1、第十章 模擬酶 核酶 極端酶,10.1 模擬酶,11.1.1 模擬酶的概念 模擬酶又稱人工酶或酶模型，是在分子水平上模擬酶活性部位的形狀、大小及其微環(huán)境等結(jié)構(gòu)特征，以及酶的作用機(jī)制和立體化學(xué)的一門學(xué)科，是從分子水平上模擬生物功能的一門邊緣學(xué)科。 模擬酶是20世紀(jì)60年代發(fā)展起來的一個(gè)新的研究領(lǐng)域，是仿生高分子的一個(gè)重要的內(nèi)容。,用合成高分子來模擬酶的結(jié)構(gòu)、特性、作用原理以及酶在生物體內(nèi)的化學(xué)反應(yīng)過程。 酶是一類有催化活性的蛋白質(zhì)，它具有催化效率高、專一性強(qiáng)、反應(yīng)條件溫和等特點(diǎn)。酶容易受到多種物理、化學(xué)因素的影響而失活，所以不能用酶廣泛取代工業(yè)催化劑。 研究模擬酶主要是為了解決酶的以上缺點(diǎn)。,模

2、擬酶的酶學(xué)基礎(chǔ) 酶的作用機(jī)制：過渡態(tài)理論 對簡化的人工體系中識(shí)別、結(jié)合和催化的研究,2.模擬酶理論基礎(chǔ),超分子化學(xué) 主-客體化學(xué)：主體和客體在結(jié)合部位的空間及電子排列的互補(bǔ) 超分子：該分子形成源于底物和受體的結(jié)合，這種結(jié)合基于非共價(jià)鍵相互作用，當(dāng)接受體與絡(luò)合離子或分子結(jié)合形成穩(wěn)定的，具有穩(wěn)定結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的實(shí)體，形成超分子 功能：分子識(shí)別、催化、選擇性輸出,3設(shè)計(jì)要點(diǎn),設(shè)計(jì)前： 酶活性中心-底物復(fù)合物的結(jié)構(gòu) 酶的專一性及其同底物結(jié)合方式的能力 反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)及各中間物的知識(shí),3設(shè)計(jì)要點(diǎn),設(shè)計(jì)中： 為底物提供良好的微環(huán)境 催化基團(tuán)必須相對于結(jié)合點(diǎn)盡可能同底物的功能團(tuán)相接近 應(yīng)具有足夠的水溶性，并在接近

3、生理?xiàng)l件下保持其催化活性,4.模擬酶的分類和制備,根據(jù)Kirby分類法 單純酶模型：化學(xué)方法通過天然酶活性的模擬來重建和改造酶活性 機(jī)理酶模型：通過對酶作用機(jī)制諸如識(shí)別、結(jié)合和過渡態(tài)穩(wěn)定化的認(rèn)識(shí)，來指導(dǎo)酶模型的設(shè)計(jì)和合成 單純合成的酶樣化合物：化學(xué)合成的具有酶樣催化活性的簡單分子,按照模擬酶的屬性,主-客體酶模型 膠束酶模型 肽酶 抗體酶 分子印跡酶模型 半合成酶,主-客體模型 1.環(huán)糊精模擬酶-水解酶的模擬,環(huán)糊精的分子結(jié)構(gòu),水解酶模型,研究熱點(diǎn),環(huán)糊精（CD）分子 原來：在CD的兩面引入催化基團(tuán)，通過柔性或剛性加冕引入疏水基團(tuán)，改善CD的疏水結(jié)合和催化功能 現(xiàn)在，橋聯(lián)環(huán)糊精和聚合環(huán)糊精，可

4、得到雙重或多重疏水結(jié)合作用和多重識(shí)別作用,2.冠醚化合物的模擬酶,冠醚水解酶模擬物,膠束模擬酶,單分子膠束酶模型,膠束酶模型,目前模擬酶的研究主要有以下幾方面：,1.模擬酶的金屬輔基: 有一類復(fù)合酶,除蛋白質(zhì)外,還有含金屬的有機(jī)小分子物質(zhì)或簡單的金屬，叫做輔酶或輔基。輔基在催化反應(yīng)中起著重要的作用。有一些研究工作就是模擬酶分子中的金屬輔基。 例如，模擬過氧化氫酶分子中的鐵卟啉輔基，合成了分解過氧化氫的酶模型三亞乙基四胺與三價(jià)鐵離子的絡(luò)合物。這個(gè)模型在pH9.5和25的條件下，其催化速率是血紅蛋白或正鐵血紅素在同樣條件下的一萬倍?；瘜W(xué)模擬生物固氮同樣是模擬固氮酶的金屬輔基。,2.模擬酶的活性功能

5、基酶分子中直接與酶催化反應(yīng)有關(guān)的活性中心，通常是由幾個(gè)活性功能基組成。 例如牛胰核糖核酸酶的催化中心是肽鏈序列中第12位和第119位的兩個(gè)組氨酸。 C.G.奧弗貝格等根據(jù)胰凝乳蛋白酶的催化中心與絲氨酸的羥基、組氨酸的咪唑基和天冬氨酸的羧基有關(guān)的事實(shí)，用乙烯基苯酚與乙烯基咪唑進(jìn)行共聚合，制得帶有羥基和咪唑基的-胰凝乳蛋白酶模型,用這個(gè)模型聚合物作為3-乙酰氧基N三甲基碘化苯胺,水解的催化劑，當(dāng)pH為9.1時(shí),其活性比單一的乙烯基咪唑高63倍。,3.模擬酶與底物的作用 酶分子具有一定的空間構(gòu)型，它與被催化的底物的作用在構(gòu)型上有較嚴(yán)格的匹配關(guān)系，體現(xiàn)了酶的專一性。為了模擬酶的結(jié)合功能，近年來人們合成

6、了許多冠醚化合物來模擬酶。隨著冠醚空穴尺寸的不同，其對底物的選擇性也不一樣。,4.模擬酶的性狀在水溶液中，酶形成巨大的分子締合體（膠束），構(gòu)成同一分子內(nèi)的疏水和親水微環(huán)境。模擬酶的這種微環(huán)境中的化學(xué)反應(yīng)的特殊性質(zhì)，也是模擬酶的一個(gè)重要方面。 有人利用組氨酸的衍生物十四酰組氨酸與十六酰烷基三甲基溴化銨組成兩種分子的混合微膠束，來催化乙酸對硝基苯酯的水解，其速率比組氨酸增加了100倍。,5.模擬酶的高分子作用方式 酶是一類由氨基酸組成，以多肽鏈為骨架的生物大分子。人們利用高分子化合物作為模型化合物的骨架，引入活性功能基來模擬酶的高分子作用方式。 例如，用分子量為4000060000的聚亞乙基亞胺作

7、為模型化合物的骨架，引入10摩爾的十二烷基和15摩爾的咪唑基，合成一個(gè)硫酸酯酶模型.用這個(gè)模型聚合物催化苯酚硫酸酯類化合物的水解，其活性比天然的型芳基硫酸酯酶高100倍。,10.1.2 抗體酶（Abzyme),內(nèi)容,抗體酶概念 抗體酶產(chǎn)生的理論基礎(chǔ) 抗體酶的制備方法 抗體酶的應(yīng)用,抗體,由抗原誘導(dǎo)產(chǎn)生的，在結(jié)構(gòu)上與抗原高度互補(bǔ)并與抗原具有特異結(jié)合功能的免疫球蛋白。 抗體的最顯著的特征是多樣性和專一性,抗體中的每條鏈中有恒定區(qū)和可變區(qū)。,相同點(diǎn)：都是蛋白質(zhì)，都有特異性。 不同點(diǎn)： 1）酶與抗體的差別：酶是能與反應(yīng)過渡態(tài)選擇結(jié)合的催化性物質(zhì)，抗體是和基態(tài)分子結(jié)合的催化性物質(zhì)。 2）酶的活性和合成受

8、到代謝調(diào)節(jié)，種類有限。 抗體只有在抗原存在時(shí)才產(chǎn)生，種類無限。,抗體與酶的異同：,酶是生物催化劑,酶是一類具有催化功能的生物分子 酶反應(yīng)有兩個(gè)主要的特征： 高催化效率、高選擇性 1946年，Pauling用過渡態(tài)理論闡明酶催化的實(shí)質(zhì) 酶之所以具有催化活力是因?yàn)樗芴禺愋越Y(jié)合并穩(wěn)定化學(xué)反應(yīng)的過渡態(tài)(底物激態(tài))，從而降低反應(yīng)能級。,對任何化學(xué)反應(yīng)，反應(yīng)物在變?yōu)楫a(chǎn)物之前，必須獲得一定的能量，成為活化態(tài)或稱過渡態(tài)。過渡態(tài)處于最高能階上。 過渡態(tài)與反應(yīng)物的能階之差稱為活化能。 獲得活化能的多少與反應(yīng)的速度成正比。,過渡態(tài)理論是解釋酶催化原理的經(jīng)典理論。,過渡態(tài)理論,過渡態(tài)理論認(rèn)為，酶與底物的結(jié)合經(jīng)歷了一

9、個(gè)易于形成產(chǎn)物的過渡態(tài)，實(shí)際上是降低了反應(yīng)所需的活化能。,過渡態(tài)理論,與反應(yīng)過渡狀態(tài)結(jié)合作用,在酶催化的反應(yīng)中，與酶的活性中心形成復(fù)合物的實(shí)際上是底物形成的過渡狀態(tài)， 酶與過渡狀態(tài)的親和力要大于酶與底物或產(chǎn)物的親和力。,1969年Jencks根據(jù)抗體結(jié)合抗原的高度特異性，與天然酶結(jié)合底物的高度專一性相類似的特性，在過渡態(tài)理論的基礎(chǔ)上首先提出設(shè)想： 能與化學(xué)反應(yīng)中過渡態(tài)結(jié)合的抗體，可能具有酶的活性，催化反應(yīng)的進(jìn)行。 1986年Lerner和Schultz證實(shí)了這一設(shè)想。,抗體酶設(shè)想,抗體酶的發(fā)現(xiàn),Lerner和Schultz分別領(lǐng)導(dǎo)各自的研究小組首次觀察到了抗體具有選擇性的催化活性。 1986年

10、美國Lerner和Schultz兩個(gè)實(shí)驗(yàn)室同時(shí)在Science上發(fā)表論文，報(bào)道他們成功地得到了具有催化活性的抗體。 并將這類具催化能力的免疫球蛋白稱為催化抗體，即抗體酶。,1986年Schultz以對硝基苯酚磷酸膽堿酯（PNPPC）作為相應(yīng)的羧酸二酯的過渡態(tài)類似物。 誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體酶使水解反應(yīng)速度加快12000倍。,抗體酶,抗體酶（Abzyme）或催化抗體（Catalytic antibody)是抗體的高度選擇性和酶的高效催化能力巧妙結(jié)合的產(chǎn)物。 本質(zhì)上是一類具有催化活力的免疫球蛋 白，在其可變區(qū)賦予了酶的屬性。 它是利用現(xiàn)代生物學(xué)與化學(xué)的理論與技術(shù)交叉研究的成果，是抗體的高度選擇性和酶的高效

11、催化能力巧妙結(jié)合的產(chǎn)物。,抗體酶具有典型的酶反應(yīng)特性,與配體(底物)結(jié)合的專一性，包括立體專一性，抗體酶催化反應(yīng)的專一性可以達(dá)到甚至超過天然酶的專一性； 具有高效催化性，一般抗體酶催化反應(yīng)速度比非催化反應(yīng)快102106倍，有的反應(yīng)速度已接近于天然酶促反應(yīng)速度； 抗體酶還具有與天然酶相近的米氏方程動(dòng)力學(xué)及pH依賴性等。,過渡態(tài)理論與抗體酶,如果使抗原最大限度地接近某一特定反應(yīng)的過渡態(tài)，就可能使誘導(dǎo)的抗體在與之結(jié)合時(shí)發(fā)揮催化作用。 實(shí)際所采用的過渡態(tài)抗原知識(shí)推測而設(shè)計(jì)的過渡態(tài)類似物。 用過渡態(tài)類似物誘導(dǎo)的抗體所催化的反應(yīng)并非該類似物本身，而是與其相似的另一種反應(yīng)。,抗體酶的特性,1、能催化一些天然

12、酶不能催化的反應(yīng) 有許多化學(xué)反應(yīng)還沒有已知酶催化進(jìn)行 抗體的多樣性決定了抗體酶催化反應(yīng)類型多樣性 抗體酶可以根據(jù)需要人工裁制,一種對酶促反應(yīng)過渡態(tài)特異的抗體 結(jié)合了酶與抗體的優(yōu)點(diǎn)，既可以起酶促催化作用，又可以起抗體的選擇性和專一性結(jié)合抗原的作用。,抗體酶的催化反應(yīng)類型,1、轉(zhuǎn)酰基反應(yīng) 2、水解反應(yīng) 3、Claisen重排反應(yīng) 4、酰胺合成反應(yīng) 5 Diels-Alder反應(yīng) 6、轉(zhuǎn)酯反應(yīng) 7、光誘導(dǎo)反應(yīng) 8、氧化還原反應(yīng) 9、脫羧反應(yīng) 10、順反異構(gòu)化反應(yīng),抗體酶的特性,2、有更強(qiáng)的專一性和穩(wěn)定性 抗體的精細(xì)識(shí)別使其能結(jié)合幾乎任何天然的或合成的分子 抗體酶催化反應(yīng)的介質(zhì)效應(yīng) 酯解反應(yīng)中介質(zhì)效應(yīng)

13、 ： 抗體酶在有機(jī)溶劑中具穩(wěn)定性。 脫羧反應(yīng)中介質(zhì)效應(yīng)：有機(jī)溶劑引起脫羧反應(yīng)速率增加。 ?；D(zhuǎn)移反應(yīng)中介質(zhì)效應(yīng) ：在疏水溶劑中，活性較高。,抗體酶的制備,將抗體轉(zhuǎn)變?yōu)槊缚赏ㄟ^誘導(dǎo)法、拷貝法、引入法、化學(xué)修飾法等途徑。 誘導(dǎo)法是利用反應(yīng)過渡態(tài)類似物為半抗原制作單克隆抗體，篩選出具高催化活性的單抗即抗體酶。 拷貝法主要根據(jù)抗體生成過程中抗原-抗體互補(bǔ)性來設(shè)計(jì)的。 引入法則借助基因工程和蛋白質(zhì)工程將催化基因引入到特異抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)上，使其獲得催化功能。 化學(xué)修飾法對抗體進(jìn)行化學(xué)修飾，使抗體與催化基團(tuán)相連。,1. 誘導(dǎo)法 用設(shè)計(jì)好的半抗原，通過與載體蛋白（如牛血清白蛋白）偶聯(lián)制成抗原。然后對動(dòng)物進(jìn)

14、行免疫，取免疫動(dòng)物的脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞雜交，雜交細(xì)胞則分泌單克隆抗體，經(jīng)篩選和純化，得抗體酶。,用酶作為抗原免疫動(dòng)物得到抗酶的抗體，再將此抗體免疫動(dòng)物并進(jìn)行單克隆化，獲得單克隆的抗抗體。對抗抗體進(jìn)行篩選，獲得具有原來酶活性的抗體酶。,2. 拷貝法,3. 引入法,將催化基團(tuán)或輔助因子引入到抗體的抗原結(jié)合部位，可采用選擇性化學(xué)修飾方法，亦可利用蛋白質(zhì)工程和基因工程技術(shù),四、抗體酶的應(yīng)用 1.戒毒: 用可卡因水解的過渡態(tài)類似物-磷酸單酯為半抗原，產(chǎn)生的單克隆抗體能催化可卡因的分解，水解后的可卡因片斷失去可卡因刺激功能。,2. 腫瘤治療 抗體介導(dǎo)前藥治療技術(shù):將能水解前藥釋放出腫瘤細(xì)胞毒劑的酶和腫瘤專

15、一性抗體相偶聯(lián)，則酶通過和腫瘤結(jié)合的抗體存在于細(xì)胞的表面。靜脈給藥后，當(dāng)藥物擴(kuò)散至腫瘤細(xì)胞的表面或附近，抗體酶將前藥迅速水解釋放出抗腫瘤藥物。,第二節(jié) 核 酶（Ribozyme),一、核酶的概念 二、核酶的種類 三、核酶的應(yīng)用 四、核酶面臨的問題 五、影響核酶活性的因素,具有生物催化功能的RNA。,一、核酶的概念,克隆酶 遺傳修飾酶 蛋白質(zhì)工程新酶 、,Ribozyme,Deoxyribozyme,I型內(nèi)含子 剪接型核酶 II型內(nèi)含子 錘頭核酶 剪切型核酶 發(fā)夾核酶 自體催化 丁型肝炎病毒（HDV)核酶 RNaseP 異體催化,二、核酶的分類,1.剪接型核酶,剪接型核酶的作用機(jī)制是通過既剪又接

16、的方式除去內(nèi)含子（Intron)。,1）I類內(nèi)含子的自我剪接(Self-splicing),I型IVS(intervening squense,間隔序列）是與四膜蟲26srRNA前體的IVS結(jié)構(gòu)相似的間隔序列，具有環(huán)狀結(jié)構(gòu)。通過轉(zhuǎn)磷酸酯反應(yīng)，生成成熟的26srRNA及G-IVS，G-IVS經(jīng)兩次環(huán)化生成L-19IVS。催化過程需要鳥苷酸或鳥苷以及鎂離子參與。 剪接機(jī)制 L-19IVS在體外的多種酶活性,p,3 HO-G,p,3,p,P-G,OH,p,P-G,3 HO,類內(nèi)含子的剪接機(jī)制,Mg 2+或Mn 2+,GMP,GDP,GTP,外顯子,內(nèi)含子或居間序列（Intervening seque

17、nce,IVS),5,UCUAAA,IVS,GUAA,Pre-rRNA,UCU,A A A,GUAA,UCUoH3,5GAAA,GUAA,UCUUAA,5GAAA,GOH 3 G-IVS,L-19IVS,19nt,5,3,rRNA,5,3,5,pGOH,3,5,3,四膜蟲rRNA前體自我剪接反應(yīng),1、轉(zhuǎn)核苷酸作用 2CpCpCpCpC CpCpCpCpCpC +CpCpCpC 2、水解作用 CpCpCpCpC CpCpCpC + pC 3、轉(zhuǎn)磷酸作用 CpCpCpCpCpCp+UpCpU CpCpCpCpCpC + UpCpUp 4、去磷酸作用 CpCpCpCpCp CpCpCpCpC +Pi

18、 5、限制性內(nèi)切酶作用 CpUpCpUpN +G CpUpCpU +GpN,2）類內(nèi)含子的自我剪接,型IVS是與細(xì)胞核mRNA前體的IVS結(jié)構(gòu)相似的間隔序列。通過轉(zhuǎn)磷酸酯反應(yīng)，生成成熟的RNA及套環(huán)狀的IVS。催化的剪接反應(yīng)不需要鳥苷或鳥苷酸參加，但仍需要鎂離子(Mg2+)。 剪接機(jī)制,p,2 HO-A,p,p-A,p,3 OH,p,P-A,HO 3,類內(nèi)含子的剪接機(jī)制,Mg 2+,套環(huán)的形成,5,3,外顯子連接,2.剪切型核酶 這類RNA進(jìn)行自身催化的反應(yīng)是只切不接。1）自體催化剪切型 剪切機(jī)制,轉(zhuǎn)酯化過程： 由靠近切割位點(diǎn)3端的2OH或氧原子對切割位點(diǎn)的磷原子實(shí)施親核攻擊，產(chǎn)生5-OH 和

19、2，3-環(huán)磷酸二酯。,剪 切 機(jī) 制,核酶自身剪切反應(yīng),錘頭型核酶的二級結(jié)構(gòu) 和空間立體結(jié)構(gòu)示意圖,三個(gè)雙螺旋區(qū)。 13個(gè)核苷酸殘基保守序列。 剪切反應(yīng)在右上方GUX序列的3端自動(dòng)發(fā)生。,發(fā)夾（hairpin ）結(jié)構(gòu),1989年漢普（Hample）研究煙草環(huán)斑病毒（sTRSV）的負(fù)鏈RNA的自我剪切反應(yīng)，提出發(fā)夾結(jié)構(gòu)（hairpin structure）模型。 發(fā)夾核酶結(jié)構(gòu)模型,四個(gè)螺旋區(qū)、三個(gè)連接區(qū)和兩個(gè)環(huán)。 剪切反應(yīng)發(fā)生在底物識(shí)別序列GUC的5端。,5,3,發(fā)夾二級結(jié)構(gòu)模型,剪切位點(diǎn),2) 異體催化剪切型 核糖核酸酶P(RNaseP)是內(nèi)切核酸酶，是核糖核蛋白體復(fù)合物，能剪切所有tRNA前體的5端，除去多余的序列，形成3-OH 和 5-磷酸末端。 RNaseP由M1RN