一特性，可采用提純蛋白質(zhì)的方法進(jìn)行分離純化。 活性溫度等條件：酶是生物活性物質(zhì)，

7、在提純時(shí)必須考慮盡量減少酶活力的損失，全部操作需要在低溫下進(jìn)行。一般在05范圍，當(dāng)用有機(jī)溶劑分級(jí)分離時(shí)應(yīng)在-15-20進(jìn)行。在抽提溶劑中加入EDTA可螯合重金屬，以防止酶失活；對(duì)于含-SH的酶蛋白，需要加入少量巰基乙醇防止-SH氧化。干燥常采用真空冷凍干燥，以減少酶活的損失。酶制品在一般在-20以下低溫保存。,酶活力（enzyme activity)就是酶催化能力，用酶催化反應(yīng)的速度來(lái)表示。 在25及其他酶最適條件下，在1min內(nèi)1mol的底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的酶量稱為。 單位時(shí)間內(nèi)催化反應(yīng)生成產(chǎn)物的量稱為。 每毫克酶蛋白含有的酶活力單位。,A酶的國(guó)際單位（IU） B比活力 C酶活力單位,A,C,B

8、,二、酶的催化反應(yīng)動(dòng)力學(xué) （一）、底物濃度的影響 ; (二)、pH對(duì)酶反應(yīng)速率影響;（三）、溫度對(duì)酶反應(yīng)速率的影響;（四）、酶濃度對(duì)酶反應(yīng)速率的影響 （五）、水活性對(duì)酶活力的影響 酶與蛋白質(zhì)一樣，反應(yīng)速率受水活性的影響，只有酶的水合作用達(dá)到一定程度時(shí)才顯示出活性。例如溶菌酶的水合作用已由紅外光譜和核磁共振譜得到證實(shí)，當(dāng)溶菌酶中蛋白質(zhì)含水量為0.2g/g蛋白質(zhì)時(shí)，酶開始顯示催化活性，當(dāng)水合程度達(dá)到0.4g/g蛋白質(zhì)時(shí)，在整個(gè)酶分子的表面形成單分子水層，此時(shí)酶的活性提高，當(dāng)含水量為0.7g/g蛋白質(zhì)時(shí)，溶菌酶活性達(dá)到極限，這樣才能保證底物分子擴(kuò)散到酶的活性部位。 -淀粉酶在aW0.8(2%水含量)

9、以上才顯示出水解淀粉的活力，當(dāng)水活性aW為0.95(12%水含量)時(shí)，酶的活力提高15倍。 (圖6-13)。,圖6-13 水分活度對(duì)酶活力的影響 磷酸酯酶催化卵磷脂水解 -淀粉酶催化淀粉水解,可以得出如下結(jié)論： 食品原料中水分含量低于1%2%才能抑制酶的活力； 采用有機(jī)溶劑替代部分水的方法，測(cè)定酶促反應(yīng)所需要的含水量，例如，以能與水混溶的甘油替代水，使混合溶劑中水含量為75%，此時(shí)脂肪氧合酶和過(guò)氧化物酶的活力減少，當(dāng)水分含量減少至20%和10%時(shí)；二者的酶活力降低至0(6-14圖) ，甘油的粘度和特殊效應(yīng)可能會(huì)影響酶的活力； 對(duì)于疏水性較強(qiáng)的酶，例如脂肪酶可以用與水不混溶的有機(jī)溶劑替代水討論不

10、同水分含量對(duì)酶活力的影響。以脂肪酶催化三丁酯轉(zhuǎn)移至各種醇中為例，將“干”的脂肪酸顆粒（0.48%水含量），分別懸浮于含水量為0.3、0.6、0.9和1.1%（W/W）的正丁醇中，其初始反應(yīng)速率分別為0.8、3.5、5和4mol酯轉(zhuǎn)移/h100mg脂肪酶。因此，豬胰脂肪酶在0.9%水分含量時(shí)具有最大的催化酯轉(zhuǎn)移速率。,圖6-14 水中甘油的含量對(duì)過(guò)氧化物酶（）和 脂肪氧合酶（）催化反應(yīng)速率的影響,有機(jī)溶劑對(duì)酶的催化作用：主要影響酶的穩(wěn)定性和可逆反應(yīng)進(jìn)行的方向，親水和疏水有機(jī)溶劑對(duì)酶的影響是不相同的。同水不能互溶的有機(jī)溶劑，因?yàn)槿軇?qiáng)烈的疏水作用，使酶的專一性發(fā)生改變，從催化水解轉(zhuǎn)向催化合成。例如

11、脂肪酶的“干”的顆粒(水分含量約1%)懸浮于與水不相溶的有機(jī)溶劑中時(shí)，酶催化酯基轉(zhuǎn)移的速率提高6倍以上，而水解速率則降低16倍。 脂肪酶在有機(jī)溶劑中由于構(gòu)象的變化還能夠形成立體專一性。 有的酶在有機(jī)溶劑中比在水相更穩(wěn)定，例如核糖核酸酶和溶菌酶，核糖核酸酶在水含量為6%時(shí)，其熱轉(zhuǎn)變溫度（Tm）為124，在145時(shí)半衰期為2.0h。當(dāng)增加水分含量時(shí)穩(wěn)定性降低，其稀溶液的Tm為61，而且酶的半衰期也同時(shí)縮短。 酶在水-與水混溶的有機(jī)溶劑體系中的熱穩(wěn)定性和催化活性：不同于水-與水不混溶的有機(jī)溶劑體系中的情形。例如蛋白酶催化酪蛋白水解，在5%乙醇-95%的緩沖液體系或5%乙腈-95%緩沖液體系中與僅在緩

12、沖溶液中相比較，均能使增加和減少，以及穩(wěn)定性降低。,增加和,（六）、激活劑對(duì)酶反應(yīng)速率的影響 凡是能提高酶活性的物質(zhì)，都稱為激活劑。其中大部分是離子和簡(jiǎn)單有機(jī)化合物，激活劑按分子大小分為（1）無(wú)機(jī)離子（2）中等大小的有機(jī)分子（3）具有蛋白質(zhì)性質(zhì)的大分子物質(zhì)能起到酶原激活的作用，使原來(lái)無(wú)活性的酶原轉(zhuǎn)變?yōu)橛谢钚缘拿浮?（七）、抑制劑對(duì)酶催化反應(yīng)速率的影響 抑制作用與變性作用：凡能使蛋白質(zhì)變性的任何作用都能使酶失活，例如剪切力、非常高的壓力、輻照或是與有機(jī)溶劑混溶。同時(shí)也可以通過(guò)對(duì)酶的主活性中心基團(tuán)修飾而使酶失活。在食品中，所有這些抑制方法都能有效控制酶活性。這種使酶活力喪失的作用稱為失活作用。 凡

13、使酶活力下降，但并不引起酶蛋白變性的作用稱為抑制作用。所以，抑制作用不同于變性作用。實(shí)際上在食品中存在一些非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，如酚類化合物和芥子油，它們可以非選擇性地抑制較寬的酶譜。此外，食品中因環(huán)境污染帶來(lái)的重金屬、殺蟲劑和其他的化學(xué)物質(zhì)都可成為酶的抑制劑。,三、 酶在食品中的作用,酶對(duì)于食品的質(zhì)量有著非常重要的作用。實(shí)際上，沒有酶就沒有生命，也就沒有食品。食物的生長(zhǎng)和成熟過(guò)程無(wú)不與酶活性相關(guān)，而且，甚至有時(shí)生長(zhǎng)的環(huán)境條件也影響包括酶在內(nèi)的食物的組成成分。 采收、保藏和加工條件都將顯著影響食品變化的速度，從而影響食品的品質(zhì)。由酶催化的反應(yīng)，有的是需宜的，有的則是不需宜的。因此，控制這些酶的活力則

14、有利于提高食品的質(zhì)量和延長(zhǎng)貨架期。 食品加工中添加外源酶以改善食品的特性和用于許多產(chǎn)品的生產(chǎn)。早在古代，人們便開始不知不覺的在食品加工過(guò)程中采用酶催化反應(yīng)，這些酶可能是存在于食品中的內(nèi)源酶，也可能來(lái)自微生物。目前已有幾十種酶成功地在食品工業(yè)，例如，葡萄糖、飴糖、果葡糖漿的生產(chǎn)、蛋白質(zhì)制品加工、果蔬加工、食品保鮮以及改善食品的品質(zhì)和風(fēng)味等方面得到應(yīng)用。,（一）、內(nèi)源酶在食品質(zhì)量中的作用 1、顏色 食品的色澤：是眾多消費(fèi)者首先關(guān)注的感官指標(biāo)和是否接受的標(biāo)準(zhǔn)。任何食品，無(wú)論是新鮮的還是經(jīng)過(guò)加工的，都具有代表自身特色和本質(zhì)的色澤，多種原因乃至環(huán)境條件的改變，即可導(dǎo)致顏色的變化，其中酶是一個(gè)敏感的因素。

15、新鮮的瘦肉應(yīng)該是紅色，而不是紫色或褐色。因?yàn)榧t色是肌肉的主要色素，僅來(lái)自氧合肌紅蛋白。只有當(dāng)氧合肌紅蛋白發(fā)生氧化還原反應(yīng)或其他反應(yīng)，才能改變?nèi)獾念伾缂∪庵械拿复呋?jìng)爭(zhēng)氧的反應(yīng)，使之改變了氧合肌紅蛋白的氧化-還原狀態(tài)和水分含量，從而使肉的顏色由原來(lái)的紅色轉(zhuǎn)變?yōu)槊撗跫〖t蛋白的紫色和高鐵血紅蛋白的褐色。 蓮藕由白色變?yōu)榉奂t色后，其品質(zhì)下降，這是由于蓮藕中的多酚氧化酶和過(guò)氧化物酶催化氧化了蓮藕中的多酚類物質(zhì)的結(jié)果。 顏色變化都與食品中的內(nèi)源酶有關(guān)，其中最主要的是脂肪氧合酶(Lipoxygenase)、葉綠素酶(Chlorophyllase)和多酚氧化酶(Polyphenol oxidase)。,2

16、、質(zhì)地 質(zhì)地對(duì)于食品的質(zhì)量是一項(xiàng)致關(guān)重要的指標(biāo)，水果和蔬菜的質(zhì)地主要與復(fù)雜的碳水化合物有關(guān)，例如果膠物質(zhì)、纖維素、半纖維素、淀粉和木質(zhì)素。然而影響各種碳水化合物結(jié)構(gòu)的酶可能是一種或多種，它們對(duì)食品的質(zhì)地起著重要的作用。如水果后熟變甜和變軟，是酶催化降解的結(jié)果。 蛋白酶的作用可使動(dòng)物和高蛋白植物食品的質(zhì)地變軟。,（1）、果膠酶（復(fù)習(xí)） 果膠酶（pectic enzymes）有3種類型，它們作用于果膠物質(zhì)都產(chǎn)生需宜的反應(yīng)。其中果膠甲酯酶(pectin methylesterase)和聚半乳糖醛酸酶(polygalacturonase)存在于高等植物和微生物中，而果膠酸裂解酶(pectate lya

17、ses)僅在微生物中發(fā)現(xiàn)。 果膠甲酯酶(果膠 果膠基水解酶，EC 3.1.1.11)水解果膠的甲酯鍵，生成果膠酸和甲醇。,果膠甲酯酶又稱為果膠酯酶(Pectinesterase)、果膠酶(Pectase)、脫甲氧基果膠酶(Pectin demethoxylase)。當(dāng)有二價(jià)金屬離子，例如Ca2+存在時(shí)，果膠甲酯酶水解果膠物質(zhì)生成果膠酸，由于Ca2+與果膠酸的羧基發(fā)生交聯(lián)，從而提高了食品的質(zhì)地強(qiáng)度。,聚半乳糖醛酸酶(聚-1,4-半乳糖醛酸苷 聚糖-水解酶，EC 3.2.1.15)水解果膠物質(zhì)分子中脫水半乳糖醛酸單位的-1,4-糖苷鍵。,聚半乳糖醛酸酶有內(nèi)切酶和外切酶兩種類型存在，外切型是從聚合物

18、的末端糖苷鍵開始水解，而內(nèi)切型是作用于分子內(nèi)部。由于植物中的果膠甲酯酶能迅速裂解果膠物質(zhì)為果膠酸，因此關(guān)于植物中是否同時(shí)存在聚半乳糖醛酸酶(作用于果膠酸)和聚甲基半乳糖醛酸酶(作用于果膠)，目前仍然有著不同的觀點(diǎn)。聚半乳糖醛酸酶水解果膠酸，將引起某些食品原料物質(zhì)(如番茄)的質(zhì)地變軟。,（2）、纖維素酶和戊聚糖酶（復(fù)習(xí)） 眾所周知，樹和棉花中富含纖維素，而水果、蔬菜中含量卻很少。纖維素在細(xì)胞結(jié)構(gòu)中起著重要的作用。關(guān)于纖維素酶（cellulases）在豆類變軟中的作用尚無(wú)定論。但是在果蔬汁加工中卻常利用纖維素酶改善其品質(zhì)。關(guān)于微生物纖維素酶的研究報(bào)道較多，主要在于它能將纖維素轉(zhuǎn)化為可溶性葡萄糖的潛

19、在能力。半纖維素存在于高等植物中，它是木糖、阿拉伯糖或木糖與阿拉伯糖以及少量其他戊糖和己糖聚合而成的聚合物。 戊聚糖酶(Pentosanases)存在于微生物和一些高等植物中，能夠水解木聚糖、阿拉伯聚糖和木糖與阿拉伯糖的聚合物為小分子化合物。在小麥中存在少數(shù)濃度很低的內(nèi)切和外切水解戊聚糖酶，然而對(duì)它們的特性了解較少。 （3）、淀粉酶（復(fù)習(xí)） 淀粉酶(Amylases)不僅存在于動(dòng)物中，而且也存在于高等植物和微生物中，能夠水解淀粉。因此，食品在成熟、保藏和加工過(guò)程中淀粉被降解也就不足為奇了。淀粉在食品中主要提供粘度和質(zhì)地，如果在食品的貯藏和加工中淀粉被淀粉酶水解，將顯著影響食品的品質(zhì)。淀粉酶包括

20、-淀粉酶，-淀粉酶和葡糖淀粉酶三種主要類型，此外還有一些降解酶。表6-7列出了某些降解酶,表6-7 一些淀粉和糖原降解的酶,（4）、蛋白酶 蛋白酶在食品生產(chǎn)中，不僅用于提高食品的質(zhì)地和風(fēng)味，而且也常用于肉制品和乳制品的加工， 例如利用凝乳酶形成酪蛋白凝膠制造干酪。這些酶可以從動(dòng)物、植物或微生物中分離得到。 當(dāng)明膠中加入菠蘿，由于存在于菠蘿中的菠蘿蛋白酶的作用使之不能形成凝膠。 組織蛋白酶存在于動(dòng)物組織細(xì)胞的溶菌體內(nèi)，在酸性pH具有活性，當(dāng)動(dòng)物宰后其pH下降，這些酶釋放出來(lái)，可能導(dǎo)致肌肉細(xì)胞中的肌原纖維及胞外結(jié)締組織分解。 啤酒中的沉淀與蛋白質(zhì)沉降有關(guān)，可以通過(guò)加入植物蛋白酶水解消除。特別應(yīng)該強(qiáng)

21、調(diào)的是，利用酶水解蛋白質(zhì)應(yīng)該盡量避免產(chǎn)生苦味肽或氨基酸。,3、風(fēng)味（復(fù)習(xí)） 鑒定酶在產(chǎn)生食品風(fēng)味的生物合成途徑和形成不需宜風(fēng)味的歷程，同樣也是相當(dāng)困難的，許多風(fēng)味物質(zhì)的形成都與多種酶的作用途徑有關(guān)。食品在加工和貯藏過(guò)程中酶還可以改變食品的風(fēng)味或增色，特別是風(fēng)味酶的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用，使之更能真實(shí)的讓風(fēng)味再現(xiàn)、強(qiáng)化和改變。例如，將奶油風(fēng)味酶作用于含乳脂的巧克力、冰淇淋、人造奶油等食品，可增強(qiáng)這些食品的奶油風(fēng)味。 食品在加工和貯藏過(guò)程中，由于酶的作用可能使原有的風(fēng)味減弱或失去，甚至產(chǎn)生異味。例如不恰當(dāng)?shù)臒釥C處理或冷凍干燥，由于過(guò)氧化物酶、脂肪氧合酶等的作用，會(huì)導(dǎo)致青刀豆、玉米、蓮藕、冬季花菜和花椰菜等產(chǎn)生

22、明顯的不良風(fēng)味。即使經(jīng)熱處理后的過(guò)氧化物酶，當(dāng)在常溫下保存，酶活力仍能部分恢復(fù)。 過(guò)氧化物酶的再生是它又一個(gè)重要特征，這一點(diǎn)對(duì)于新鮮水果和蔬菜貯藏是特別值得注意的。過(guò)氧化物酶是一種非常耐熱的酶，通常將過(guò)氧化物酶作為一種控制食品熱處理的溫度指示劑。例如，過(guò)氧化物酶能導(dǎo)致維生素C的氧化降解。當(dāng)不飽和脂肪酸不存時(shí)，它能催化胡蘿卜素和花色苷失去顏色，過(guò)氧化物酶還能促進(jìn)不飽和脂肪酸的過(guò)氧化物降解，產(chǎn)生揮發(fā)性的氧化風(fēng)味化合物。,4、營(yíng)養(yǎng)質(zhì)量 酶對(duì)食品營(yíng)養(yǎng)影響的研究相對(duì)報(bào)道較少。已知脂肪氧合酶氧化不飽和脂肪酸，會(huì)引起亞油酸、亞麻酸和花生四烯酸這些必需脂肪酸含量降低，同時(shí)產(chǎn)生過(guò)氧自由基和氧自由基，這些自由基將

23、使食品中的類胡蘿卜素(維生素A的前體物質(zhì))、生育酚(維生素E)、維生素C和葉酸含量減少，破壞蛋白質(zhì)中的半胱氨酸、酪氨酸、色氨酸和組氨酸殘基，或者引起蛋白質(zhì)交聯(lián)。 一些蔬菜(如西葫蘆)中的抗壞血酸能夠被抗壞血酸酶破壞。 硫胺素酶會(huì)破壞氨基酸代謝中必需的輔助因子硫胺素。 此外，存在于一些微生物中的核黃素水解酶能降解核黃素。 多酚氧化酶不僅引起褐變，使食品產(chǎn)生不需宜的顏色和味道，而且還會(huì)降低蛋白質(zhì)中的賴氨酸含量，造成營(yíng)養(yǎng)價(jià)值損失。,四、 食品加工中的固定化酶 酶的固定化是20世紀(jì)50年代發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)技術(shù)，人們基于生物體內(nèi)的酶固定在細(xì)胞壁和膜的現(xiàn)象，提出酶的固定化，希望酶能重復(fù)使用，同時(shí)又能穩(wěn)定酶、

24、改變酶的專一性、提高酶活力，從而改善酶的各種特性。 酶的固定化，可以通過(guò)將酶包裹于聚合基質(zhì)或連接于載體分子而限制酶的移動(dòng)；也可以采用酶的交聯(lián)，通過(guò)蛋白質(zhì)交聯(lián)或無(wú)活性材料的加入，從而產(chǎn)生無(wú)數(shù)不同材料的固定方法；連接于合成材料載體上；最近還報(bào)道了交聯(lián)酶晶體的方法。 固定化酶依不同用途有顆粒、線條、薄膜和酶管等形狀，其中顆粒狀占絕大多數(shù)。食品工業(yè)上固定化酶的使用，能將酶和反應(yīng)物分開，使之產(chǎn)物不含酶，因此不需要加熱使酶失活，有助于提高食品的品質(zhì)，同時(shí)也能產(chǎn)生更大的經(jīng)濟(jì)效益。,固定化酶盡管有許多優(yōu)點(diǎn)，但是真正用于食品加工中的卻很少，然而在食品分析中應(yīng)用較多。 淀粉轉(zhuǎn)化為果糖是最有意義的體系。在淀粉轉(zhuǎn)化的

25、過(guò)程中需要將淀粉顆粒加熱到105使之被破壞，但是由于淀粉溶漲，溶液的粘度太高，不利于酶的催化反應(yīng)進(jìn)行，如果此時(shí)使用熱穩(wěn)定性相對(duì)較高的地衣形芽孢桿菌(Bacillus lichenformis)產(chǎn)生的-淀粉酶，將淀粉水解到DP=10，但是，在如此高的溫度下，淀粉和溶劑中的任何微生物都會(huì)遭到破壞，因此，上述途徑毫無(wú)實(shí)際意義。如果將葡糖淀粉酶和葡萄糖異構(gòu)酶固定在柱狀反應(yīng)器上，對(duì)淀粉進(jìn)行水解和異構(gòu)化催化反應(yīng)，則是十分有利的，而且相對(duì)較穩(wěn)定，至于柱子的污染和再生也不存在問(wèn)題。 此外，在食品加工中應(yīng)用的還有氨?；D(zhuǎn)移酶(aminoacylase)、天冬氨酸酶(aspartase)、富馬酸酶(fumaras

26、e)和-半乳糖苷酶(-galactosidase)等固定化酶。一些國(guó)家將乳糖酶固定在載體柱上，用以水解牛奶中的乳糖為半乳糖和葡萄糖，生產(chǎn)不含乳糖的牛奶以滿足乳糖酶缺乏的人群的需要。,固定化酶在食品中的應(yīng)用,五、 食品加工中的酶制劑 自然界有許許多多的生物質(zhì)，例如淀粉、纖維素、木質(zhì)素、脂類、核酸和蛋白質(zhì)需要轉(zhuǎn)化，那么首先需要的是淀粉酶、纖維素酶、木質(zhì)素過(guò)氧化物酶、脂肪酶、核酸酶和蛋白酶，其需要量是如此之大。然而存在的主要問(wèn)題是以上例舉的潛在底物的不溶性或溶解性差，使酶不能有效催化。雖然有些方法可以增加溶解度和水解速率，但是需要消耗價(jià)值昂貴的能量，使之在目前不經(jīng)濟(jì)。在生物質(zhì)的轉(zhuǎn)化過(guò)程中必須是環(huán)境上

27、可接受的，而且產(chǎn)品是無(wú)害的。 在食品加工中所用的酶制劑，目前已有幾十種。例如葡萄糖、飴糖、果葡糖漿等甜味劑與啤酒、醬油等的生產(chǎn)，蛋白質(zhì)制品和果蔬的加工，乳制品和焙烤食品中的應(yīng)用，食品保鮮以及食品品質(zhì)和風(fēng)味的改善等。應(yīng)用的酶制劑主要有-淀粉酶、糖化酶、蛋白酶、葡萄糖異構(gòu)酶、果膠酶、脂肪酶、纖維素酶和葡萄糖氧化酶等，這些酶主要來(lái)自可食的或無(wú)毒的植物、動(dòng)物，以及非致病、非產(chǎn)毒的微生物。世界食品用酶有50%以上是由Novo Nordisk公司提供的，其中有60%的酶是由基因改組的微生物生產(chǎn)的，但必須指出，對(duì)于基因重組的酶在食品工業(yè)中應(yīng)用要進(jìn)行嚴(yán)格的安全評(píng)價(jià)，目前食品工業(yè)中主要應(yīng)用的酶制劑見表6-8。,

28、表6-8 食品工業(yè)中應(yīng)用的酶制劑,(一)、甜味劑生產(chǎn)使用的酶制劑 玉米淀粉的轉(zhuǎn)化已經(jīng)有許多成功的產(chǎn)品，例如采用-淀粉酶、糖化酶和葡萄糖異構(gòu)酶催化玉米淀粉生產(chǎn)不同聚合度的糖漿、葡萄糖和果糖以及飴糖、麥芽糖等。在這些甜味劑的生物催化加工中，酶起著極為關(guān)鍵的作用，因此，必須保證酶的高度專一性，同時(shí)除去影響酶作用的有毒成分，使之得到理想的食品配料和滿足食品加工所需的功能特性。 例如淀粉在糖化過(guò)程中所采用的-淀粉酶和糖化酶要求達(dá)到一定的純度，應(yīng)不含或盡量少含葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶，因?yàn)槠咸衍辙D(zhuǎn)移酶會(huì)生成不需要的異麥芽糖。 在甜味劑的生物技術(shù)生產(chǎn)中，高果糖玉米糖漿的生產(chǎn)就是一個(gè)成功的實(shí)例。生產(chǎn)過(guò)程使用的酶都是固定

29、化的，因?yàn)?淀粉酶固定化后，不存在外部擴(kuò)散限制，可以多次連續(xù)反應(yīng)，因此只有通過(guò)酶的固定化才能提高酶的耐熱性。表6-9列出了生物催化生產(chǎn)的某些甜味劑。,(二)、纖維素酶和果膠酶在食品加工中的應(yīng)用 （復(fù)習(xí)） 纖維素酶的作用是水解纖維素，增加其溶解度和改善風(fēng)味，例如在焙烤食品、水果和蔬菜泥生產(chǎn)、茶葉加工和土豆泥的生產(chǎn)中經(jīng)常使用。目前的纖維素酶主要是由微生物生產(chǎn)的，而且非常有效，它的結(jié)構(gòu)和功能可以通過(guò)基因或克隆確定。,(三)、脂肪酶在食品加工中的作用（復(fù)習(xí)） 脂肪酶水解三酰甘油為相應(yīng)的脂肪酸、甘油單酯、甘油雙酯和甘油。根據(jù)立體專一性將脂肪酶分為1，3-型專一性、2-型專一性或非專一性脂肪酶。脂肪酶廣泛

30、分布在植物、動(dòng)物和微生物中，一般是以液體形式存在，固體脂肪酶催化水解較慢、脂肪酶主要用于食品的特殊風(fēng)味形成，例如奶酪、面包以及焙烤食品的保鮮。,（四）、蛋白質(zhì)食品加工中使用的酶制劑 蛋白酶一般來(lái)源于動(dòng)物、植物和微生物，不同來(lái)源的蛋白酶在反應(yīng)條件和底物專一性上有很大差別。在食品加工中應(yīng)用的蛋白酶主要有中性和酸性蛋白酶。這些蛋白酶包括木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、無(wú)花果蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、凝乳酶、枯草桿菌蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶等。 蛋白酶催化蛋白質(zhì)反應(yīng)后生成小肽和氨基酸，有利于人體消化和吸收。蛋白質(zhì)水解后溶解度增加，其他功能特性例如乳化能力和起泡性也隨之改變。如果蛋白質(zhì)的平均疏水性較高，則水解可能

31、產(chǎn)生苦味物質(zhì)。因此，加工過(guò)程中必須控制酶對(duì)蛋白質(zhì)的水解程度?；蛘邘追N蛋白酶共同作用，使苦味肽進(jìn)一步分解，以除去苦味。 通常利用木瓜蛋白酶或菠蘿蛋白酶配制肉類嫩化劑，分解肌肉結(jié)締組織的膠原蛋白。醬油和豆?jié){生產(chǎn)中，利用蛋白酶催化大豆水解，不僅使生產(chǎn)周期大大縮短，而且還可提高蛋白質(zhì)的利用率和改善產(chǎn)品風(fēng)味。此外，在牛肉汁和雞汁的生產(chǎn)中常用蛋白酶提高產(chǎn)品收率，如果將酸性蛋白酶在中性pH條件下處理凍魚類，可以脫除腥味。凝乳酶水解牛奶中的-酪蛋白生產(chǎn)干酪。在啤酒發(fā)酵完后，添加木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶或霉菌酸性蛋白酶降解蛋白質(zhì)，以防止啤酒渾濁，延長(zhǎng)啤酒的貨架期。,酶在食品分析中的應(yīng)用 （復(fù)習(xí)為主） 酶法分析是一

32、種經(jīng)常采用的方法，相對(duì)化學(xué)分析具有快速、專一、高靈敏度和高精確度等優(yōu)點(diǎn)。通常的食品分析需要對(duì)樣品進(jìn)行分離、純化，特別是對(duì)含量很低的化合物，往往會(huì)帶來(lái)較大誤差。 然而采用酶法分析卻無(wú)需將待測(cè)物和其他組分分離，例如測(cè)定血液、尿和植物中的葡萄糖含量，不需要任何分離步驟，只要除去干擾吸光度的不溶物，即可以直接采用葡萄糖氧化酶比色。酶的催化反應(yīng)的條件一般較溫和，大多數(shù)在接近室溫和中性pH條件下進(jìn)行，僅需要在幾分鐘內(nèi)即可完成。因此，可以避免或限制非酶引起的化合物變化。對(duì)于非需宜的酶促反應(yīng)可以通過(guò)污染或失活的方法除去。固定化酶由于能重復(fù)使用，在食品分析中應(yīng)用較廣，目前使用的有固定化酶柱，酶電極，含酶的薄片和

33、酶聯(lián)免疫分析(ELISA)。 酶法分析中最好選擇分光光度法和電化學(xué)方法測(cè)定反應(yīng)物和底物。當(dāng)這兩種方法不適用時(shí)，可以采用復(fù)合酶分析。復(fù)合反應(yīng)中包括一個(gè)輔助反應(yīng)和一個(gè)指示劑反應(yīng)，前者是將食品成分中的反應(yīng)物轉(zhuǎn)變?yōu)楫a(chǎn)物，后者涉及到一個(gè)指示酶或它的反應(yīng)物或產(chǎn)物，在整個(gè)反應(yīng)中是形成還是分解是很容易分析的。在大多數(shù)情況下，指示劑的反應(yīng)是在輔助反應(yīng)之后發(fā)生。,(一)、被測(cè)化合物是酶的底物（復(fù)習(xí)） 當(dāng)被測(cè)化合物是酶的底物時(shí)，根據(jù)底物消耗的情況，可以分別采用終點(diǎn)測(cè)定法和動(dòng)力學(xué)的方法。 1、終點(diǎn)測(cè)定法 終點(diǎn)測(cè)定法又稱為總的變化方法(圖6-19)，只有當(dāng)反應(yīng)進(jìn)行比較完全時(shí)該方法才是一種可靠的分析方法。根據(jù)反應(yīng)前后酶反

34、應(yīng)體系的吸光度或熒光強(qiáng)度的總變化，測(cè)定產(chǎn)物(或底物)的量。與動(dòng)力學(xué)方法比較，食品中待分析的底物濃度絕對(duì)不能低于酶催化輔助反應(yīng)的米氏常數(shù)。當(dāng)酶反應(yīng)遵循一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)時(shí)，反應(yīng)速率是很容易計(jì)算的。,(二)、被測(cè)定的化合物是酶的激活劑或抑制劑 （復(fù)習(xí)）,(三)、食品熱燙和滅菌效果的酶指示劑 酶是鑒定食品熱處理的理想指示劑。當(dāng)然，這并不完全是測(cè)定酶活的真正意義，實(shí)際上在對(duì)未加工食品的品質(zhì)評(píng)價(jià)、優(yōu)化特定食品中的加工參數(shù)、以及酶制劑使用之前的分析，酶活的測(cè)定都是十分重要的。 蔬菜和水果熱燙是一種溫和的熱處理，主要是為了防止酶引起的食品變質(zhì)和貯藏過(guò)程中微生物生長(zhǎng)。因此食品的有限加工是為了使食品在12周內(nèi)冷凍保

35、藏，或干制品貯存12年能保證安全和質(zhì)量。蔬菜中的微生物在低溫下比大多數(shù)酶更易破壞。因此，食品在冷凍和解凍過(guò)程中，酶會(huì)因?yàn)榧?xì)胞的完整性被破壞而釋放出來(lái)。這樣，就可以根據(jù)測(cè)定釋放出的酶的酶活力，檢測(cè)食品原料在冷凍和解凍時(shí)的質(zhì)量變化。 同樣也可以根據(jù)溫和熱處理和滅菌前后酶活力的變化，指示品質(zhì)的變化和熱處理是否充分。例如水果和蔬菜中的過(guò)氧化物酶，牛奶制品和火腿中的堿性磷酸酶，蛋品中的-乙酰氨基葡萄糖苷酶，盡管它們對(duì)食品質(zhì)量不會(huì)帶來(lái)影響，然而由于這些酶相對(duì)其他酶具有更高的熱穩(wěn)定性，而且又容易正確測(cè)定它們的酶活力，因而它們是很重要的指示劑。,表6-11 評(píng)價(jià)食品質(zhì)量的酶指示劑,實(shí)例：酶法制備牡蠣生物活性肽

36、,牡蠣營(yíng)養(yǎng)豐富，生理活性物質(zhì)含量高，產(chǎn)量日益增加，從中分離提取出生理活性物質(zhì)并對(duì)其進(jìn)行功能研究，開發(fā)海洋食品及海洋藥物，有助于推動(dòng)我國(guó)海洋產(chǎn)業(yè)的迅速發(fā)展。生物活性肽是指有特殊生理功能的肽類物質(zhì)，是世界上藥物及保健品研究的熱點(diǎn)。 按來(lái)源，生物活性肽可分為天然存在的活性肽和蛋白質(zhì)酶解活性肽。天然存在的活性肽包括肽類抗生素、激素等生物體的次級(jí)代謝產(chǎn)物以及各種組織、骨胳、肌肉、免疫系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)中存在的活性肽，這些活性肽大部分或含量微少，或提取難，不足以大量生產(chǎn)供給所需;化學(xué)人工合成又費(fèi)時(shí)費(fèi)力，成本昂貴。因此，人們更多地把目光投向開發(fā)蛋白酶解產(chǎn)物這條途徑上來(lái)。種類有降血壓肽、促進(jìn)礦物質(zhì)吸

37、收的肽、抗菌肽、嗎啡肽、抗血栓肽、機(jī)體防御功能肽、抗氧化性肽、抗癌肽等。隨著蛋白質(zhì)生物化學(xué)、生理學(xué)與營(yíng)養(yǎng)學(xué)的發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)經(jīng)消化道酶的作用后，并非僅以氨基酸的形式吸收，更多的是以低肽(如二肽、三肽等)式直接吸收，而且二肽和三肽的吸收速度比同一組成的氨基酸快。目前通過(guò)蛋白酶解生產(chǎn)的活性肽主要來(lái)源于陸地的蛋白源，如牛乳酪蛋白、大豆蛋白、玉米醇溶蛋白等。而來(lái)自海洋蛋白源酶解的活性肽非常少。,1、牡蠣蛋白酶解工藝過(guò)程 采用組織搗碎機(jī)制備肉勻漿，然后取一定量的勻漿，按約1:1的比例加水，根據(jù)底物中的蛋白質(zhì)含量添加適量的酶，控制體系條件為各種酶的最適作用條件，通過(guò)適當(dāng)?shù)姆绞?如添加堿或酸)保持條件的

38、恒定，水解一定時(shí)間后，加熱至90滅酶l0min，冷卻至室溫后調(diào)節(jié)體系pH至等電點(diǎn)4.0，靜置20分鐘，以1.28 X 104g離心15min，取上清液。 2、氨基酸組成分析 氨基酸自動(dòng)分析儀法:將牡蠣樣品置于水解管中，加入6mol/L的HCl溶液，真空封 口，在110下水解24hr，冷卻后定容、過(guò)濾、蒸干，再加入0.02mo1/L的HCl溶液在空氣中放置30min，上機(jī)測(cè)定除色氨酸以外的氨基酸含量。另一部分樣品5mol/L的NaOH溶液(含5%的氯化亞錫)水解20hr，中和，取濾液上機(jī)測(cè)定色氨酸的含量。 3、Sephadex G15凝膠過(guò)濾色譜分析 用Sephadex G-15初步分析牡蝠酶解

39、產(chǎn)物的相對(duì)分子質(zhì)量分布 凝膠柱規(guī)格:1.6 X 100 （ cm）洗脫液流速:21. 30mL/hr 檢測(cè)波長(zhǎng):280nm記錄儀:3057型便攜式記錄儀 檢測(cè)儀:FH8802-2紫外檢測(cè)儀洗脫液:醋酸一醋酸鈉緩沖溶液(pH4, O.1M),4、牡蠣肉的一般營(yíng)養(yǎng)成分 牡蠣肉的全成分分析結(jié)果見表2-1。由表2-1可以看出，蛋白質(zhì)含量為43.95%(對(duì)干基)，是牡蝠肉中的主要成分。糖原含量達(dá)到24.36%(對(duì)干基)，為牡蠣肉中含量第二的物質(zhì)。糖原是組織的能源儲(chǔ)備形式，是體力、腦力活動(dòng)及持久力的物質(zhì)保證，具有抗疲勞的功效。補(bǔ)充糖原可改善人心臟及血液循環(huán)功能，并增強(qiáng)肝臟功能，有保肝作用。牡蠣中的糖原可直

40、接被機(jī)體吸收，從而減輕胰腺負(fù)擔(dān)，因此對(duì)糖尿病的防治十分有益。牡蠣肉的脂肪含量為10%左右。另外，由于牡蠣是一種海洋生物，無(wú)機(jī)質(zhì)含量較高。,5、不同蛋白酶對(duì)牡蠣蛋白的水解特性 綜合考察前人的研究成果，本文主要選擇并研究了537酸性蛋白酶和Alcalase堿性蛋白酶的水解工藝條件。兩種酶的有關(guān)性質(zhì)見表2-2 。,圖2-1是兩種酶分別在表2-2的反應(yīng)條件下得到的水解進(jìn)程圖。由圖可見，兩種酶的水解初始速度都比較大，但隨著反應(yīng)的進(jìn)行，水解時(shí)間達(dá)到2小時(shí)左右時(shí)，水解進(jìn)程曲線趨于平緩。另外，經(jīng)過(guò)反復(fù)的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，對(duì)于未經(jīng)過(guò)脫脂處理的牡蝠肉，向反應(yīng)體系加入相同酶活力的酶量，537酸性蛋白酶的水解能力要優(yōu)于Alc

41、alase堿性蛋白酶，這一點(diǎn)從上述的水解進(jìn)程圖中也有體現(xiàn)。,表2-3 , 2-4是酶解產(chǎn)物中的可溶性蛋白質(zhì)得率與水解度的關(guān)系，由上表可以看出，隨著水解度的增大，可溶性蛋白質(zhì)得率呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，而且在相同的水解度情況下，537酸性蛋白酶對(duì)應(yīng)的可溶性蛋白質(zhì)得率要高于Alcalase堿性蛋白酶對(duì)應(yīng)的可溶性蛋白質(zhì)得率。,6、牡蠣肉酶解產(chǎn)物和原料的氨基酸組成,由表2-5可知，牡蠣肉和其酶解產(chǎn)物的氨基酸組成完善，而且人體所必需的8種氨基 酸含量較高，分別占氨基酸總量的34.59%和37.10%。另外，二者體系中的呈味氨基酸(谷氨酸、天冬氨酸、甘氨酸和丙氨酸等)含量也較高，分別占氨基酸總量35.61%和33.

42、11%。此外，還富含促進(jìn)嬰幼兒發(fā)育的組氨酸和精氨酸，而且酶解產(chǎn)物中精氨酸的相對(duì)含量為9.52%，明顯高于原料的含量。谷氨酸、甘氨酸作為抗氧化物質(zhì)有助于細(xì)胞免疫自由基和活性氧的毒害，在兩者中含量也很高，分別達(dá)到20.06%和20.08%。此外，?；撬岷胸S富，分別占氨基酸總量的7.61%和5.12%，?；撬崾且环N對(duì)人體非常有益的非蛋白氨基酸，人體主要依靠攝取食品中?；撬醽?lái)滿足機(jī)體需求。,7、不同酶解條件作用后的酶解產(chǎn)物經(jīng)凝膠色譜的相對(duì)分子質(zhì)量分布曲線 圖2-2至2-5是牡蝠蛋白經(jīng)Alcalase堿性蛋白酶和537酸性蛋白酶作用所得水解度為16%, 18%的酶解產(chǎn)物的Sephadex G-15凝膠

43、過(guò)濾色譜圖。,7、不同酶解條件作用后的酶解產(chǎn)物經(jīng)凝膠色譜的相對(duì)分子質(zhì)量分布曲線 圖2-2至2-5是牡蝠蛋白經(jīng)Alcalase堿性蛋白酶和537酸性蛋白酶作用所得水解度為16%, 18%的酶解產(chǎn)物的Sephadex G-15凝膠過(guò)濾色譜圖。,8、 HPLC測(cè)定牡蠣酸性蛋白酶酶解產(chǎn)物的相對(duì)分子質(zhì)量分布,圖2-6為各標(biāo)準(zhǔn)樣品的相對(duì)分子質(zhì)量對(duì)數(shù)與標(biāo)準(zhǔn)樣品經(jīng)HPLC的洗脫時(shí)間的關(guān)系曲線，其中標(biāo)準(zhǔn)蛋白為細(xì)胞色素C （MW12500）、抑肽酶（MW6500）、桿菌酶（MW1450),乙氨酸一乙氨酸一酪氨酸一精氨酸（ MW451)乙氨酸一乙氨酸一乙氨酸（MW189),CARBONIC ANHYDRASE （M

44、W29000），由圖可知，各標(biāo)樣的相對(duì)分子質(zhì)量對(duì)數(shù)和各標(biāo)樣的洗脫時(shí)間呈現(xiàn)很好的線性關(guān)系，回歸方程:Lob MolWt=7.38-0.236T 圖2-7為經(jīng)537酸性蛋白酶作用4h水解度約為18%)的酶解產(chǎn)物的HPLC圖譜，并根據(jù)回歸方程計(jì)算出了各峰處對(duì)應(yīng)的分子質(zhì)量。由圖可知，酶解產(chǎn)物中組分的相對(duì)分子質(zhì)量主要分布在119和2365之間，這部分峰面積約占總面積的76.99%，對(duì)應(yīng)相對(duì)分子質(zhì)量為568和203的峰面積分別占總面積的21.79%和26.37%，這說(shuō)明酶解產(chǎn)物主要存在25肽的短肽類物質(zhì)。后面幾個(gè)峰可能是由相對(duì)分子質(zhì)量較小的且在220nm處有吸收的非肽類和非氨基酸類物質(zhì)組成。,10、主要結(jié)

45、論 （1）.牡蠣肉的蛋白質(zhì)含量為43.95%，糖原含量為24.36%，脂肪含量為10.72%，是一種高蛋白、低脂且含有豐富糖原的高營(yíng)養(yǎng)海洋珍品。 （2）.初步確定了兩種酶的作用條件，537酸性蛋白酶作用條件為:pH3.0, 400C, E/S=6%;Alcalase堿性蛋白酶作用條件為:pH8.0, 600C, E/S=48AU/ko 537酸性蛋白酶對(duì)牡蠣蛋白質(zhì)的水解能力要優(yōu)于Alcalase堿性蛋白酶。在相同的水解度情況下，如表2-5, 2-6 所示，537酸性蛋白酶對(duì)應(yīng)的可溶性蛋白質(zhì)得率要高于Alcalase堿性蛋白酶對(duì)應(yīng)的可溶性蛋白質(zhì)得率。綜合考慮工藝條件，采用537酸性蛋白酶作為工藝

46、生產(chǎn)用酶。 （3）.通過(guò)Sephadex G-15凝膠過(guò)濾色譜和高效液相色譜分析了537酸性蛋白酶酶酶解產(chǎn)物的相對(duì)分子質(zhì)量分布，結(jié)果表明，水解產(chǎn)物的相對(duì)分子質(zhì)量主要分布在119和2365之間，主要為25肽的多肽類物質(zhì)。 （4）.牡蠣肉和其酶解產(chǎn)物的氨基酸組成完善，8種必需氨基酸含量分別占氨基酸總量的34.59%和37.10%。呈味氨基酸仁谷氨酸、天冬氨酸、甘氨酸和丙氨酸等)含量也較高，分別占氨基酸總量的35.61%和33.11。富含促進(jìn)嬰幼兒發(fā)育的組氨酸和精氨酸，而且酶解產(chǎn)物中精氨酸的相對(duì)含量為9.52%。牛磺酸含有豐富，分別占氨基酸總量的7.61%和5.12%。,從米糟中制取抗氧化生物活性肽

47、的研究 從很多動(dòng)植物來(lái)源的蛋白質(zhì)的酶解提取物中得到的肽或氨基酸具有抗氧化生物活性。研究人員已經(jīng)從酵母)、大豆、磷蝦、香魚科的小海魚,蜻魚等來(lái)源的蛋白質(zhì)的酶解提取物中分離出具有很強(qiáng)的抗氧化活性的小肽。另外，研究人員還發(fā)現(xiàn)色氨酸和賴氨酸的混合物脯氨酸對(duì)油脂具有杭氧化活性。 1、蛋白酶解物的制備 稱取50g濕米糟置于500mL燒杯中，加入定量蒸餾水，充分?jǐn)嚢韬?，?.5MNaOH調(diào)節(jié)pH值至所需值。再加入定量的蛋白酶后放入恒溫水浴中，使其發(fā)生反應(yīng)，時(shí)間根據(jù)需要來(lái)確定。酶解結(jié)束后，迅速升溫至850C，保持10min對(duì)酶進(jìn)行滅活處理。對(duì)酶解液進(jìn)行離心，取上清液，經(jīng)濃縮、冷凍干燥后備用。,2、米糟蛋白酶解

48、物的還原性 在一般情況下，物質(zhì)的還原能力與抗氧化能力呈正相關(guān)。還原能力的測(cè)定，可檢驗(yàn)待測(cè)物是否為良好的電子供應(yīng)者。待測(cè)物所供應(yīng)的電子可以使Fe3+還原為Fe2+，使體系溶液顏色改變，即可反映出體系中氧化還原狀態(tài)的改變。加入待測(cè)物后，在700nm處可以推知Fe3+的變化。待測(cè)物的還原性與吸光度值有關(guān)，吸光度越大還原性越強(qiáng)。 為研究米糟蛋白酶解物是否具有還原能力，在本實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行了米糟蛋白酶解物的還原能力測(cè)定。配制的米糟蛋白酶解物溶液濃度分別為5.0 mg/mL, 10.0 mg/mL, 25.0 mg/mL, 33.3 mg/mL,66.7mg/mL的米糟蛋白酶解物溶液，并進(jìn)行了還原能力測(cè)定。實(shí)驗(yàn)

49、結(jié)果如圖4-1所示。,上圖4-1中可以看出，不同濃度的米糟蛋白酶解物均具有一定的OD值，且隨著米糟蛋白酶解物濃度的增加，米糟蛋白酶解物OD值也增加，呈一定的劑量效應(yīng)關(guān)系(R2=0.9929 )。當(dāng)米糟蛋白酶解物濃度為66.7mg/mL時(shí)，OD值達(dá)到了0.707。這些說(shuō)明，米糟蛋白酶解物具有還原能力，且其還原能力與蛋白酶解物的濃度呈劑量效應(yīng)關(guān)系。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道piss，通過(guò)酶解獲得的大豆肽具有一定還原能力，其還原能力如表4-1所示。表4-1中可見，大豆肽也具有一定的還原能力，且也具有一定的劑量效應(yīng)關(guān)系。 本研究對(duì)米糟蛋白酶解物還原能力與大豆肽還原能力進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)在相同濃度下，用相同方法測(cè)定的米糟

50、蛋白酶解物還原能力高于大豆肽還原能力，如濃度為10.0 mg/mL時(shí)，米糟蛋白酶解物OD值為0.146，而大豆肽OD值為0.046，濃度為66.7mg/mL時(shí)，米糟蛋白酶解物OD值為0.707相當(dāng)于100mg/mL-250mg/mL大豆肽還原能力OD值(表4-1、表4-2 )?？梢娒自愕鞍酌附馕锏倪€原能力明顯優(yōu)于大豆肽的還原能力。,3、米糟蛋白酶解物防止茶多酚氧化 本實(shí)驗(yàn)的日的是通過(guò)肉眼觀察方法驗(yàn)證米糟蛋白酶解物的抗氧化活性，在實(shí)驗(yàn)中，選抒茶水為實(shí)驗(yàn)研究對(duì)象。向茶水中加入米糟蛋白酶解物和抗壞血酸后，觀察茶水顏色的變化，如放置一段時(shí)間后茶水顏色沒有變化或顏色變化不深，可以證明加入物質(zhì)具有抗氧化能

51、力。實(shí)驗(yàn)中，裝有26mL茶水的1號(hào)、2號(hào)燒杯中加入了4mL的米糟蛋白酶解物，3號(hào)、4號(hào)燒杯中分別加入了4mL濃度為3mg/mL , 30 mg/mL的Vc, 5號(hào)燒杯(圖4一中最左邊燒杯)加入30mL茶水，作為空白對(duì)照。經(jīng)過(guò)12小時(shí)，觀察發(fā)現(xiàn)5號(hào)杯茶水顏色開始變深，圖4-5為48小時(shí)后的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。,上圖4-5中可見，48小時(shí)之后，5號(hào)燒杯(空白對(duì)照)茶水顏色變化非常明顯，呈現(xiàn)紅褐色。此外，1號(hào)、2號(hào)、3號(hào)燒杯均有不同程度的顏色變化，其中3號(hào)燒杯顏色變化較深，1號(hào)、2號(hào)燒杯顏色變化較淺，但4號(hào)燒杯仍保留原來(lái)無(wú)色茶水顏色。5號(hào)燒杯(空白對(duì)照)茶水顏色變深的原因是由于茶水中的茶多酚被氧化形成有色物質(zhì)

52、，因此顏色變化明顯，而4號(hào)茶水顏色沒有變化的原因是因?yàn)閂c首先被氧化而消耗氧氣，因此保護(hù)茶水中的茶多酚被氧化的緣故。1號(hào)、2號(hào)燒杯顏色變化較淺的原因也可能是因?yàn)槊自愕鞍酌附馕锞哂锌寡趸饔茫瑢?duì)茶水中的茶多酚形成了保護(hù)作用，3號(hào)茶水的顏色變化比其他燒杯中的(除空白之外)茶水顏色深的原因可能是Vc的濃度太低，沒有對(duì)茶水中的茶多酚進(jìn)行有效的保護(hù)。 從這個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果中可以從肉眼觀察的角度證實(shí)了米糟蛋白酶解物可能具有一定的抗氧化作用。,4、米糟蛋白酶解物的清除DPPH自由基能力 DPPH法是一個(gè)靈敏、簡(jiǎn)便、實(shí)用且重現(xiàn)性好的白由基清除活性測(cè)定方法，一般常用于大然有機(jī)化合物和植物提取物的抗氧化活性考察?？寡趸钚钥梢酝ㄟ^(guò)清除DPPH白由基能力來(lái)表示。 DPPH自由基即中文名:2,2-二苯基-1-苦肼基自由基;英文名:2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl是一種很穩(wěn)定