1、Agilent 1260 HPLC 工作原理及色譜柱的使用和保養(yǎng),2013.5.31,Agilent 1260 HPLC 工作原理及簡單操作,培訓目的： 1.了解HPLC各模塊的原理； 2. 掌握HPLC各模塊日常維護的要點； 3. 掌握開機，關機。,Agilent 1260 HPLC 工作原理及簡單操作,內容： 一、 HPLC各模塊的原理及維護； 二、開機/關機操作；,一 、 HPLC各模塊工作原理及維護,HPLC： 高效液相色譜儀（High Performances Liquid Chromatography）。 由儲液器、泵、進樣器、色譜柱、檢測器、記錄儀等幾個部分組成。 工作原理：工作

2、時儲液器中的流動相被泵打入系統(tǒng)，樣品溶液經(jīng)樣品進樣器進入流動相，被流動相載入色譜柱（固定相）內，由于樣品溶液中的各組分在兩相中具有不同的分配系數(shù)，在兩相中做相對運動時，經(jīng)過反復多次的吸附-解吸的分配過程，各組分在移動速度上產(chǎn)生較大的差別，被分離成單個組分依次從柱內流出，通過檢測器時，樣品濃度被轉換成電信號傳送到記錄儀，數(shù)據(jù)以圖譜形式打印出來。,關于溶劑,HPLC各模塊的工作原理及維護,所有溶劑應為HPLC級，水應為二次超純水； 所有溶劑應經(jīng)過過濾。過濾水應使用水相濾膜，過濾有機相應使用有機相濾膜，不能混用。每一次濾膜只能用一次，不能重復使用； 如果沒有在線脫氣機，所有溶劑應經(jīng)過超聲脫氣； 水易

3、滋生藻類，避免直接照射，過濾水最好使用不要超過兩天； 如果條件允許可向溶劑中加入0.001-0.0001M的疊氮化鈉； 注意溶劑的相容性，避免使用不相容的溶劑； 避免使用強酸、強堿或有機氯等腐蝕性溶劑； 在溶劑瓶中的溶劑過濾頭可能會堵塞，必要時小心拿下用強酸（35%硝酸）浸泡時，用水沖洗，但不要使用超聲處理。,關于在線真空脫氣機,在線真空脫氣機的管路容量為12ml，壓力范圍為110Torr-190Torr。 為保證脫氣機的良好使用性能，在下述情況下需要用注射器抽洗脫氣機管路，每個通道使用不低于30ml的異丙醇。 1，新的脫氣機或新的管路； 2，更換了溶劑，尤其是緩沖鹽與有機相之間、兩個不相容流

4、動相之間的互換時； 3，輸液泵關閉了一段時間，或使用揮發(fā)性溶劑混合物。,HPLC各模塊的工作原理及維護,關于泵：（四元泵）,HPLC各模塊的工作原理及維護,關于泵（泵頭組件）,出口球閥BOV,清洗閥Purge Valve,柱塞桿Piston,主動輸入閥AV,HPLC各模塊的工作原理及維護,活塞外框架,Seal Wash組件,泵頭密封墊,泵腔,更換過濾白頭,在清洗閥中的過濾白頭需要更換，在清洗狀態(tài)下，設置流量為5ml/min，此時系統(tǒng)壓力如果超過10bar，則需更換過濾白頭。 更換步驟： 1，關閉泵電源； 2，用扳手去掉通往進樣器上的毛細管，拔掉廢液管； 3，用專用扳手小心把清洗閥卸下來； 4，

5、輕輕去掉聚四氟乙烯密封墊和金密封墊，將過濾白頭拿出； 5，更換新的過濾白頭，裝上聚四氟乙烯密封墊和金密封墊； 6，裝上清洗閥； 7，連接管路。,過濾白頭,聚四氟乙烯密封墊,金密封墊,清洗閥PurgeValve,HPLC各模塊的工作原理及維護,更換過濾白頭,1，去掉毛細管，廢液管,2，卸掉清洗閥,3，更換過濾白頭,4，更換白頭，裝好清洗閥,HPLC各模塊的工作原理及維護,泵的注意事項,1，溶劑的過濾、脫氣； 2，避免使用腐蝕性溶劑； 3，在滿足分析的前提下，盡可能使用較低的流速較低的系統(tǒng)壓力。 4，更換過濾白頭； 5，考慮溶劑的相容性； 6，盡可能使用新鮮的水； 7，使用0.01M以上濃度的緩沖

6、溶液要選配柱塞清洗組件，清洗液不能干涸。 8，使用正相溶劑比如環(huán)己烷時，建議使用聚乙烯密封墊，部件號為0905-1420，在0200Bar下使用聚乙烯密封墊比標準密封墊更耐磨損。,四元泵： 四元泵多通道比例閥MCGV使用時注意，緩沖溶液要放在D通道，以避免鹽顆粒析出。建議A通道：水；B、C通道：有機溶劑；D通道：緩沖溶液。,HPLC各模塊的工作原理及維護,關于進樣器,HPLC各模塊的工作原理及維護,關于進樣器,準備位置,調用樣品瓶 吸樣品,進樣和運行位置,標準進樣過程 .,HPLC各模塊的工作原理及維護,自動進樣器,樣品要干凈、經(jīng)過過濾。 洗針：把樣品殘留降低到最小限度，可降低進樣的記憶效應，

7、洗針瓶最好不要加瓶墊。 多次吸液用于進樣量大于100l,HPLC各模塊的工作原理及維護,關于恒溫柱箱,控制范圍：最高80C，低溫低于室溫10C。 預熱塊體積左面為3ul，右面為6ul，除非有特殊要求，左右溫度應保持一致。 一定要關閉前面板。,HPLC各模塊的工作原理及維護,檢測器DAD,DAD (Diode Array Detector)二極管陣列檢測器，是以光電二極管陣列作為檢測元件的UV-VIS檢測器. DAD的光源氘燈有一定的半衰期，一般為1000小時左右，所以在沒有樣品分析任務時要關閉氘燈，以延長氘燈的使用壽命,但是也不要頻繁的開關,這樣也會影響壽命。同時，打開燈需要預熱10min 左

8、右，燈使用時間越長，預熱的時間也要越長。 流通池污染后，會造成靈敏度下降、噪聲加大，應避免臟的樣品進入流通池。定期使用異丙醇沖洗系統(tǒng)對保持流通池性能有一定好處。,HPLC各模塊的工作原理及維護,檢測器DAD,HPLC各模塊的工作原理及維護,檢測器FLD,HPLC各模塊的工作原理及維護,FLD(Fluorescence Detector) 熒光檢測器：是利用某些溶質在受到紫外光激發(fā)后，能發(fā)射可見光（熒光）的性質來檢測的。 FLD是一款具有高度靈敏度和高度選擇性的檢測器。其激發(fā)光源是氙燈，此燈不需要預熱。 其流通池和DAD的一樣，也要定期用異丙醇沖洗，以保證性能。,檢測器RID示差檢測器,HPLC

9、各模塊的工作原理及維護,開機操作： 1，打開計算機。 2，自上而下打開LC各模塊的電源，等待儀器自檢完畢，1-2min。 3，雙擊桌面上“Instrument 1 Online”圖標，進入化學工作站,在工作站打開各工作模塊。 4，打開Seal Wash清洗液開關，清洗各管路(510min)。 5, 擰上清洗閥，將流量慢慢設為所需流速，平衡30min即可以進樣樣。,關機操作： 1，如果使用了緩沖溶液流動相應先用水（510%甲醇）沖洗系統(tǒng)30min。 2，用純有機相沖洗系統(tǒng)30min。 3，在工作站上關閉各個模塊。 4，退出工作站，關閉計算機。 5，自下而上關閉LC各個模塊的電源。,二、 開機/關

10、機操作,指示燈狀態(tài),開機/關機操作,逆時針旋轉打開清洗閥，清洗閥打開時，液體從廢液管中流出，為清洗狀態(tài)。 更換溶劑后，打開清洗閥，設置流量5ml/min，沖洗5-10 min. 順時針旋緊清洗閥為關閉狀態(tài),此時流動相由毛細管流向進樣器.,逆時針打開清洗閥,順時針關閉清洗閥,毛細管出口,流向進樣器,廢液管,清洗閥打開時溶劑由此流向廢液瓶.,開機/關機操作,清洗閥Purge Valve,每次用過儀器后必須做!,整臺液相色譜儀的維護,1. 在使用過含鹽緩沖液后必須清水沖洗泵15分鐘，此時 必須打開排放閥，不能使廢液進入色譜柱。 2. 關上排放閥，用90%+10%的水、甲醇溶液沖洗整個系 統(tǒng)，時間為1

11、520分鐘，流量1ml/min。本步驟主要是沖 洗干凈系統(tǒng)內其他含鹽的部位。 3. 用純的強溶劑沖洗整個系統(tǒng)，時間為1小時，流量為 1ml/min。本步驟主要是保護色譜柱。 4. 如果未使用緩沖液，上面1、2兩步驟可免去，直接用 純的強溶劑沖洗整個系統(tǒng)，時間為1小時，流量為1ml/min。 5.如果較長時間不使用色譜儀，所有管道先用純水沖洗，再用甲醇沖洗，讓所用管路都保存在甲醇中，防止長菌。,開/關機操作,色譜柱的使用和保養(yǎng),內容： 一、 正確使用色譜柱； 二、色譜柱的日常清洗和存放。,色譜柱的選擇,非極性或極性較小的樣品可用一般的C18柱 酸堿性的化合物建議選用填料經(jīng)封尾鈍化過的C18柱，P

12、H范圍2-9（12） 糖類，氨基酸，有機酸，多環(huán)芳烴，GPC有專用柱 超快速柱子-填料粒度2m,色譜柱的使用和保養(yǎng),鍵合相色譜柱,以硅膠為基質，通過化學鍵合方式把碳十八、碳八、胺基等基團聯(lián)在基質上作為固定相。這種固定相要占所有柱填料的60-70% 優(yōu)點 固定相穩(wěn)定，不易流失 應用廣泛，可使用多種溶劑 消除硅羥基的不良影響 缺點 pH值不能小于2或大于8 同樣填料，各種牌號色譜柱不盡相同,色譜柱的使用和保養(yǎng),反相HPLC柱（C18）的性能,常規(guī)C18填料的穩(wěn)定性 硅膠基質填料 pH范圍：2-8 pH值大于7時鍵合相粉碎或溶解 pH值小于2時鍵合相的化學鍵斷裂 經(jīng)常用緩沖液 固定相降解 填料新的鍵

13、合技術 - PH范圍 2-12 - 穩(wěn)定性好，使用壽命長,色譜柱的使用和保養(yǎng),良好的色譜實驗習慣,拿到一根新色譜柱時，先測柱效 保留在新色譜柱上測得的色譜圖，并記錄條件 給新色譜柱建立一個檔案 定期檢測柱效,色譜柱的使用和保養(yǎng),色譜柱的申購,色譜柱的使用和保養(yǎng),色譜柱的領用及歸還,分析室所有色譜柱按照類型進行編號登記造冊，建立色譜柱檔案，注明采購時間及使用項目名稱。 領用新的色譜柱時由使用人按照說明書進行沖洗，按要求測柱效，并做好記錄。 分析室所有色譜柱統(tǒng)一放置，取出及歸還色譜柱時要做好登記。 試驗結束后，使用人要正確沖洗色譜柱，同時記錄好與試驗、色譜柱相關的信息；不影響自己及其他人的再次使用

14、 如發(fā)現(xiàn)色譜柱壓力高、峰型差等異常問題，使用人要及時沖洗并按照說明書檢測柱效，遇柱效差或分離差的色譜柱附上柱效檢測報告，報室主任，同意后報廢，統(tǒng)一放置。,色譜柱的使用和保養(yǎng),色譜柱的使用及操作,流動相的轉換 特別是GPC柱 流速(壓力)的變化幅度 溫度的變化幅度 專用色譜柱樣品及溶劑的要求,色譜柱的使用和保養(yǎng),色譜柱的保養(yǎng)（一）,樣品方面 除去微粒及雜質 了解樣品在流動相中的溶解度 如樣品的溶劑不是流動相，一定要用流動相試溶解度，防止其在流動相中析出 了解樣品與色譜柱的基質/填料是否相互作用,色譜柱的使用和保養(yǎng),為什么溶劑和樣品要過濾?,溶劑和樣品過濾非常重要，它會對色譜柱、儀器起到保護作用，

15、消除由于污染對分析結果的影響。 色譜柱：由于填料顆粒很細，色譜柱內腔很小，溶劑和樣品中的細小顆粒會使色譜柱和毛細管容易堵塞。 儀器：溶劑和樣品中的細小顆粒會增加進樣閥的堵塞和磨損，同時也會增加泵頭內的藍寶石活塞桿和活塞的磨損。 樣品過濾頭的類型： 30mm 內徑：適用于大進樣量的過濾，由0.22m 和0.45m 兩種規(guī)格,材料有纖維素,醋酸纖維,聚四氟乙烯。處理樣品體積少于50l。 13mm 內徑：適用于范圍廣的過濾，由0.22m 和0.45m 兩種規(guī)格,材料為纖維素。 3mm 內徑：適用于小進樣量的過濾，由0.22m 和0.45m 兩種規(guī)格。處理樣品體積為7l。,色譜柱的使用和保養(yǎng),色譜柱的

16、保養(yǎng)（二）,流動相方面 除去微粒 純度的要求 超純水，梯度實驗時水中有機雜質含量要低（建議走空白檢驗） 緩沖液的pH值，在填料的允許范圍內 緩沖液（鹽）的濃度 溶劑：色譜純，并與填料相匹配 溶劑中的雜質含量 注意溶劑的相容性，避免使用不相容的溶劑 流動相對樣品的溶解度 有機溶劑或水的比例,色譜柱的使用和保養(yǎng),溶劑過濾-除去微粒,不干凈的溶劑或在溶劑瓶中長菌的溶劑會阻塞溶劑過濾器以及色譜柱。 遵從下列建議可以提高性能，延長溶劑過濾器和色譜柱的壽命： 使用無菌溶劑瓶避免溶劑長菌。 用濾膜過濾溶劑去除微生物。 每天更換或過濾溶劑。 避免溶劑瓶直接日照。 向溶劑中加入0.0001-0.001M的疊氮化

17、鈉。,色譜柱的使用和保養(yǎng),溶劑準備：過濾,色譜柱的使用和保養(yǎng),選擇合適的濾膜,聚四氟乙烯濾膜：適用于所有溶劑，酸和鹽，并無任何可溶物。 醋酸纖維濾膜：適用于水基溶劑，不適用于有機溶劑，推薦用于蛋白質和其相關的樣品。 尼龍66濾膜：適用于絕大多數(shù)有機溶劑和水溶液，可用于強酸、70%乙醇、二氯甲烷、不適用于DMF二甲基甲酰胺 再生纖維素濾膜：具有蛋白質吸收低，同樣適用于水溶性樣品和有機溶劑。 注意：1）每張濾膜只能用一次。 2）水相和有機相不要搞混。,色譜柱的使用和保養(yǎng),溶劑的相溶性,色譜柱的使用和保養(yǎng),溶劑信息,避免使用下列對不銹鋼有腐蝕性的溶劑： 鹵化物堿金屬溶液和相應的酸溶液。 高濃度的無機

18、酸例如：硝酸和硫酸。 能夠形成鹵素自由基或酸的氯化試劑及其混合物。 含有過氧化物的色譜級醚必須用氧化鋁干燥劑。 在有機溶劑中的有機酸溶液。 含有強絡合劑的溶液。 四氯化碳和異丙醇或THF混合液。,色譜柱的使用和保養(yǎng),溶劑截止波長,色譜柱的使用和保養(yǎng),溶劑準備：脫氣,色譜柱的使用和保養(yǎng),流動相使用前為什么要脫氣？,流動相使用前必須進行脫氣處理 ，以除去其中溶解的氣體（如O2），以防止在洗脫過程中當流動相由色譜柱流至檢測器時，因壓力降低而產(chǎn)生氣泡。氣泡會增加基線的噪音，造成靈敏度下降，甚至無法分析。溶解的氧氣還會導致樣品中某些組份被氧化，柱中固定相發(fā)生降解而改變柱的分離性能。若用FLD，可能會造成

19、熒光猝滅。,色譜柱的使用和保養(yǎng),典型的流速,色譜柱的使用和保養(yǎng),色譜柱保護,色譜柱的使用和保養(yǎng),色譜柱常見毛病,柱壓過高 多少才算高? 不同色譜柱有差異 不同系統(tǒng)有差異 不同溶劑有差異 柱效低 重復性差 不出峰，回收率低,色譜柱的使用和保養(yǎng),柱壓過高,為什么柱壓會過高 微粒堵塞 樣品 流動相 密封墊 柱床膨脹 不可逆吸附 細菌生長,色譜柱的使用和保養(yǎng),柱效低,為什么柱效低 色譜柱被污染 過濾片部分堵塞 樣品、流動相或密封墊的細小顆粒造成的堵塞 色譜柱內的死體積 流動相pH值及組成不合適造成固定相流失 流速急劇變化造成固定相物理損壞 機械震動造成固定相產(chǎn)生裂縫 柱床收縮或干枯,色譜柱的使用和保養(yǎng)

20、,重復性差、回收率低,實驗的重復性差 色譜柱被污染 流動相pH值及組成不合適造成鍵合相流失 樣品溶劑不同或樣品本身不穩(wěn)定 回收率低，不出峰 “不可逆”吸附 固定相過強或流動相過弱 非特異性吸附,色譜柱的使用和保養(yǎng),色譜柱的日常清洗,對所做的樣品要有充分的了解 用對該樣品洗脫能力最強的流動相清洗（如反相C18柱用100%甲醇或乙腈） 硅膠柱的一般方法 先用甲醇洗去極性雜質，再用干燥的二氯甲烷、正庚烷100200ml依次活化 鍵合相柱(烷基)的一般方法 20倍柱體積的：甲醇-氯仿-甲醇-水依次沖洗 柱子尺寸 柱子體積 沖洗體積 150 x4.6mm 2.5ml 50ml 200 x4.6mm 3.3ml 65ml 250 x4.6mm 4