1、衛(wèi) 生 毒 理 學(xué)實(shí) 驗(yàn) 指 導(dǎo)編寫(xiě)： 陳秉 符古雅2009年3月目 錄實(shí)驗(yàn)一 毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)1實(shí)驗(yàn)二 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的一般操作技術(shù)10實(shí)驗(yàn)三 滅多威經(jīng)口急性毒性試驗(yàn)20實(shí)驗(yàn)四 苯經(jīng)呼吸道急性毒性試驗(yàn)24實(shí)驗(yàn)五 蓄積毒性試驗(yàn)27實(shí)驗(yàn)六 亞慢性和慢性毒性試驗(yàn)29實(shí)驗(yàn)七 小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)33實(shí)驗(yàn)八 小鼠精子畸形試驗(yàn)37實(shí)驗(yàn)九 骨髓細(xì)胞染色體畸變分析40實(shí)驗(yàn)十 鼠傷寒沙門(mén)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)42實(shí)驗(yàn)十一 致畸試驗(yàn)及胚胎胎仔檢查方法47實(shí)驗(yàn)十二 網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)53附錄：動(dòng)物實(shí)驗(yàn)報(bào)告的撰寫(xiě)及注意事項(xiàng)54實(shí)驗(yàn)一 毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)一、目的和意義毒理學(xué)的很多研究工作需要通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)來(lái)進(jìn)行。使用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行科研的優(yōu)點(diǎn)是花

2、費(fèi)人力、物力較少，時(shí)間短，易發(fā)現(xiàn)單因素與結(jié)果的關(guān)系，能提供大量有價(jià)值的可與人類生命活動(dòng)現(xiàn)象相類比的資料。在毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)研究中，健康的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物是保證工作順利進(jìn)行和獲得正確可靠的研究結(jié)果的重要條件。 毒理學(xué)研究外源化學(xué)物對(duì)于機(jī)體(特別是人體)的有害作用及其機(jī)制。毒理學(xué)研究的主要手段是動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。體內(nèi)試驗(yàn)是以實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為模型，最終目的是通過(guò)外源化學(xué)物對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的毒性反應(yīng)，向人(原型)外推，以期評(píng)估外源化學(xué)物對(duì)人的危害及危險(xiǎn)性。體外實(shí)驗(yàn)主要用于篩選和預(yù)測(cè)急性毒性和機(jī)制研究；人體實(shí)驗(yàn)和流行病學(xué)調(diào)查則可進(jìn)一步深化和證實(shí)在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中所得到的資料。實(shí)際上，毒理學(xué)作為一門(mén)實(shí)驗(yàn)科學(xué)是以動(dòng)物實(shí)驗(yàn)為中心的，毒理學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的

3、設(shè)計(jì)、實(shí)施、結(jié)果觀察和評(píng)價(jià)是毒理學(xué)研究的基本方法。 通過(guò)本次討論，要求學(xué)生基本掌握毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的原則和方法。二、內(nèi)容（一）毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)的原則和局限性1、毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)的原則在毒理學(xué)的試驗(yàn)中，有三個(gè)基本的原則。 第一個(gè)原則，化學(xué)物在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物產(chǎn)生的作用，可以外推于人。 第二個(gè)原則，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物必須暴露于高劑量，這是發(fā)現(xiàn)對(duì)人潛在危害的必需的和可靠的方法。第三個(gè)原則，成年健康(雄性和雌性未孕) 的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和人可能的暴露途徑是基本的選擇。2、毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)的局限性用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)資料外推到人群接觸的安全性時(shí)，會(huì)有很大的不確定性。（二）毒理學(xué)常規(guī)毒性試驗(yàn)的基本目的 毒性評(píng)價(jià)或安全性評(píng)價(jià)方面的基本目的包括以下幾點(diǎn)

4、： 1. 受試物毒作用的表現(xiàn)和性質(zhì)。 2. 劑量-反應(yīng)(效應(yīng))研究。 3. 確定毒作用的靶器官。 4. 確定損害的可逆性。 毒理學(xué)研究還可能有其他的目的和要求，例如毒作用的敏感檢測(cè)指標(biāo)和生物學(xué)標(biāo)志、毒作用機(jī)制研究、受試物的毒物動(dòng)力學(xué)和代謝研究、中毒的解救措施等。對(duì)這些要求，應(yīng)擴(kuò)展常規(guī)試驗(yàn)的設(shè)計(jì)以包括有關(guān)的項(xiàng)目，或者另外設(shè)計(jì)和進(jìn)行靶器官毒理學(xué)研究及機(jī)制毒理學(xué)研究。（三）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇毒理學(xué)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)是以實(shí)驗(yàn)動(dòng)物作為研究對(duì)象的，為獲得可靠的研究結(jié)果，先決條件是正確地選用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物物種的選擇 對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物物種選擇的基本原則是：選擇對(duì)受試物在代謝、生物化學(xué)和毒理學(xué)特征與人最接近的物種；自然壽

5、命不太長(zhǎng)的物種；易于飼養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)操作的物種；經(jīng)濟(jì)并易于獲得的物種。在毒理學(xué)研究中常用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物物種如下：大鼠、小鼠、豚鼠、兔、狗。其他可能用到的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有地鼠、獼猴、小型豬、雞等。常用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生物學(xué)和生理學(xué)參數(shù)見(jiàn)表1-1。以上實(shí)驗(yàn)動(dòng)物各物種中，實(shí)際上沒(méi)有一種完全符合上述物種選擇的原則，目前常規(guī)選擇物種的方式是利用兩個(gè)物種，一種是嚙齒類，另一種是非嚙齒類。系統(tǒng)毒性研究最常用的嚙齒類是大鼠和小鼠，非嚙齒類是狗。豚鼠常用于皮膚刺激試驗(yàn)和致敏試驗(yàn)，兔常用于皮膚刺激試驗(yàn)和眼刺激試驗(yàn)。遺傳毒理學(xué)試驗(yàn)多用小鼠，致癌試驗(yàn)常用大鼠和小鼠，致畸試驗(yàn)常用大鼠、小鼠和兔。遲發(fā)性神經(jīng)毒性試驗(yàn)常用母雞。表1-1 常用實(shí)驗(yàn)動(dòng)

6、物生物學(xué)和生理學(xué)參數(shù)參 數(shù)猴狗貓兔大 鼠小 鼠豚 鼠地 鼠成體體重(kg)3.514.03.33.70.450.0350.430.12壽命(a)161514631.531水消耗(ml/d)45035032030035614530飼料消耗 (成本g/d)1504001001801051210成體代謝(calkg d)1588080110130600100250體溫()38.838.938.639l438l237.438.638.0呼吸頻率50202553851609083(次min)(4060)(1030)(2030)(4065)(65110)(80240)(70100)(35130)心率(次m

7、in)200100120200328600300450血壓 mmhg15912714810015510011080130/901207577/50108/77(收縮舒張)出生體重(g)500700110022001251005-61.5751002.0斷乳時(shí)體重(g)44005800300010015004050101225035開(kāi)眼(d)出生當(dāng)天81281210101211出生當(dāng)天15妊娠(d)16863633121206716性周期(d)282215281516454516194動(dòng)情期(d)12713919301111窩數(shù)量136161136911215112斷乳年齡(周)16246698

8、343234生殖年齡(月)549106723232生殖期(年)10155104131131生殖季節(jié)任何時(shí)間春，秋冬季23個(gè)月任何時(shí)間任何時(shí)間任何時(shí)間任何時(shí)間任何時(shí)間所需面積(tf2)*68330.40.40.70.34環(huán)境溫度()18281828182818281925192519251925血容量( ml/kg)7579605365807585凝血時(shí)間(s)90180120300601460143hct(紅細(xì)胞)4245404246414250hb(gbl)12.516.011.813.614.816.012.412.02、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物品系的選擇品系(strain)是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)的專用名詞，指用計(jì)

9、劃交配的方法，獲得起源于共同祖先的一群動(dòng)物。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物按遺傳學(xué)控制分類可分為：近交系：指全同胞兄妹或親子之間連續(xù)交配20代以上而培育的純品系動(dòng)物。如小鼠有津白i、津白、615，dba1和dba2，balb/c，c3h，c57b6j，a和ahe等。雜交群動(dòng)物(雜交1代，f1)，指兩個(gè)不同的近交系之間有目的進(jìn)行交配，所產(chǎn)生的第一代動(dòng)物。封閉群：一個(gè)種群在五年以上不從外部引進(jìn)新血緣，僅由同一品系的動(dòng)物在固定場(chǎng)所隨機(jī)交配繁殖的動(dòng)物群。如昆明種小鼠、nih小鼠、laca小鼠、f344大鼠、wistar大鼠、sd(sprague-dauley)大鼠等。 根據(jù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物遺傳的均一性排序，近交系最高、雜交群次之、

10、封閉群較低。不同品系實(shí)驗(yàn)動(dòng)物對(duì)外源化學(xué)物毒性反應(yīng)有差別，所以毒理學(xué)研究要選擇適宜的品系，對(duì)某種外源化學(xué)物毒理學(xué)系列研究中應(yīng)固定使用同一品系動(dòng)物，以求研究結(jié)果的穩(wěn)定性。 遺傳毒理學(xué)一般利用嚙齒類動(dòng)物，主要是小鼠或大鼠。如果有合適的理由，其他物種也可接受。有的文獻(xiàn)報(bào)告在小鼠骨髓微核試驗(yàn)msae品系比ddy，cd-1或bdf品系更敏感。但一般認(rèn)為還沒(méi)能證明某一品系對(duì)所有的遺傳毒性物質(zhì)比其他品系都敏感。在致癌試驗(yàn)中對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的品系有一定的要求，特別重視有關(guān)病理?yè)p害的自發(fā)發(fā)生率。3、對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物微生物控制的選擇 按微生物控制分類，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為四級(jí)，見(jiàn)表1-2。對(duì)于毒性試驗(yàn)及毒理學(xué)研究應(yīng)盡可能使用二級(jí)(或二

11、級(jí)以上)的動(dòng)物，以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。表1-2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物微生物等級(jí)級(jí) 別要 求i 級(jí) 級(jí) 級(jí)iv 級(jí)普通動(dòng)物，應(yīng)沒(méi)有傳染給人的疾病 清潔動(dòng)物，除i級(jí)標(biāo)準(zhǔn)外，種系清楚，沒(méi)有該動(dòng)物特有的疾病 無(wú)特定病原體動(dòng)物(spf)，除級(jí)標(biāo)準(zhǔn)外，動(dòng)物為剖腹產(chǎn)或子宮切除產(chǎn)、按純系要求繁殖，在隔離器內(nèi)或?qū)恿魇覂?nèi)飼養(yǎng)，可有不致病細(xì)菌叢，沒(méi)有致病病原體 無(wú)菌動(dòng)物，在全封閉無(wú)菌條件下飼養(yǎng)的純系動(dòng)物，動(dòng)物體外不帶有任何微生物和寄生蟲(chóng)(包括絕大部分病毒)4、個(gè)體選擇 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物對(duì)外來(lái)化學(xué)物的毒性反應(yīng)還存在個(gè)體差異，應(yīng)注意實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的個(gè)體選擇。 （1）. 性別 同一物種、同一品系的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物雌雄兩性通常對(duì)相同外源化學(xué)物毒性反應(yīng)類似

12、但雌雄兩性對(duì)化學(xué)物的毒性敏感性上存在著差別。 如果已知不同性別的動(dòng)物對(duì)受試物敏感性不同，應(yīng)選擇敏感的性別。如對(duì)性別差異不清楚，則應(yīng)選用雌雄兩種性別。如實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)存在性別差異，則應(yīng)將不同性別動(dòng)物的實(shí)驗(yàn)結(jié)果分別統(tǒng)計(jì)分析。 在遺傳毒理學(xué)體內(nèi)試驗(yàn)中，對(duì)性別的選擇有幾種意見(jiàn)： 對(duì)單個(gè)物種應(yīng)用兩種性別。 對(duì)單個(gè)物種應(yīng)用兩種性別，除非已在一個(gè)性別得到陽(yáng)性反應(yīng)，就不必對(duì)另一種性別進(jìn)行試驗(yàn)。 對(duì)單個(gè)物種應(yīng)用兩種性別，除非經(jīng)毒代動(dòng)力學(xué)研究證明受試物(和其代謝產(chǎn)物)在雄性和雌性無(wú)差別和或如果在確定劑量的預(yù)試驗(yàn)證明有相等毒性。此假定在非遺傳毒性與遺傳毒性之間有相關(guān)。 對(duì)單個(gè)物種常規(guī)用一種性別(雄性或雌性)，除非預(yù)期證

13、明存在性別差異。由于歷史的原因uds體內(nèi)體外試驗(yàn)常規(guī)用雄性大鼠。 一般來(lái)說(shuō)，對(duì)于初次試驗(yàn)的受試物，應(yīng)該采用兩種性別。對(duì)大鼠和小鼠各一種性別進(jìn)行試驗(yàn)可能比單個(gè)物種兩種性別提供更好的危害鑒定，但這需要更多的資料來(lái)證明。 （2）. 年齡和體重 （3）. 生理狀態(tài) （4）. 健康狀況 (四)毒理學(xué)試驗(yàn)設(shè)計(jì)要點(diǎn)1、體內(nèi)試驗(yàn)設(shè)計(jì) 1）. 劑量分組 在毒理學(xué)試驗(yàn)中，最重要的就是研究劑量-反應(yīng)(效應(yīng))關(guān)系，也就是當(dāng)外源化學(xué)物染毒劑量增加，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的毒性反應(yīng)(效應(yīng))隨之而增強(qiáng)。劑量-反應(yīng)(效應(yīng))關(guān)系的存在是確定外源化學(xué)物與有害作用的因果關(guān)系的重要依據(jù)，也可證明實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。因此，在毒理學(xué)試驗(yàn)中，一般至少要設(shè)

14、3個(gè)劑量組(即高劑量組、中劑量組、低劑量組)，希望能得到滿意的劑量-反應(yīng)(效應(yīng))關(guān)系。 特別注意設(shè)立對(duì)照組： 未處理對(duì)照組(以前有稱為空白對(duì)照組)： 陰性(溶劑/賦形劑)對(duì)照： 陽(yáng)性對(duì)照： 歷史性對(duì)照： 2）. 各組動(dòng)物數(shù) 3）. 試驗(yàn)期限 2、體外試驗(yàn)設(shè)計(jì) 1）測(cè)定受試物溶解性 2）試驗(yàn)最高劑量的推薦 3）. 代謝活化 4）. 陽(yáng)性對(duì)照 5）. 重復(fù) （五）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的染毒和處置1、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)前的準(zhǔn)備2、受試物和樣品的準(zhǔn)備3、染毒途徑4、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處死及生物標(biāo)本采集 1）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處死方法 2）血液采集 3）尿液采集 4）病理解剖、標(biāo)本留取和組織病理學(xué)檢查（六）實(shí)驗(yàn)結(jié)果處理和分析在毒理學(xué)試驗(yàn)的設(shè)計(jì)和

15、實(shí)施中應(yīng)貫徹實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的對(duì)照、隨機(jī)和重復(fù)的原則，實(shí)驗(yàn)的各劑量組所得到的結(jié)果應(yīng)與陰性對(duì)照組比較。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果(指標(biāo))的變量類型是數(shù)值變量(計(jì)量資料)還是分類變量(計(jì)數(shù)資料)，選用不同的統(tǒng)計(jì)分析方法。在評(píng)價(jià)毒理學(xué)試驗(yàn)的結(jié)果時(shí)，應(yīng)綜合考慮生物學(xué)意義和統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)的假設(shè)是關(guān)于總體特征的假設(shè)，檢驗(yàn)方法是以統(tǒng)計(jì)量的抽樣分布為根據(jù)的，得到的結(jié)論是概率性的，不是絕對(duì)的肯定或否定，不等同于有或無(wú)生物學(xué)意義。對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果作出科學(xué)的判斷和解釋，應(yīng)該根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析的結(jié)果、生物學(xué)知識(shí)和經(jīng)驗(yàn)。1、毒理學(xué)試驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)學(xué)統(tǒng)計(jì)學(xué)觀點(diǎn)及方法在毒理學(xué)試驗(yàn)的設(shè)計(jì)和結(jié)果評(píng)價(jià)中起關(guān)鍵的作用，毒理學(xué)試驗(yàn)的發(fā)展也促進(jìn)了生物統(tǒng)計(jì)學(xué)的發(fā)展。毒

16、理學(xué)試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)評(píng)價(jià)的主要進(jìn)展是劑量反應(yīng)關(guān)系研究和對(duì)超離差數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)。 1）. 毒理學(xué)試驗(yàn)設(shè)計(jì)的統(tǒng)計(jì)學(xué)要求 毒理學(xué)試驗(yàn)的設(shè)計(jì)應(yīng)遵循隨機(jī)、重復(fù)及對(duì)照三個(gè)原則，要求各觀察值具有代表性，并且是相互獨(dú)立的。毒理學(xué)試驗(yàn)的設(shè)計(jì)具體涉及到劑量水平數(shù)目及間隔，每個(gè)劑量點(diǎn)的實(shí)驗(yàn)單位數(shù)，每個(gè)實(shí)驗(yàn)單位接種及計(jì)數(shù)的細(xì)胞數(shù)，對(duì)照組的設(shè)置等。實(shí)驗(yàn)單位的確定對(duì)于樣品的獨(dú)立性是很重要的，實(shí)驗(yàn)單位(experimental unit)是進(jìn)行處理時(shí)或觀察時(shí)獨(dú)立的最大采樣單位。以動(dòng)物和培養(yǎng)物作為實(shí)驗(yàn)單位要比以細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)單位更為可取。此外，如果同時(shí)評(píng)價(jià)幾個(gè)不同因素的效應(yīng)，應(yīng)注意均衡的原則，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)應(yīng)可以區(qū)分不同因素的貢獻(xiàn)并分別估計(jì)。

17、 樣本的代表性要求具有同質(zhì)性，即各處理組和對(duì)照組的非實(shí)驗(yàn)因素的條件均一致，為此，各實(shí)驗(yàn)單位(動(dòng)物或培養(yǎng)物)的分組及整個(gè)實(shí)驗(yàn)的全部操作都應(yīng)遵循隨機(jī)化原則。在利用形態(tài)學(xué)指標(biāo)的毒理學(xué)試驗(yàn)，必須采用盲法觀察結(jié)果，以消除實(shí)驗(yàn)者觀察結(jié)果的偏性。樣本應(yīng)有足夠的大小和適當(dāng)?shù)闹貜?fù)次數(shù)，以估計(jì)處理之間、實(shí)驗(yàn)室內(nèi)和實(shí)驗(yàn)室間的變異性。一般可根據(jù)顯著性水準(zhǔn)、檢驗(yàn)把握度、容許誤差、總體標(biāo)準(zhǔn)差等來(lái)估計(jì)樣本的大小。 嚴(yán)格執(zhí)行毒理學(xué)試驗(yàn)設(shè)計(jì)的上述要求，才可能得到可靠性和重復(fù)性良好的結(jié)果，也是進(jìn)行正確的統(tǒng)計(jì)學(xué)評(píng)價(jià)的基礎(chǔ)。良好的質(zhì)量保證和實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)可以監(jiān)控系統(tǒng)誤差，而統(tǒng)計(jì)處理則用來(lái)確定隨機(jī)誤差。 毒理學(xué)試驗(yàn)的數(shù)據(jù)通常是由劑量水平和相

18、應(yīng)觀察值組成的二維關(guān)系型數(shù)據(jù)。毒理學(xué)試驗(yàn)處理組與陰性對(duì)照組觀察值均數(shù)的比較，如果資料可擬合某種分布，則適用于參數(shù)檢驗(yàn)，其敏感度和效率高于非參數(shù)檢驗(yàn)；如資料不能擬合某些已知的分布，則應(yīng)進(jìn)行數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換，以滿足正態(tài)性和方差齊性。如果任何變換都不能改善數(shù)據(jù)的分布，可能存在個(gè)別可疑值，應(yīng)予以識(shí)別和剔除。另一方面，可使用不依賴總體分布模型的非參數(shù)統(tǒng)計(jì)分析。 一種毒理學(xué)試驗(yàn)資料可以有若干種正確的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法，但可能不存在唯一正確的方法。其原因主要是表面上不同的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法常以相同的統(tǒng)計(jì)學(xué)概念和模型為基礎(chǔ)。另一方面，利用不同的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法來(lái)評(píng)價(jià)毒理學(xué)試驗(yàn)資料缺乏比較研究。 .各處理組與陰性對(duì)照組兩兩比較和多個(gè)

19、處理組與陰性對(duì)照組比較各處理組與陰性對(duì)照組兩兩比較和多個(gè)處理組與陰性對(duì)照組比較常用的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法見(jiàn)表1-3。表1-3 各處理組與陰性對(duì)照組兩兩比較和多個(gè)比較的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法類 型連續(xù)性數(shù)據(jù)， 正態(tài)分布離散性數(shù)據(jù)分布未知方差齊方差不齊二項(xiàng)分布泊松分布處理組與陰性對(duì)照組兩兩比較t 檢驗(yàn)t 檢驗(yàn)卡方檢驗(yàn)，fisher確切概率法，u檢驗(yàn)u檢驗(yàn)非參數(shù)法，如wilcoxon秩和檢驗(yàn)多個(gè)處理組與陰性對(duì)照組比較dunnett檢驗(yàn)(1955)改進(jìn)的dunnett 檢 驗(yàn)(1980)平方根反正弦轉(zhuǎn)換，再用dunnett檢驗(yàn)，或者simes法(1986)suissa和salmi法(1989)非參數(shù)法，如多重比較秩和檢驗(yàn)(

20、steel，1959).劑量-效應(yīng)關(guān)系和劑量-反應(yīng)關(guān)系 劑量-效應(yīng)關(guān)系和劑量-反應(yīng)關(guān)系是毒理學(xué)研究的重要內(nèi)容。在急性毒性(ld50)研究中，就是典型的劑量-反應(yīng)關(guān)系研究，ld50是統(tǒng)計(jì)學(xué)的點(diǎn)值估計(jì)和區(qū)間估計(jì)。在其他毒理學(xué)試驗(yàn)中的陽(yáng)性劑量-效應(yīng)關(guān)系和劑量-反應(yīng)的確定也應(yīng)通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理和判定，盡管，可以用各處理組與陰性對(duì)照組兩兩比較和各處理組間兩兩比較，發(fā)現(xiàn)高劑量組與中、低劑量組及對(duì)照組間差別有顯著性，中劑量組與低劑量組和對(duì)照組間差別有顯著性，低劑量組與對(duì)照組間差別無(wú)顯著性，來(lái)證明有劑量-反應(yīng)關(guān)系；但這種方法的效率較低。劑量-效應(yīng)關(guān)系和劑量-反應(yīng)的判定可以分為定性和定量統(tǒng)計(jì)學(xué)兩大類。劑量-效應(yīng)關(guān)系

21、和劑量-反應(yīng)關(guān)系的統(tǒng)計(jì)學(xué)定性分析即為趨勢(shì)檢驗(yàn)，而統(tǒng)計(jì)學(xué)定量分析則為模型擬合。趨勢(shì)檢驗(yàn)是檢驗(yàn)對(duì)自變量“規(guī)定的水平，反應(yīng)的觀察值增高或降低的趨勢(shì)的顯著性。當(dāng)自變量s為定量數(shù)據(jù)時(shí)，則可進(jìn)行模型擬合，即劑量-反應(yīng)關(guān)系的定量研究。趨勢(shì)試驗(yàn)(trend testing)，劑量為xi；反應(yīng)為i，當(dāng)有x0x1xk，無(wú)效假設(shè)為h0：i0.=k 備擇假設(shè)為ha：i0k或i0k單調(diào)上升或單調(diào)下降趨勢(shì)。如反應(yīng)i為連續(xù)資料服從正態(tài)分布，當(dāng)xi為定量數(shù)據(jù)，則可選用簡(jiǎn)單的線性回歸或加權(quán)線性回歸；如反應(yīng)i為離散資料服從二項(xiàng)分布或泊松分布，可選用cochran-armitage趨勢(shì)檢驗(yàn)；如果樣本所屬的總體分布未知，則可利用非參

22、數(shù)法加jonckheere-terstra趨勢(shì)檢驗(yàn)(jonckheere，1954)。 在毒理學(xué)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法中最主要的發(fā)展是劑量-反應(yīng)關(guān)系的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法、超離差(overdispersion)計(jì)數(shù)資料的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法及廣義線性模型(generalized linear model)。這些方法，可以利用統(tǒng)計(jì)程序包如sas，genstat等來(lái)實(shí)現(xiàn)。. 對(duì)常規(guī)毒理學(xué)試驗(yàn)資料推薦的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法(cad等，1994)a 體重和器官重量：體重常是毒性效應(yīng)最敏感的指標(biāo)之一。如果每組樣品量足夠大(10或10個(gè)以上)，可用下述方法：器官重量計(jì)算為體重的百分比。按體重或體重改變分析。如在試驗(yàn)開(kāi)始，動(dòng)物隨機(jī)化分組(各組

23、體重均數(shù)差別無(wú)顯著性，各組所有的動(dòng)物體重在總平均體重的2個(gè)sd之內(nèi))，利用體重改變分析比較好。對(duì)各組資料利用bartlett方差齊性試驗(yàn)，檢測(cè)方差齊性。根據(jù)方差齊性或不齊，決定進(jìn)一步的統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)。如果樣本量較小，可利用kruskal-wallis非參數(shù)檢測(cè)。 b 臨床化學(xué)：過(guò)去一般用t檢驗(yàn)或anova，但并非是最適當(dāng)?shù)姆椒?。因?yàn)檫@些生化參數(shù)很少是彼此獨(dú)立的。通常，所研究的并不是單獨(dú)某一個(gè)參數(shù)，而是與靶器官毒作用有關(guān)的一組參數(shù)，如cpk，hbdh和ldh同時(shí)增高強(qiáng)烈指示心肌損害。這時(shí)我們并不只是注意其中一個(gè)參數(shù)的增高，而是全部3個(gè)參數(shù)。而血清電解質(zhì)(如鈉、鉀、鈣)常相互影響，一種降低常伴另一種增

24、加。而且資料的性質(zhì)，由于這些參數(shù)的生物學(xué)性質(zhì)或測(cè)定的方法，常不服從正態(tài)分布(為偏態(tài)分布)或?yàn)榉沁B續(xù)的，如肌苷、鈉、鉀、氯、鈣和血尿素氮。臨床化學(xué)資料適用的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：anova，bartlett檢驗(yàn)和或f檢驗(yàn)，t-檢驗(yàn)，適用于：鈣、葡萄糖、bun、肌苷、膽堿脂酶、總蛋白、白蛋白、hbdh、alp、cpk、ldh、alt、ast及血紅蛋白。kruskal-wallis非參數(shù)anova適用于：總膽紅素、ggt。 c 血液學(xué)：不同物種、品系的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血液學(xué)檢查的數(shù)據(jù)，所服從的分布也可能是不同的。這些參數(shù)的大部分是相互有關(guān)的，并依賴于所用的測(cè)定方法。rbc數(shù)、血小板數(shù)和mcv可用儀器測(cè)定，數(shù)據(jù)適用于參

25、數(shù)檢驗(yàn)。紅細(xì)胞壓積(hct)是由rbc和mcv得到的計(jì)算值，故依賴于此兩個(gè)參數(shù)；但如直接測(cè)定，也可用參數(shù)檢驗(yàn)。 血紅蛋白是直接測(cè)定的并是獨(dú)立的連續(xù)數(shù)據(jù)。但如同時(shí)存在血紅蛋白的多種形態(tài)(氧血紅蛋白、脫氧血紅蛋白、高鐵血紅蛋白等)，則可能不是典型的正態(tài)分布，而呈多模型分布。 此時(shí)可用wilcoxon檢驗(yàn)或多重秩和檢驗(yàn)。 wbc總數(shù)服從正態(tài)分布，并適用于參數(shù)檢驗(yàn)。而wbc的分類或報(bào)告為百分比或乘以wbc總數(shù)得“絕對(duì)”分類wbc數(shù)。這些資料，特別是嗜酸性粒細(xì)胞不符合正態(tài)分布，應(yīng)該用非參數(shù)統(tǒng)計(jì)。 應(yīng)注意，單個(gè)參數(shù)的變化很少有生物學(xué)意義，因?yàn)檫@些參數(shù)是相互有關(guān)的，應(yīng)注意發(fā)現(xiàn)并分析預(yù)期的參數(shù)變化譜。 d 組

26、織病理學(xué)損害發(fā)生率：在亞慢性和慢性毒性試驗(yàn)，強(qiáng)調(diào)了組織病理學(xué)檢查。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析是評(píng)價(jià)處理組動(dòng)物組織病理學(xué)損害發(fā)生率是否高于對(duì)照組動(dòng)物。除了癌發(fā)生率外，也應(yīng)注重發(fā)現(xiàn)其他病理?yè)p害。在處理組和對(duì)照組動(dòng)物病理?yè)p害發(fā)生率比較常用卡方檢驗(yàn)或fisher精確檢驗(yàn)。利用雙側(cè)檢驗(yàn)還是單側(cè)檢驗(yàn)取決于研究者的要求。對(duì)于多重比較可用bonferroni法，而且可利用趨勢(shì)檢驗(yàn)來(lái)評(píng)價(jià)劑量-反應(yīng)關(guān)系。 e 生殖毒性：對(duì)生殖毒性的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，是以窩(或妊娠雌性動(dòng)物)為實(shí)驗(yàn)單位，而不是幼體。生殖毒性試驗(yàn)一般可得4個(gè)變量：生育力指數(shù)(fi)、受孕指數(shù)(gi)、存活力指數(shù)(vi)和哺育指數(shù)(li)。對(duì)這些變量，如樣本數(shù)為10或10以

27、上可利用wilcoxon-mann-whitney u檢驗(yàn)或kruska1-wallis非參數(shù)anova。如樣本數(shù)小于10，則可用wilcoxon秩和檢驗(yàn)(用于2組比較)或aruskal-wallis非參數(shù)anova(用于3組或3組以上的比較)。 f 致畸試驗(yàn)：每組應(yīng)有20只妊娠動(dòng)物。并且，實(shí)驗(yàn)單位為窩，而不是胎體。如樣本數(shù)為10或10以上，可近似為正態(tài)，利用參數(shù)檢驗(yàn)(如卡方檢驗(yàn)、t-檢驗(yàn)或anova)、來(lái)評(píng)價(jià)結(jié)果。當(dāng)樣本數(shù)小于10，可用非參數(shù)檢驗(yàn)(wilcoxon秩和檢驗(yàn)或kruskal-wallis非參數(shù)anova)。此外，wilcoxon-mann-whitney u檢驗(yàn)也廣泛用于致畸試

28、驗(yàn)。 g 飼料和染毒柜中受試物濃度分析：當(dāng)受試物摻入飼料進(jìn)行喂飼試驗(yàn)，或?yàn)闅馊苣z吸入試驗(yàn)，應(yīng)定期測(cè)定飼料中受試物濃度和染毒柜中受試物氣溶膠的濃度。采樣應(yīng)隨機(jī)并有代表性。一般要求飼料或空氣中濃度應(yīng)在預(yù)定濃度的10之內(nèi)；顯著增高的峰濃度可能超過(guò)代謝或修復(fù)系統(tǒng)能力，出現(xiàn)急性毒作用。如果不了解飼料空氣中真實(shí)的暴露水平，可能錯(cuò)誤地解釋該受試物的低水平慢性毒性。氣溶膠顆粒直徑分級(jí)采樣可能得到分類資料(如100m，10025m，2510m，103m等)，這種資料應(yīng)該用幾何均數(shù)及其標(biāo)準(zhǔn)差來(lái)描述。 h 致突變性試驗(yàn)：絕大多數(shù)遺傳毒理學(xué)短期試驗(yàn)(stt)的觀察值為計(jì)數(shù)資料(如突變體數(shù)、畸變數(shù)、sce數(shù))或是相對(duì)數(shù)

29、(如存活細(xì)胞的突變頻率)，因此stt結(jié)果的統(tǒng)計(jì)學(xué)主要是對(duì)離散性資料的統(tǒng)計(jì)學(xué)推斷。 最常用的遺傳毒理學(xué)試驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法： a) ames試驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)學(xué)評(píng)價(jià)：ames試驗(yàn)的結(jié)果每平板回變菌落數(shù)的分布不完全服從泊松分析，有超離差現(xiàn)象；并且，其劑量反應(yīng)曲線呈先上升后下降的傘形。ames等l975年提出2倍判斷標(biāo)準(zhǔn)，在1983年改進(jìn)的方法中已不再推薦。2倍判斷標(biāo)準(zhǔn)有較大的缺點(diǎn)，此判斷標(biāo)準(zhǔn)不是統(tǒng)計(jì)學(xué)判斷，對(duì)自發(fā)回變率較高的菌株偏嚴(yán)，而對(duì)自發(fā)回變率較低的菌株偏松。已發(fā)展了幾種統(tǒng)計(jì)學(xué)方法用于ames試驗(yàn)的假設(shè)檢驗(yàn)和劑量反應(yīng)研究。kim和margolin等(1999)利用基于生物學(xué)的機(jī)制模型，發(fā)展了salm程序，

30、用于ames試驗(yàn)結(jié)果的判斷。 b) 遺傳毒理學(xué)體內(nèi)試驗(yàn)：(包括微核試驗(yàn)、染色體畸變?cè)囼?yàn)和顯性致死試驗(yàn))的統(tǒng)計(jì)學(xué)評(píng)價(jià)：adler等(1998)提出了3步法。確定實(shí)驗(yàn)結(jié)果是否可接受。如果同時(shí)進(jìn)行的陰性對(duì)照的均數(shù)在歷史性對(duì)照的均數(shù)3sd之內(nèi)，則該實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以接受。如果不接受，則應(yīng)重新進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。劑量-反應(yīng)分析。利用同時(shí)進(jìn)行的陰性對(duì)照資料進(jìn)行劑量-反應(yīng)趨勢(shì)檢驗(yàn)。有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性的陽(yáng)性趨勢(shì)表明受試物處理的效應(yīng)。評(píng)價(jià)各個(gè)處理組反應(yīng)，然后將各個(gè)處理組的均數(shù)分別與歷史性陰性對(duì)照比較，如各個(gè)處理組均未顯示差別顯著性，但趨勢(shì)檢驗(yàn)有顯著性意義，此實(shí)驗(yàn)結(jié)果的解釋需要生物學(xué)判斷。如果趨勢(shì)無(wú)顯著性，但經(jīng)多重比較校正后僅一個(gè)處

31、理組與歷史性陰性對(duì)照比較差別有顯著性(simes rjbiometrics l986；73：751-754)，則此試驗(yàn)結(jié)果的解釋也需要生物學(xué)判斷。這時(shí)，可認(rèn)為該實(shí)驗(yàn)的結(jié)果為可疑。同時(shí)陰性對(duì)照與歷史性對(duì)照-重新試驗(yàn)(均數(shù)3sd)比較 在范圍之外在范圍之內(nèi)用同時(shí)陰性對(duì)照進(jìn)行趨勢(shì)檢驗(yàn)有顯著性 無(wú)顯著性各處理組與歷史 各處理組與歷史性陰性對(duì)照比較 性陰性對(duì)照比較有顯著性 無(wú)顯著性 有顯著性 有顯著性陽(yáng)性 可疑 陰性圖5-2 遺傳毒理學(xué)體內(nèi)試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)評(píng)價(jià)的程序。i 行為毒理學(xué)：行為毒理學(xué)試驗(yàn)一般得到4種類型的資料：觀察的記分值，來(lái)自開(kāi)闊場(chǎng)試驗(yàn)等；反應(yīng)率，來(lái)自舔液，總活動(dòng)或壓桿；錯(cuò)誤率，來(lái)自學(xué)習(xí)-記憶試驗(yàn)

32、到達(dá)終點(diǎn)的時(shí)間。對(duì)這些數(shù)據(jù)常用的和推薦的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法見(jiàn)表1-4。行為發(fā)育毒性和生殖毒性研究的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法也見(jiàn)表1-4，在斷乳前應(yīng)以窩為實(shí)驗(yàn)單位進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。表1-4 行為毒理學(xué)的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 (gad等，1994)觀察類型 常用的方法 推薦的方法觀察記分值 t檢驗(yàn)或單例anova kruskal-wallis非參數(shù)anova或wilcoxon秩和檢驗(yàn)反應(yīng)率 t檢驗(yàn)或單側(cè)anova kruskalwallisanova或一側(cè)anova錯(cuò)誤率 anova檢驗(yàn)，再進(jìn)行post hoc檢驗(yàn) fisher精確檢驗(yàn)或 rc卡方，mannwhitney u檢驗(yàn)到達(dá)終點(diǎn)時(shí)間 t檢驗(yàn)或側(cè)anova anova檢驗(yàn)再進(jìn)行p

33、ost hoc檢驗(yàn)或kruskal-wallis anovaa行為發(fā)育或生殖試驗(yàn) anova檢驗(yàn)，再分別進(jìn)行檢驗(yàn) fisher精確檢驗(yàn)或kruskal-wallis非參數(shù)an0va 或mann-whituey u檢驗(yàn)2、統(tǒng)計(jì)學(xué)意義和生物學(xué)意義 在評(píng)價(jià)毒理學(xué)試驗(yàn)結(jié)果時(shí)，要綜合評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義和生物學(xué)意義。 一般來(lái)說(shuō)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義是具有生物學(xué)意義的必要條件之一。正確地利用統(tǒng)計(jì)學(xué)假設(shè)檢驗(yàn)的結(jié)果有助于確定實(shí)驗(yàn)結(jié)果的生物學(xué)關(guān)聯(lián)。在判斷生物學(xué)意義(即生物學(xué)重要性)時(shí)，可考慮以下步驟。 (1) 縱向比較：此參數(shù)的改變有無(wú)劑量-反應(yīng)關(guān)系?；瘜W(xué)物毒作用的劑量-反應(yīng)關(guān)系是毒理學(xué)研究的基本假設(shè)。當(dāng)某參數(shù)的

34、改變存在陽(yáng)性劑量-反應(yīng)關(guān)系，就可認(rèn)為此參數(shù)的改變與受試物染毒有關(guān)，具有生物學(xué)意義。 (2) 橫向比較：此參數(shù)的改變是否伴有其他相關(guān)參數(shù)的改變。例如，生化參數(shù)很少是彼此獨(dú)立的，單個(gè)劑量組的一個(gè)參數(shù)有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性的改變一般不認(rèn)為有生物學(xué)意義，除非此改變?yōu)槠渌麉?shù)改變所支持。如沒(méi)有骨髓或脾組織學(xué)改變或沒(méi)有高鐵血紅蛋白生成，則單有紅細(xì)胞計(jì)數(shù)的改變是沒(méi)有生物學(xué)意義的。同樣，在免疫毒理學(xué)中，單有淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)的改變不伴有淋巴結(jié)組織學(xué)改變也可能是沒(méi)有生物學(xué)意義的。 (3) 與歷史性對(duì)照比較：由于目前尚無(wú)公認(rèn)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物參考“正?！敝?，應(yīng)由本實(shí)驗(yàn)室利用相同品系的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和相同的溶劑，進(jìn)行至少10次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的陰性(

35、溶劑)對(duì)照的資料構(gòu)成，以其均值1. 96標(biāo)準(zhǔn)誤作為參考值的范圍。同時(shí)進(jìn)行的陰性對(duì)照應(yīng)在歷史性對(duì)照的均數(shù)3sd范圍之內(nèi)，否則應(yīng)重新試驗(yàn)。另有認(rèn)為，凡某種觀察值與對(duì)照組比較，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(p0.05)，并符合下列情況之一者，即可認(rèn)為已偏離正常參考值范圍，屬于有害作用。其數(shù)值不在正常參考值范圍之內(nèi)；其數(shù)值在正常參考值范圍之內(nèi)，但在停止接觸后，此種差異仍持續(xù)一段時(shí)間；其數(shù)值在正常參考值范圍之內(nèi)，但如機(jī)體處于功能或生化應(yīng)激狀態(tài)下，此種差異更加明顯。應(yīng)該指出，后兩種情況需要附加的試驗(yàn)設(shè)計(jì)。 另外，還有一些其他的考慮。如處理組同時(shí)與對(duì)照組兩組均數(shù)之差值應(yīng)超過(guò)檢測(cè)誤差的兩倍以上。某些血液生化指標(biāo)(如a

36、st、alt等)的測(cè)定值升高才有生物學(xué)意義。當(dāng)處理組數(shù)據(jù)與陰性對(duì)照組比較差別有顯著性，并且經(jīng)分析認(rèn)為是與處理有關(guān)的生物學(xué)效應(yīng)，應(yīng)進(jìn)一步判斷其為有害效應(yīng)還是非有害效應(yīng)。決定一種效應(yīng)是否為有害作用需要專家的判斷。不同指標(biāo)或參數(shù)的生物學(xué)意義和重要性是不同的。在分析和綜合評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義和生物學(xué)意義時(shí)，可能遇到四種情況，見(jiàn)表1-5。在此表中，第和第種情況最為常見(jiàn)，第種情況是無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義也無(wú)生物學(xué)意義，第種情況是有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義也有生物學(xué)意義。但是有時(shí)在實(shí)驗(yàn)結(jié)果中會(huì)出現(xiàn)第和第種情況。表1-5 毒理學(xué)試驗(yàn)結(jié)果的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義和生物學(xué)意義生物學(xué)意義統(tǒng)計(jì)學(xué)意義無(wú) 有無(wú)有 第種情況是有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義但無(wú)生物學(xué)意義，

37、例如在某個(gè)亞慢性毒性試驗(yàn)中，中劑量組動(dòng)物血液白細(xì)胞計(jì)數(shù)低于陰性對(duì)照組，差別有顯著性(p0.05)。由于在此實(shí)驗(yàn)結(jié)果中未出現(xiàn)劑量-反應(yīng)關(guān)系，因此中劑量組血液白細(xì)胞計(jì)數(shù)降低可能是由于偶然因素造成的，沒(méi)有生物學(xué)意義。但是，如果僅在高劑量組動(dòng)物血液白細(xì)胞計(jì)數(shù)降低，與陰性對(duì)照組比較差別有顯著性（p0.05)，但還應(yīng)該認(rèn)為是有生物學(xué)意義的。 利用一種以上的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，當(dāng)某種效應(yīng)在一個(gè)物種出現(xiàn)而在另一物種不出現(xiàn)，或一個(gè)物種遠(yuǎn)比另一物種敏感時(shí)，則使結(jié)果的解釋復(fù)雜化，難以確定以哪個(gè)物種的實(shí)驗(yàn)結(jié)果外推到人最為合適。除非有足夠的資料(通常是比較毒動(dòng)學(xué)或毒效學(xué)資料)可以表明最合適的物種，一般是以最敏感的物種來(lái)確定noa

38、el和安全限值。以上我們討論了毒理學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)，介紹了對(duì)外源化學(xué)物進(jìn)行毒性評(píng)價(jià)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、實(shí)施、結(jié)果分析等各個(gè)環(huán)節(jié)。實(shí)驗(yàn)的質(zhì)量控制是保證實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)具有科學(xué)性、準(zhǔn)確性和公正性的先決條件。沒(méi)有質(zhì)量保證，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的可靠性是無(wú)法肯定的。我們?cè)诎踩远纠韺W(xué)試驗(yàn)設(shè)計(jì)、實(shí)施、總結(jié)報(bào)告的各個(gè)環(huán)節(jié)上，應(yīng)該自覺(jué)、主動(dòng)地遵循glp原則，逐步從人員的組成和職責(zé)、設(shè)施、設(shè)備、質(zhì)量保證部門(mén)(qau)、標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程(sop)、受試品與對(duì)照品、實(shí)施方案、實(shí)驗(yàn)記錄和總結(jié)報(bào)告等各個(gè)方面落實(shí)glp。實(shí)驗(yàn)二 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的一般操作技術(shù)一、目的和意義 毒理學(xué)研究需要用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物來(lái)進(jìn)行各種實(shí)驗(yàn)，通過(guò)對(duì)動(dòng)物的實(shí)驗(yàn)觀察和分析來(lái)研究毒作用，獲得毒

39、物的毒性、劑量反應(yīng)關(guān)系、毒作用機(jī)制等方面的資料，因此動(dòng)物實(shí)驗(yàn)是毒理學(xué)研究中重要的手段之一。 通過(guò)本次實(shí)習(xí)學(xué)習(xí)毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)中有關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的基本操作技術(shù)，掌握實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇、動(dòng)物抓取、染毒方法和生物材料的采集等技術(shù)。二、內(nèi)容(一)健康動(dòng)物的選擇 無(wú)論選擇哪種種屬品系的動(dòng)物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，均要求選擇健康的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。健康動(dòng)物檢查時(shí)要求達(dá)到：外觀體形豐滿，被毛濃密有光澤、緊貼體表，眼睛明亮，行動(dòng)迅速，反應(yīng)靈活，食欲及營(yíng)養(yǎng)狀況良好。選擇時(shí)重點(diǎn)檢查以下項(xiàng)目： 1眼睛 明亮，瞳孔雙側(cè)等圓，無(wú)分泌物。 2耳 耳道五分泌物溢出，耳殼無(wú)膿瘡。 3鼻 無(wú)噴嚏，無(wú)漿性粘液分泌物。 4皮膚 無(wú)創(chuàng)傷、無(wú)膿瘡、疥癬、濕疹。 5頸部

40、要求頸項(xiàng)端正，如有歪斜提示可能存在內(nèi)耳疾患，不應(yīng)選作實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。 6，消化道 無(wú)嘔吐、腹瀉，糞便成形，肛門(mén)附近被毛潔凈。 7神經(jīng)系統(tǒng) 無(wú)震顫、麻痹。若動(dòng)物(大鼠、小鼠)出現(xiàn)圓圈動(dòng)作或提尾倒置呈圓圈擺動(dòng),應(yīng)放棄該動(dòng)物。 8四肢及尾 四肢、趾及尾無(wú)紅腫及潰瘍。 (二)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的性別鑒定 動(dòng)物性別不同對(duì)毒物的敏感性也不同，這可能與性激素、肝微粒體羥基化反應(yīng)有關(guān)，也隨受試物而異。因此，要根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求選擇性別，一般實(shí)驗(yàn)如對(duì)性別無(wú)特殊要求者，宜選用雌雄動(dòng)物各半。1大鼠、小鼠 主要依肛門(mén)與生殖器孔間的距離加以區(qū)分。間距大者為雄性，小者為雌性。雌性生殖器與肛門(mén)之間有一無(wú)毛小溝，距離較近。雄性可見(jiàn)明顯的陰囊，生殖

41、器突起較雌鼠大,肛門(mén)和生殖器之間長(zhǎng)毛。另外成年雄性臥位可見(jiàn)到睪丸,雌性在腹部可見(jiàn)乳頭。圖2-1 雌雄動(dòng)物肛門(mén)與外生殖器間距離2豚鼠 用一只手抓住豚鼠頸部，另一只手扒開(kāi)靠生殖器孔的皮膚，雄性動(dòng)物在圓孔中露出性器官的突起，雌性動(dòng)物則顯出三角形間隙，成年雌性豚鼠胸部有兩個(gè)乳頭。 3家兔 將家兔頭輕輕夾在實(shí)驗(yàn)者左腋窩下，左手按住腰背部，右手拉開(kāi)尾巴并將尾巴夾在中指和無(wú)名指中間，然后用拇指和食指稍稍把生殖器附近的皮膚扒開(kāi)。雄兔即可見(jiàn)到一圓孔中露出圓錐形稍向下彎曲的陰莖(但幼年雄兔看不到明顯的陰莖，只能看到圓孔中有凸起物，即是陰莖)。雌兔此處則為一條朝向尾巴的長(zhǎng)縫，呈橢圓形的間隙，間隙越向下越窄，此即為陰

42、道開(kāi)口處。 圖2-2 兔雌雄生殖器外型特征與差異(三)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的抓取方法 正確地抓取固定動(dòng)物，是為了在不損害動(dòng)物健康、不影響觀察指標(biāo)、并防止被動(dòng)物咬傷的前提下，確保實(shí)驗(yàn)順利進(jìn)行。1小鼠的抓取方法 首先用右手從籠盒內(nèi)抓取鼠尾提起，注意不可抓尾尖（見(jiàn)圖a），放在鼠籠蓋或?qū)嶒?yàn)臺(tái)上向后拉（見(jiàn)圖b），在其向前爬行時(shí)，迅速用左手拇指和食指抓住小鼠的兩耳和頸部皮膚（見(jiàn)圖c），將鼠體置于左手心中，把后肢拉直，以無(wú)名指按住鼠尾，小指按住后腿即可（見(jiàn)圖d）。d圖2-3 小鼠的抓取2大鼠的抓取方法 大鼠的抓取基本同小鼠，只是大鼠比小鼠性情兇猛，不易用襲擊方法抓取。為避免咬傷，可帶上帆布或棉紗手套。采用左手固定法，用

43、拇指和食指捏住鼠耳，余下三指緊捏鼠背皮膚，置于左掌心中，這樣右手可進(jìn)行各種實(shí)驗(yàn)操作。 a b圖2-4 大鼠的抓取3豚鼠的抓取方法 豚鼠膽小易驚，在抓取時(shí)要穩(wěn)、準(zhǔn)、迅速。用手掌迅速扣住鼠背，抓住其肩胛上方，以拇指和食指環(huán)握頸部（見(jiàn)圖a），另一只手托住臀部即可（見(jiàn)圖b）。 a b圖2-5 豚鼠的抓取4兔的抓取方法 用右手抓住兔頸部的毛皮提起，然后左手托住其臀部或腹部，讓其體重的大部分重量集中在左手上。注意不要抓取雙耳或抓提腹部。圖2-6 兔的抓取(四)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物稱重、編號(hào)、標(biāo)記方法 1稱重 大、小鼠秤的感應(yīng)量需在01g以下。根據(jù)實(shí)驗(yàn)的不同要求，選擇一定數(shù)量的大、小鼠，體重要求在同一組內(nèi)、同性別動(dòng)物體

44、重差異應(yīng)小于平均體重的10，不同組間同性別動(dòng)物體重均值差異應(yīng)小于5。 2編號(hào) 動(dòng)物編號(hào)方法有多種。大、小鼠常用方法如下：(1)染色法：染色法是用化學(xué)劑在動(dòng)物身體明顯部位如皮毛、四肢等處進(jìn)行涂染，或用不同顏色等來(lái)區(qū)別各組動(dòng)物，是實(shí)驗(yàn)室最常用、最容易掌握的方法。常用的標(biāo)記液有苦味酸酒精飽和溶液（黃色）。標(biāo)記時(shí)，用標(biāo)記筆 取上述溶液，在動(dòng)物體表不同部位涂上斑點(diǎn)，以示不同號(hào)碼。一般把涂在右前肢上的記為1號(hào)，按順時(shí)針?lè)较?，依次右后肢?號(hào)，左后肢為3號(hào)，左前肢為4號(hào)，頭部為5號(hào)(見(jiàn)圖2-7a)，6-10則由以上5個(gè)基本數(shù)復(fù)合而成，比如6號(hào)則是在頭部和右前肢標(biāo)記各一(見(jiàn)圖2-7b )，7號(hào)為在頭部和右后肢

45、體標(biāo)記 一，以此類推。在動(dòng)物的背部劃一長(zhǎng)條為10號(hào)。10號(hào)以上均由上述復(fù)合方法進(jìn)行編號(hào)。例如：16號(hào)是在頭部、右前肢、背部均有標(biāo)記(見(jiàn)圖2-7c)。 圖2-7a 圖2-7b 圖2-7c(2)剪耳法：在耳朵不同部位剪一小孔代表某個(gè)號(hào)碼。常以右耳代表個(gè)位，左耳代表十位?；蚺c染色法配合使用，右耳剪孔代表十位。圖2-8 小動(dòng)物剪耳法標(biāo)記號(hào)碼(3)烙印法：是用刺數(shù)鉗在動(dòng)物耳上刺上號(hào)碼，然后用棉簽蘸著溶在酒精中的黑墨在刺號(hào)上加以涂抹，烙印前最好對(duì)烙印部位預(yù)先用酒精消毒。(4)號(hào)牌法：用金屬的牌號(hào)固定于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的耳上，大動(dòng)物可系于頸上。(五)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的分組方法為了得到客觀的劑量反應(yīng)關(guān)系，應(yīng)將一群動(dòng)物按統(tǒng)計(jì)學(xué)

46、原則隨機(jī)分配到各個(gè)實(shí)驗(yàn)組中?？砂措S數(shù)字表方法進(jìn)行隨機(jī)分組（見(jiàn)隨機(jī)數(shù)字表方法分組說(shuō)明）。但小動(dòng)物的年齡和體重呈正相關(guān)，而年齡又與毒物代謝動(dòng)力學(xué)密切相關(guān)。為了減少實(shí)驗(yàn)各組動(dòng)物間的體重差異，在實(shí)際工作中常采用體重均衡法（簡(jiǎn)化分層隨機(jī)法）進(jìn)行分組，即將同一性別的動(dòng)物按體重大小順序排列，分組時(shí)由體重小的到大的，依次隨機(jī)分配到各組。一種性別的動(dòng)物分完以后，再分配另一種性別的動(dòng)物。各組雌雄性動(dòng)物的數(shù)目應(yīng)盡可能相等。體重均衡法分配方法如下：第一步 將動(dòng)物按體重分組以急性毒性實(shí)驗(yàn)時(shí)使用小鼠為例，一般按照 18g，19g，20g，21g，22g，23g，24g分為7組，所有動(dòng)物稱重后放入相應(yīng)的體重組中。第二步 將

47、同一體重段的動(dòng)物均勻分配至各試驗(yàn)組中 從最低體重組中隨意取出一只動(dòng)物放入實(shí)驗(yàn)組第一組，第二只動(dòng)物放入第二組，以此類推，直到該組動(dòng)物用完。再?gòu)南乱惑w重組中隨意取出動(dòng)物，依次放入各實(shí)驗(yàn)組直至實(shí)驗(yàn)各組均得到一只動(dòng)物。如此反復(fù)循環(huán)操作，將所有動(dòng)物分完為止，結(jié)果會(huì)使體重相近的動(dòng)物被均勻分布到各實(shí)驗(yàn)組中。隨機(jī)數(shù)字表方法分組說(shuō)明： 例如：設(shè)將30只雄性動(dòng)物平均分成 a、b、c、d、e、f 六組，每組5只動(dòng)物。將巳編號(hào)的動(dòng)物以號(hào)碼按隨機(jī)數(shù)字表進(jìn)行分配。如選隨機(jī)數(shù)字表第二行，從第一個(gè)數(shù)字開(kāi)始，順次抄下30個(gè)數(shù)字（可依橫行、豎行或斜行抄錄）。將每個(gè)數(shù)字一律除以6（組數(shù)），根據(jù)余數(shù) 1、2、3、4、5、0（整除者）

48、分別將動(dòng)物分配到a、b、c、d、e、f 組，結(jié)果見(jiàn)表1（數(shù)字源見(jiàn)第二行駛隨機(jī)數(shù)字表）表2-1 動(dòng)物隨機(jī)分組表動(dòng)物號(hào) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15隨機(jī)數(shù)字 97 74 24 67 62 42 81 14 57 20 42 53 32 37 32除6余數(shù) 1 2 0 1 2 0 3 2 3 2 0 5 2 1 2分 組 a b f a b f c b c b f e b a b動(dòng)物號(hào) 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30隨機(jī)數(shù)字 27 7 36 7 51 24 51 79 89 73 16 76 62 2

49、7 66除6余數(shù) 3 1 0 1 3 0 3 1 5 1 4 4 2 3 0分 組 c a f a c f c a e a d d b c f按上法分組后，a組有動(dòng)物7只，b組7只，c組6只，d組與 e組各2只，f組6只。為了使每組動(dòng)物數(shù)均為5只，需要根據(jù)隨機(jī)分配的原則再選出2只a組和1只c組動(dòng)物給d組。b組選出2只，f組選出1只給e組。具體方法如下：繼續(xù)抄下隨機(jī)數(shù)字分別除以a、b、c、f組的動(dòng)物數(shù)，既56/7（7為a組動(dòng)物數(shù)）整除，余數(shù)為0，將a組第7只動(dòng)物（25號(hào)）調(diào)配給d組；下一個(gè)：50/6（6為a組動(dòng)物數(shù)）余2，將a組第2只動(dòng)物（4號(hào)）調(diào)配給d組；接下來(lái)26/6（6為c組動(dòng)物數(shù)）余2，將c組第2只動(dòng)物（9號(hào)）給d組。余類推，最后調(diào)整分組成表2所示。雌性動(dòng)物也按上法分組，然后將雌、雄動(dòng)物合組進(jìn)行試驗(yàn)。表2-2 30只動(dòng)物隨機(jī)分組 組 別 鼠 號(hào)組 別 鼠 號(hào) a 1，14，17，19，23 b 5，8， 10，13，15 c 7，16，20，22，29d 4， 9，25，26，27e 2， 6，12，24，28f 3，11，18，21，30附表：隨機(jī)數(shù)字表 (六)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物被毛去除方法 方法有三種：剪毛、拔毛和脫毛。 1剪毛 固定動(dòng)物后，用粗剪刀剪去所需部位的被毛。應(yīng)注意