1、,沉淀分離法,回顧,鹽析沉淀法 有機溶劑沉淀 等電點沉淀法 成鹽沉淀法 高分子聚合物沉淀 選擇性變性沉淀法,原理、無機鹽的選擇（(NH4)2SO4）、影響因素（5個）、優(yōu)缺點,原理、常用（甲醇、乙醇、異丙醇、丙酮）、影響因素（4個）、優(yōu)缺點,原理、使用時注意事項,金屬離子沉淀法：3類 有機酸沉淀法：常用有機酸 無機酸沉淀法：常用無機酸,常用沉淀劑、影響PEG沉淀效果的因素、如何去除沉淀中的PEG,3種方法,沉淀和結(jié)晶（晶體）的異同點,相同：在本質(zhì)上同屬一種過程（固相析出）,條件緩慢變化時，溶質(zhì)分子有足夠時間排列，有利于結(jié)晶形成； 條件變化劇烈，強迫快速析出，溶質(zhì)分子來不及排列就析出，形成無定形

2、沉淀。,區(qū)別：,結(jié)晶法：高度的選擇性（原因：只有同類分子 或離子才能排列成晶體）。 沉淀法：濃縮與分離，但所得的沉淀物聚集多 種物質(zhì)，或含有鹽類，或包裹著溶劑。,分離效果,第五章結(jié) 晶,結(jié)晶：液體呈晶態(tài)從溶液中析出的過程（有時把析出的晶體也稱為結(jié)晶） 晶態(tài)：外觀形狀一定、內(nèi)部的分子（或原子、離子）在三維空間進行有規(guī)則的排列而產(chǎn)生的物質(zhì)存在形態(tài)。 結(jié)晶有很好的選擇性，原因：只有同類分子或離子才能排列成晶體。,結(jié)晶的過程 影響結(jié)晶析出的條件 結(jié)晶的一般方法 提高晶體質(zhì)量的方法,一、結(jié)晶的過程,將溶質(zhì)放入溶劑中,固體的溶解：溶質(zhì)分子擴散進入液體內(nèi)部 溶質(zhì)的沉積：溶質(zhì)分子從液體中擴散到固 體表面進行沉

3、積,最先析出的微小顆粒是以后結(jié)晶的中心，稱為晶核。 只有達到一定的過飽和度時晶核才存在。 晶核形成并不是結(jié)晶的完成，還需要繼續(xù)擴散成長為晶體。,（一）過飽和溶液的形成,蒸發(fā)法 冷卻法 化學(xué)反應(yīng)結(jié)晶法 鹽析結(jié)晶法 等電點法 復(fù)合法,制備,結(jié)晶的首要條件是溶液的過飽和。,1.蒸發(fā)法 借蒸發(fā)出去部分溶劑的結(jié)晶方法。使溶液在加壓、常壓或減壓下加熱，蒸發(fā)除去一部分溶劑，以達到或維持溶液過飽和度。 適于溶解度隨溫度變化不顯著的物質(zhì)或隨溫度升高溶解度降低的物質(zhì)（例子）。,2.冷卻法 基本上不除去溶劑，而是使溶液冷卻降溫成為過飽和溶液。 此法適于溶解度隨溫度降低而顯著減小的物質(zhì),3.化學(xué)反應(yīng)結(jié)晶法 向溶液中加

4、入反應(yīng)劑，生成一個新的溶解度更低的物質(zhì)，當(dāng)濃度超過它的溶解度時就有結(jié)晶析出。 如：在抗生素的溶液中加入成鹽劑（酸、堿或鹽類），使抗生素以鹽的形式結(jié)晶析出。 NaOH, CH3COOK,4.解析法 向溶液中加入某些物質(zhì)，使溶質(zhì)的溶解度降低，形成過飽和溶液而結(jié)晶析出。 抗溶劑或沉淀劑：固體、液體、氣體 抗溶劑的特點：極易溶解在原溶液的溶劑中,鹽析結(jié)晶法：用固體氯化鈉作為抗溶劑使溶液 中的溶質(zhì)盡可能的結(jié)晶出來 有機溶劑結(jié)晶法：向水溶液中加入一定量的親水 性的有機溶劑，降低溶質(zhì)的溶解 度，使其結(jié)晶析出 水析結(jié)晶法：易溶于有機溶劑的物質(zhì)，向其溶液 中加入適量水即可析出晶體,5.等電點法 利用某些生物物質(zhì)

5、具有兩性化合物性質(zhì)當(dāng)溶液pH值調(diào)至等電點時溶解度最小，使生物物質(zhì)從水溶液中沉淀析出。,6.復(fù)合法 幾種方法合并使用。 鹽析和冷卻并用；冷卻和化學(xué)反應(yīng)并用；結(jié)合等電點,（二）晶核的形成 晶核：過飽和溶液中最先析出的微小顆粒，是以后結(jié)晶的中心。 成核速度：單位時間內(nèi)在單位體積溶液中生成的新晶核數(shù)目。是決定晶體產(chǎn)品粒度分布的首要因素。 1.成核速度的影響因素： 溶液的過飽和度、溫度、溶質(zhì)種類,（1）過飽和度,理論曲線,實際曲線,過飽和度,成 核 速 度,晶體生長速度和所需晶體大小,（2）溫度,溫度,成核速度,過飽和度,溫度與過飽和度 相互消長速度,（3）溶質(zhì)種類 無機鹽類： 陽離子或陰離子的化合價越

6、低，越不容易成核 相同化合價下，含結(jié)晶水越多，越不容易成核 有機物質(zhì)： 結(jié)構(gòu)越復(fù)雜，相對分子質(zhì)量越大，成核速度越慢,2. 晶核的誘導(dǎo) 加晶種能誘導(dǎo)結(jié)晶 晶種可以是同種物質(zhì)或相同晶形的物質(zhì)，有時惰性的無定形物質(zhì)也可作為結(jié)晶的中心，如塵埃。 添加晶種誘導(dǎo)晶核形成的方法： （1）有現(xiàn)成晶體：取少量研碎，加溶劑，離心去除大顆粒，稀釋，懸浮液中有小晶核，倒入待結(jié)晶溶液，攪拌，放置一段時間,（2）無現(xiàn)成晶體： 取1-2滴待結(jié)晶溶液置于表面玻璃皿上，緩慢蒸發(fā)除去溶液，可得少量晶體 取少量溶液置于試管中，旋轉(zhuǎn)試管，使溶液在管壁上形成薄膜，溶劑蒸發(fā)，冷卻試管，管壁上可形成一層結(jié)晶。 刮下結(jié)晶，蘸取少量接種到待結(jié)

7、晶溶液，攪拌,（三）晶體的生長 晶體生長：在過飽和溶液中已有晶核形成或加入晶種后，以過飽和度為推動力，晶核或晶種將長大，這種現(xiàn)象稱為-。 晶體生長速度也會影響晶體產(chǎn)品粒度大小。 晶核形成后立即開始生長成晶體，同時新的晶核還在繼續(xù)形成,晶核形成速度 晶體生長速度：細小晶體，甚至無定形 晶核形成速度 晶體生長速度：粗大而均勻晶體,影響晶體生長的因素： 雜質(zhì)、攪拌、溫度和過飽和度 雜質(zhì)：制止、促進、改變外形 攪拌：促進擴散，加速晶體生長、晶核形成。以試驗為基礎(chǔ)，確定適宜的攪拌速度 溫度：升高有利于擴散，使結(jié)晶速度增快 過飽和度： 增高使結(jié)晶速度增大 增高引起黏度增加，結(jié)晶速度受阻,二、影響結(jié)晶析出的

8、主要條件,溶液濃度 樣品純度 溶劑 pH 溫度 時間,晶體形成,1.溶液濃度 超過飽和濃度 目的物的濃度是結(jié)晶的首要條件 濃度高：結(jié)晶收率高 濃度過高：分子在溶液中析出的速度太快，超過形成晶核的速率，得不到晶體，只獲得無定形固體顆粒；雜質(zhì)濃度增大，易生成純度差的粉末結(jié)晶。 濃度應(yīng)根據(jù)工藝和具體情況確定,2.樣品純度 結(jié)晶是同種物質(zhì)分子的有序排列，所以雜質(zhì)是障礙。 多數(shù)生物大分子需要相當(dāng)?shù)募兌炔拍苓M行結(jié)晶 純度越高，越容易結(jié)晶 母液中目的物的純度接近或超過50%,3.溶劑 生化小分子：水、乙醇、甲醇、丙酮、氯仿 大分子（蛋白質(zhì)、核酸、酶）：(NH4)2SO4，NaCl,磷酸緩沖液、Tris緩沖液

9、、丙酮、乙醇等 混合溶劑 選擇溶劑需注意： 溶劑不能和結(jié)晶物質(zhì)發(fā)生化學(xué)反應(yīng) 對結(jié)晶物質(zhì)有較高的溫度系數(shù) 雜質(zhì)有較大的溶解度/結(jié)晶物質(zhì)與雜質(zhì)有溶解度的差別 對于容易揮發(fā)的有機溶劑，操作方便、安全,4.pH 等電點附近,5.溫度 低溫下結(jié)晶： 不容易變性失活 使溶質(zhì)溶解度降低，有利于溶質(zhì)的飽和 避免細菌繁殖 溫度：0-20 oC 富含有機溶劑的結(jié)晶體系：更低的溫度 溫度過低： 黏度增大結(jié)晶變慢低溫析出結(jié)晶后適當(dāng)升溫,6.時間 生物大分子（蛋白質(zhì)）： 相對分子質(zhì)量大、立體結(jié)構(gòu)復(fù)雜，結(jié)晶過程困難，分子的有序排列消耗能量大，晶核生長和晶體長大都比較緩慢，從不飽和到飽和的調(diào)節(jié)過程需緩慢進行。 需要一定的結(jié)

10、晶時間 生物大分子的結(jié)晶時間差別很大，少則以時計，多則以月計。,三、結(jié)晶的一般方法,除去一部分溶劑：如蒸發(fā)濃縮 不除去溶劑，直接加入沉淀劑及降低溫度,工 業(yè),鹽析法 有機溶劑結(jié)晶法 等電點結(jié)晶法 其他,實驗室,（一）鹽析結(jié)晶法 主要用于大分子如蛋白質(zhì)、酶、多肽等的結(jié)晶 原因：不耐熱，對pH變化及有機溶劑十分敏感 用中性鹽作為沉淀劑，安全、操作簡單,加固體鹽法 加飽和鹽溶液 透析擴散法,（二）有機溶劑結(jié)晶法 用于小分子物質(zhì)的結(jié)晶,直接加有機溶劑結(jié)晶 利用揮發(fā)性溶劑蒸發(fā)結(jié)晶,（三）等電點結(jié)晶法 多用于一些兩性物質(zhì),（四）其他 溫度差法、加入金屬離子法,四、提高結(jié)晶質(zhì)量的方法,晶體的質(zhì)量,大小 形狀

11、 純度,（一）晶體大小,1.過飽和度 增加過飽和度一般使結(jié)晶速度增大,過飽和度,成核速度,晶體生長速度,原因：,得到的晶體較細小,2.溫度 快速冷卻：達到較高的過飽和度，晶體細小且常導(dǎo)致生成針狀晶（容易散熱）； 緩慢冷卻：粗大的晶體,溫度,成核速度,晶體生長速度,低溫得到較細晶體,3.攪拌 攪拌能加快成核速度，提高晶體長大的速度。 攪拌達到一定程度后，再加快攪拌效果不顯著；晶體還會被打碎 攪拌越快，晶體越細,4.晶種 加入晶種能誘導(dǎo)結(jié)晶，而且能控制晶體的形狀、大小和均勻度,（二）晶體形狀 同種物質(zhì)用不同方法結(jié)晶時，得到的晶體形狀可以完全不一樣。 外形變化是由于在一個方向生長受阻，或在另一方向生

12、長加速所致。 影響因素： 過飽和度、攪拌、溫度、pH； 從不同溶劑中結(jié)晶得到不同的外形； 雜質(zhì)：雜質(zhì)可吸附在晶體表面，使其生長速度受阻,（三）晶體純度 晶體常會包含母液、塵埃和氣泡等，所以結(jié)晶器要清潔，結(jié)晶液應(yīng)過濾以防止夾帶灰塵、鐵銹等； 晶體表面有一定的物理吸附能力，因此有很多母液和雜質(zhì)表面雜質(zhì)可通過洗滌除去。 結(jié)晶速度過大時（過飽和度較高、冷卻速度很快），容易形成晶簇，包含母液等雜質(zhì)。 重結(jié)晶,（四）重結(jié)晶 將晶體用合適的溶劑溶解，再次結(jié)晶，使純度提高。 原因：雜質(zhì)和結(jié)晶物質(zhì)在不同溶劑和不同溫度下的溶解度不同。 重結(jié)晶的關(guān)鍵：選擇一種合適的溶劑 溶質(zhì)在溶劑中的溶解度隨溫度升高而迅速增大，冷卻時能析出大量結(jié)晶； 溶質(zhì)易溶于某一溶劑而難溶于另一溶劑，且兩溶劑互溶用混合溶劑進行試驗。, 對色素、降解產(chǎn)物、異構(gòu)體等雜質(zhì)有