1、第十三章 程序性細(xì)胞死亡與細(xì)胞衰老,第十三章 程序性細(xì)胞死亡與細(xì)胞衰老,程序性細(xì)胞死亡 細(xì)胞衰老,細(xì)胞的死亡是個體的死亡，對于多細(xì)胞生物而言，細(xì)胞的死亡并不意味著個體生命的終結(jié)；相反，細(xì)胞死亡是維持個體的正常生長發(fā)育及其生命活動所必需的，其重要性不亞于細(xì)胞的增殖。 細(xì)胞的衰老，即復(fù)制衰老，指體外培養(yǎng)的正常細(xì)胞經(jīng)過有限次數(shù)的分裂后，停止分裂，細(xì)胞形態(tài)和生理代謝活動發(fā)生顯著改變的現(xiàn)象。 個體的衰老（aging）是指隨著年齡的增加，機(jī)體功能呈現(xiàn)退行性變化，并但隨著生殖能力的下降和死亡率上升的現(xiàn)象。,第一節(jié) 程序性細(xì)胞死亡,動物細(xì)胞的程序性死亡 死亡方式： 凋亡（apoptosis） 壞死（necro

2、sis） 自噬（autophagy） 植物細(xì)胞的程序性死亡 酵母細(xì)胞的程序性死亡,蝌蚪尾的消失,脊椎動物的神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育,發(fā)育過程中手和足的成形過程,概念：細(xì)胞凋亡是一個主動的由基因決定的自動結(jié)束生命的過程，所以也常常被稱為細(xì)胞編程死亡（programmed cell death, PCD）。凋亡細(xì)胞將被吞噬細(xì)胞吞噬。 生物學(xué)意義：細(xì)胞凋亡對于多細(xì)胞生物個體發(fā)育的正常進(jìn)行，自穩(wěn)平衡的保持以及抵御外界各種因素的干擾方面都起著非常關(guān)鍵的作用 細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)、生化特征 細(xì)胞凋亡的檢測 細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制,動物細(xì)胞的程序性死亡,細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)特征： 凋亡的起始：細(xì)胞表面的特化結(jié)構(gòu)如微絨毛消失，細(xì)胞

3、間接觸的消失，但細(xì)胞膜依然完整；線粒體大體完整，但核糖體逐漸從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上脫離，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)囊腔膨脹，并逐漸與質(zhì)膜融合；染色質(zhì)固縮，形成新月形帽狀結(jié)構(gòu)等形態(tài)，沿著核膜分布 凋亡小體的形成：核染色質(zhì)斷裂為大小不等的片段，與某些細(xì)胞器如線粒體一起聚集，為反折的細(xì)胞質(zhì)膜所包圍。細(xì)胞表面產(chǎn)生了許多泡狀或芽狀突起，逐漸形成單個的凋亡小體。 凋亡小體逐漸為鄰近的細(xì)胞吞噬并消化 胞凋亡的生化特征 細(xì)胞凋亡的主要特征是形成大小為180200bp特征性的DNA ladders 組織轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶tTG（tissue Transglutaminase）積累并達(dá)到較高水平,細(xì)胞凋亡的檢測,形態(tài)學(xué)觀測：染色法、透射和掃描電鏡觀察

4、 DNA電泳：DNA片段就呈現(xiàn)出梯狀條帶 TUNEL測定法，即末端脫氧核苷酸酶移換酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記測定法。 彗星電泳法（comet assay） 流式細(xì)胞分析,細(xì)胞凋亡的檢測,形態(tài)學(xué)觀測：染色法、透射和掃描電鏡觀察 臺盼蘭：活細(xì)胞 DAPI，Giemsa：結(jié)合DNA 染色質(zhì)異固縮、凋亡小體的形成、細(xì)胞發(fā)泡,細(xì)胞凋亡的檢測,DNA電泳：DNA片段就呈現(xiàn)出梯狀條帶,細(xì)胞凋亡的主要特征是形成大小為180200bp特征性的DNA ladders,細(xì)胞色素c誘導(dǎo)的凋亡細(xì)胞DNA電泳圖 1細(xì)胞色素c誘導(dǎo)0 h 2細(xì)胞色素c誘導(dǎo)1 h 3細(xì)胞色素c誘導(dǎo)2 h 4細(xì)胞色素c誘導(dǎo)3 h 5細(xì)胞色素c

5、誘導(dǎo)4 h 6陰性對照 7Marker （ 自趙允、翟中和）,細(xì)胞凋亡的檢測,TUNEL測定法（DNA斷裂的原位末端標(biāo)記法，末端脫氧核苷酸酶移換酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記測定法） 彗星電泳法（comet assay）：將單個細(xì)胞懸浮于瓊脂糖凝膠中，經(jīng)裂解處理后，再在電場中進(jìn)行短時間的電泳，并用熒光染料染色。 流式細(xì)胞分析:凋亡細(xì)胞DNA發(fā)生斷裂和丟失，呈亞二倍體狀態(tài)。,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的因子 Caspase家族與凋亡： Caspase依賴性的細(xì)胞凋亡 由死亡受體起始的外源途徑：配體是腫瘤壞死因子（TNF）家族成員 由線粒體起始的內(nèi)源途徑：細(xì)胞色素c的釋放，線粒體外膜通透性的改變受BCL-2 家族

6、的調(diào)控 Caspase非依賴性的細(xì)胞凋亡 凋亡誘導(dǎo)因子（AIF） 限制性內(nèi)切核酸酶G p53與細(xì)胞凋亡,三、細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制,細(xì)胞凋亡與壞死,二者的主要區(qū)別： 細(xì)胞凋亡過程中，細(xì)胞質(zhì)膜反折，包裹斷裂的染色質(zhì)片段或細(xì)胞器，然后逐漸分離，形成眾多的凋亡小體（apoptotic bodies），凋亡小體則為鄰近的細(xì)胞所吞噬。整個過程中，細(xì)胞質(zhì)膜的整合性保持良好，死亡細(xì)胞的內(nèi)容物不會逸散到胞外環(huán)境中去，因而不引發(fā)炎癥反應(yīng)。 在細(xì)胞壞死時，細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)空泡，細(xì)胞質(zhì)膜破損，細(xì)胞內(nèi)容物，包括膨大和破碎的細(xì)胞器以及染色質(zhì)片段釋放到胞外，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)。在細(xì)胞壞死過程中染色質(zhì)不發(fā)生凝集，也不產(chǎn)生有規(guī)律的200bp

7、的DNA降解片段，而是被隨即降解，瓊脂糖凝膠電泳是呈現(xiàn)彌散性分布，俗稱“拖尾”現(xiàn)象。細(xì)胞壞死可能是“程序性死亡的”的另一種形式，具有包括引發(fā)炎癥反應(yīng)在內(nèi)的重要生理功能。當(dāng)細(xì)胞凋亡不能正常發(fā)生而細(xì)胞必須死亡時，壞死作為凋亡的“替補(bǔ)”方式被細(xì)胞采用.,分裂旺盛的細(xì)胞由DNA損傷引發(fā)的ATP水平急降會導(dǎo)致細(xì)胞壞死，二分裂遲滯的細(xì)胞抵抗DNA損傷的能力較強(qiáng)。,細(xì)胞自噬,細(xì)胞自噬主要發(fā)生在個體遭遇營養(yǎng)危機(jī)的時候和胚胎發(fā)育期間 單細(xì)胞和單細(xì)胞生物均可發(fā)生自噬 酵母磷脂?；技っ福≒I3K）信號途徑,酵母細(xì)胞的自噬信號途徑,植物細(xì)胞的程序性死亡,植物細(xì)胞的過敏（HR）反應(yīng),木質(zhì)部管狀細(xì)胞的成熟過程,酵母細(xì)胞

8、的程序性死亡,1997，發(fā)現(xiàn)酵母突變株cdc48具有程序性死亡現(xiàn)象 低濃度的雙氧水或醋酸、較高濃度的鹽或糖、植物抗真菌多肽等能誘導(dǎo)酵母發(fā)生細(xì)胞程序性死亡,第二節(jié) 細(xì)胞衰老(cellular aging或cell senescence),Hayflick界限(Hayflick Limitation） 細(xì)胞在體內(nèi)條件下的衰老 衰老細(xì)胞結(jié)構(gòu)的變化 細(xì)胞衰老的分子機(jī)理,一、Hayflick界限(Hayflick Limitation),概念：關(guān)于細(xì)胞增殖能力和壽命是有限的觀點(diǎn)。 細(xì)胞，至少是培養(yǎng)的二倍體細(xì)胞，不是不死的，而是有一定的壽命；它們的增殖能力不是無限的，而是有一定的界限，這就 是 Hayfl

9、ick界限 癌細(xì)胞或培養(yǎng)的細(xì)胞系是不正常細(xì)胞，其染色體數(shù)目或形態(tài)已經(jīng)不同于原先的細(xì)胞 細(xì)胞的增殖能力與供體年齡有關(guān) 物種壽命與培養(yǎng)細(xì)胞壽命之間存在著一定的關(guān)系 (龜175歲/90125次, 小鼠3.5年/1428次) 二倍體細(xì)胞的衰老是由細(xì)胞本身決定的 決定細(xì)胞衰老的因素在細(xì)胞內(nèi)部，而不是外部的環(huán)境 是細(xì)胞核而不是細(xì)胞質(zhì)決定了細(xì)胞衰老,三、衰老細(xì)胞結(jié)構(gòu)的變化,細(xì)胞核的變化:體外培養(yǎng)的二倍體細(xì)胞，細(xì)胞核隨著細(xì)胞分裂次數(shù)的增加不斷增大;核膜內(nèi)折、染色質(zhì)固縮化 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的變化: 衰老動物內(nèi)質(zhì)網(wǎng)成分彌散性地分散于核周胞質(zhì)中，糙面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的總量似乎是減少了 線粒體的變化: 通常細(xì)胞中線粒體的數(shù)量隨齡減少，而

10、其體積則隨齡增大. 致密體的生成:褐脂質(zhì)、老年色素、血褐質(zhì)、脂色素、殘體。 膜系統(tǒng)的變化:膜流動性降低、韌性減小；衰老細(xì)胞間間隙連接;細(xì)胞膜內(nèi)（P面）顆粒的分布也發(fā)生變化.,細(xì)胞衰老的生物學(xué)特征： 1.細(xì)胞生長停滯，分裂停止 2.衰老相關(guān)的-半乳糖苷酶（溶酶體內(nèi)的水解酶）活化,四、細(xì)胞衰老的分子機(jī)理,端粒與衰老：發(fā)現(xiàn)端粒長度確實(shí)與衰老有著密切的關(guān)系，提出細(xì)胞衰老的“有絲分裂鐘”學(xué)說（Harley,1990） 氧化性損傷學(xué)說：代謝過程中產(chǎn)生的活性氧基團(tuán)或分子（ROS-O2-，OH-，H2O2），引發(fā)的氧化性損傷的積累，最終導(dǎo)致衰老。 rDNA與衰老: 酵母染色體外rDNA 環(huán)（ERC）的積累，導(dǎo)

11、致細(xì)胞衰老。 沉默信息調(diào)節(jié)蛋白復(fù)合物（Sir complex）與衰老：Sir complex 存在于異染色質(zhì)區(qū)，其作用在于阻斷所在位點(diǎn)DNA轉(zhuǎn)錄。 SGS1基因和WRN基因與衰老： SGS1基因和WRN基因同源,編碼解旋酶; 酵母sgs1突變體壽命明顯短于野生型（平均9.5代:24.5代）; wrn突變 引發(fā)早老癥. 發(fā)育程序與衰老: 線粒體DNA與衰老: Sen-DNA(80年代);mtDNA突變積累與細(xì)胞衰老有關(guān).,不同年齡來源的人成纖維細(xì)胞的增殖代數(shù),二、細(xì)胞在體內(nèi)條件下的衰老,在機(jī)體內(nèi)，細(xì)胞的衰老和死亡是常見的現(xiàn)象，甚至在個體發(fā)育的早期也會發(fā)生; 衰老動物體內(nèi)，細(xì)胞分裂速度顯著減慢，其

12、原因主要是G1期明顯延長; 衰老個體內(nèi)的環(huán)境因素影響了細(xì)胞的增殖和衰老; 骨髓干細(xì)胞移植實(shí)驗(yàn)說明隨著年齡的增加，干細(xì)胞增殖速度也趨緩慢.,Caspase家族,線蟲(C.elegans)凋亡研究發(fā)現(xiàn)ced3,ced4基因促進(jìn)細(xì)胞凋亡，ced9基因阻止ced3/ced4的激活，抑制細(xì)胞凋亡。Ced3哺乳類同源物是白介素-1轉(zhuǎn)換酶ICE(Interleukin-1-converting enzyme)，即Caspase1。 Caspase活性位點(diǎn)是半胱氨酸(Cysteine)，裂解靶蛋白位點(diǎn)是天冬氨酸殘基后的肽鍵，因此稱為Cysteine aspartic acic specific proteas

13、e，即Caspase。現(xiàn)發(fā)現(xiàn)的哺乳類動物細(xì)胞Caspase家族成員共有15種： 白介素前體的活化：Caspase1，4 凋亡起始者：Caspase2，8，9，10 凋亡執(zhí)行者：Caspase3，6，7,Caspase自身以非活化的Procaspase存在。一般的蛋白酶活化時，只是將N端的肽段切除，而caspase的活化則需要在兩個亞基的連接區(qū)的天冬氨酸位點(diǎn)進(jìn)行切割，結(jié)果產(chǎn)生了由兩個亞基組成的異二聚體而活化。 凋亡過程：激活期和執(zhí)行期 激活期 (起始Caspase活化) :同性活化,酶元分子聚集成復(fù)合物達(dá)到一定濃度時，彼此切割或者構(gòu)象改變產(chǎn)生有活性的二聚體形式。 執(zhí)行期(執(zhí)行Caspase活化)

14、： 屬異性活化，起始Caspase招募執(zhí)行Caspase酶原分子后，對其進(jìn)行切割，產(chǎn)生具有活性的執(zhí)行Caspase切割細(xì)胞內(nèi)重要的結(jié)構(gòu)和功能蛋白，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。,Caspase家族,BCL-2家族, BCL-2是一種原癌基因，是ced-9在哺乳類中的同源物，能抑制細(xì)胞凋亡；與線粒體及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜相結(jié)合BCL-2家族成員的基因中，常常含有三個保守的BCL-2同源區(qū)，即BH1，BH2和BH3。這三個區(qū)域是調(diào)節(jié)凋亡以及蛋白質(zhì)相互作用所必需的結(jié)構(gòu)。 哺乳動物細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)三種凋亡蛋白酶活化因子：Apaf1，Apaf2（ CytC ），Apaf3。,BCL-2家族成員,a 正常T細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞 b 凋亡細(xì)胞(掃描電鏡) c 凋亡細(xì)胞(透射電鏡),誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的因子：,物理性因子，包括射線（紫外線， 射線等）， 較溫和的溫度刺激（如熱激，冷激）等 化學(xué)及生物因子：包括活性氧基團(tuán)和分子，DNA 和蛋白質(zhì)合成的抑制劑，激素，細(xì)胞生長因子，腫 瘤壞死因子（TNF），抗Fas/Apo-1/CD95抗體等,三、細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制,由死亡受體起始的外源途徑,細(xì)胞色素c誘導(dǎo)的凋亡細(xì)胞DNA電泳圖 1細(xì)胞色素c誘導(dǎo)0 h 2細(xì)胞色素c誘導(dǎo)1 h 3細(xì)胞色素c誘導(dǎo)2 h 4細(xì)胞色素c誘