1、植物細胞球的大規(guī)模培養(yǎng)和有用物質(zhì)生產(chǎn)(1)，概括(2)，植物細胞球規(guī)?；囵B(yǎng)系統(tǒng)的建構(3)，利用細胞球培養(yǎng)生產(chǎn)有用物質(zhì)，植物次級代謝產(chǎn)物：植物中的一個不是植物生長發(fā)育所需的小分子有機化合物，其發(fā)生和分布通常為屬，包括器官組織和生長發(fā)育期的專一性。 植物中二次產(chǎn)物的合成和分解過程稱為次級代謝。 (1)、概要、植物產(chǎn)生代謝產(chǎn)物的類型大致可分為分子結構：酚類化合物：類黃酮類醌類(苯醌、萘醌、蒽醌)萜類化合物：三萜類化合物皂角苷； 甾類化合物皂角苷； 單萜烯、倍半萜、二萜類化合物含氮化合物：生物堿； 胺類(一級、二級、三級、四級胺)的非蛋白氨基酸能產(chǎn)生氰乙炔類、有機酸，植物次級代謝產(chǎn)物在壓電石英藥、

2、食品、輕化工業(yè)等領域具有重要意義。 李時珍列入本草綱目的1892種藥物大部分是植物藥物，現(xiàn)在約25種法定藥物來源于植物。 其藥物的有效成分均為副產(chǎn)物。 許多植物次級代謝產(chǎn)物是優(yōu)良的食品添加劑和珍貴的化妝品原料。 部分是生物毒素的主要來源，可用于殺蟲、殺菌，但對環(huán)境和人畜無害是理想的環(huán)保產(chǎn)品。自然植物和細胞球培養(yǎng)的紫草寧含量比較生產(chǎn)方式生產(chǎn)周期紫草寧含量(干重)完全植物23年12植物細胞培養(yǎng)3周14植物次級代謝產(chǎn)品的市場潛在能力產(chǎn)品成分用途年銷售額(億美元)長春花堿治療白血病1820 (美國)奎寧治療瘧疾510 (美國) 熱致殺蟲劑20 (全球)地黃心臟病藥2055 (美國)、植物細胞球大規(guī)模培

3、養(yǎng)的技術要求：從工程細胞球的生長和培養(yǎng)技術方面來看，為了得到產(chǎn)量一定的產(chǎn)物，1、培養(yǎng)的細胞球必須滿足3個條件：遺傳穩(wěn)定。 2、細胞球生長和生物合成速度快，可在短時間內(nèi)得到高產(chǎn)的最終產(chǎn)物。 3 .代謝產(chǎn)物最好能儲存在細胞球中，釋放到培養(yǎng)基中，以免迅速分解。 (二)、植物細胞球規(guī)模化培養(yǎng)系統(tǒng)的建構1、種子細胞球的選擇(1)正確選擇可產(chǎn)生目的化合物的植物種類(2)盡可能選擇自然狀態(tài)下可產(chǎn)生天然產(chǎn)物的組織器官作為外植體(3)高產(chǎn)種子細胞克隆的方法：單細胞球培養(yǎng)后，對單細胞擴增產(chǎn)生的愈傷組織進行2份、一份成分含量分析，另一份保留培養(yǎng)。 2、種子細胞系增殖和擴大培養(yǎng)種子細胞球增殖初期一般采用搖瓶培養(yǎng)，搖瓶

4、體積從數(shù)百毫升逐漸擴大到數(shù)公升。 如果細胞球數(shù)增加到一定值，則轉(zhuǎn)移到體積小的生物反應器中進行培養(yǎng)。 3、大規(guī)模培養(yǎng)系統(tǒng)的建構(1)統(tǒng)一培養(yǎng)：在一個培養(yǎng)體積中接種細胞球或添加培養(yǎng)基后，中途不更換培養(yǎng)基的方式。 (2)連續(xù)培養(yǎng)：在培養(yǎng)過程中，不斷在反應器中以一定產(chǎn)水量添加新培養(yǎng)基，并以一定產(chǎn)水量從系統(tǒng)中提取培養(yǎng)基的方式。 (3)半連續(xù)培養(yǎng)：批量培養(yǎng)一個周期結束后，從反應器中取出大部分細胞球混懸劑，僅保留小部分細胞球混懸劑作為下一個培養(yǎng)周期的種子細胞球，然后加入新鮮培養(yǎng)基進行培養(yǎng)的方式。 (3)生物反應器的類型和特征大規(guī)模培養(yǎng)系統(tǒng)的基本原理方法與上述實驗室懸浮培養(yǎng)相一致，但大規(guī)模培養(yǎng)采用的設備和控制

5、技術比實驗室小規(guī)模培養(yǎng)復雜得多。 植物細胞培養(yǎng)具有周期長、細胞球抗剪能力弱、易凝聚等特點。 在云同步，植物細胞球規(guī)模培養(yǎng)的目的是生產(chǎn)天然產(chǎn)物，因此必須考慮修訂植物細胞培養(yǎng)反應器不僅有利于細胞球的生長，也有利于產(chǎn)物的積累和分離?？傮w而言，適于植物細胞培養(yǎng)的反應器應具有適宜的氧傳遞、良好的流變性和低剪切力。 機械攪拌式培養(yǎng)系統(tǒng)機械攪拌式生物反應器通常根據(jù)微生物發(fā)酵槽改良設定，根據(jù)植物細胞球的特性，根據(jù)微生物發(fā)酵槽化學基，攪拌裝置減少剪切，一般將葉輪式變更為螺旋式，植物細胞的生長周期長，需要隨時補充水分和營養(yǎng)， 由于需要安裝修訂加液裝置的植物細胞球的大姨媽活動需要新鮮空氣，細胞球代謝也可能產(chǎn)生有害瓦

6、斯氣體，因此為了便于安裝修訂通氣裝置的采樣觀察，還設置了采樣通訊端口。 生物反應器、Stirred Tank Bioreactors、 anexternalmotorisusedtoagitatethegrowthmediumwithimpellers.sterileairorcombinationsofgasescanbeintroduced (sparkling )氣壓攪拌式培養(yǎng)系統(tǒng)考慮到免不得機械攪拌式反應器的剪切作用，攪拌機旋轉(zhuǎn)的中軸大多是容易污染培養(yǎng)物的部位，所以開發(fā)了空氣提升式生物反應器，但存在攪拌不均勻的缺點。bubblecolumnbioreactor (airlift rea

7、ctor )、introductionofsterileairorpuregasesisusedbothforagitationandoxygenation、internal loop tubeplacedinsidethereactorcreatesinternalcirculationloop，外部環(huán)形airlift生物反應器。 circulationthroughanexternalloop，旋轉(zhuǎn)式培養(yǎng)系統(tǒng)一般用于產(chǎn)品中試驗、不分解細胞球才能得到目標物的培養(yǎng)，其優(yōu)點是控制精確、處理靈活、缺點是培養(yǎng)體積小。 固定化培養(yǎng)系統(tǒng)這一技術的優(yōu)點是，培養(yǎng)系統(tǒng)的理化化學環(huán)境可比較容易控制、研究特定代謝

8、途徑、調(diào)節(jié)簡單的細胞球定位于植株中間的狀態(tài)，可相互緊密接觸形成一定的理化梯度， 有利于二次產(chǎn)物合成的細胞球由于固定在載體上，培養(yǎng)基可不斷交換，從培養(yǎng)基中提取產(chǎn)物，由于培養(yǎng)基中含有許多初生產(chǎn)物而免除了細胞球代謝的種子文件回歸抑制，由于細胞球殘留在反應器中，新的培養(yǎng)基就可以再利用這些個的細胞球來生產(chǎn)初生產(chǎn)物， 因為節(jié)省了生產(chǎn)細胞球的時間和費用的細胞球固定在一定的介質(zhì)上，可以從培養(yǎng)基中持續(xù)提取生成物，從而可以進行連續(xù)生產(chǎn)。 細胞球固定化培養(yǎng)技術，根據(jù)其載體可分為兩類：包埋式固定化培養(yǎng)系統(tǒng)：載體多采用瓊脂、瓊脂、藻朊酸鹽、聚酰胺等吸附式固定化培養(yǎng)系統(tǒng)：載體采用尼龍網(wǎng)、烏拉坦泡沫、中空纖維等材料。 (1

9、)利用細胞球培養(yǎng)生產(chǎn)有用物質(zhì)的一般普洱茶(1)選項必須注意以下條件：藥效是肯定的，對其有效成分一盞茶了解的有效成分和藥理有測定可靠方法市場不足，或取價格高的有藥效成分的部位，該部位是卡爾(四)細胞球培養(yǎng)生產(chǎn)有用物質(zhì)；(二)細胞球株系通過誘導分離愈傷組織，建構懸浮細胞球繁殖系統(tǒng)(液體培養(yǎng))。 在工廠化生產(chǎn)中，為了提高有用物質(zhì)產(chǎn)品的產(chǎn)量和質(zhì)量，對細胞球培養(yǎng)的選擇有兩個基本要求：有用物質(zhì)的合成積累能力強，生長速度快；(3)大量培養(yǎng)是將選擇的優(yōu)良細胞球株擴大繁殖后，作為細胞球工廠化培養(yǎng)的生產(chǎn)“種子”進行大量培養(yǎng)。 (4)從產(chǎn)品的提取和精制植物細胞培養(yǎng)物中提取和精制的產(chǎn)品。 2、提高有用物質(zhì)生產(chǎn)效率的技

10、術因素篩選高產(chǎn)細胞系從實驗材料中篩選高產(chǎn)細胞球株系是提高生產(chǎn)率、降低生產(chǎn)成本的重要因素。 特異的次級代謝產(chǎn)物往往形成于特異的器官之中。 因此，以特異器官為材料，建構特異功能的細胞系，從中篩選出反復多代培養(yǎng)的有效高產(chǎn)的細胞球株。篩選的高效、高產(chǎn)細胞球株系、某些植物細胞系高效、高產(chǎn)性能多年穩(wěn)定，而某些植物細胞系不穩(wěn)定，需要定期檢測更新細胞球株系。 第一步：解決生質(zhì)能源生產(chǎn)(促進細胞分裂)第二步：促進次級代謝物合成，即細胞球指數(shù)增長停搏前后更換培養(yǎng)基，有利于二次生質(zhì)能源的積累。 二步培養(yǎng)法，培養(yǎng)基中添加的前驅(qū)物：有用的次級代謝物的前驅(qū)物。 在煙愈傷組織培養(yǎng)中，加入前體物質(zhì)煙酸，煙堿的生成量就會增加。

11、 培養(yǎng)基中生長調(diào)節(jié)劑的作用植物生長調(diào)節(jié)劑不僅影響植物的脫分化和再分化，還影響次級代謝物質(zhì)的產(chǎn)生。 在煙草愈傷組織培養(yǎng)中，可以在培養(yǎng)基中添加IAA來合成煙堿，但是在含有2，4-d的培養(yǎng)基中煙堿的合成受到阻礙。 培養(yǎng)條件的影響光、溫度等影響次級代謝。 胡蘿卜愈傷組織培養(yǎng)中，光照條件下紫紅愈傷組織可生成大量花節(jié)氰苷類，且低溫條件下生成量高。 采用固相細胞球培養(yǎng)系統(tǒng)細胞球生長分裂旺盛時，次級代謝物的產(chǎn)量較低。 采用固相培養(yǎng)，將細胞球培養(yǎng)為惰性基質(zhì)，細胞球生長緩慢，可提高次級代謝物質(zhì)的產(chǎn)量。思考題1好的懸浮細胞系有什么特點？對建構懸浮細胞系的愈傷組織有什么要求？ 2建構懸浮細胞系的關鍵技術是什么？ 3懸

12、浮細胞系在繼代培養(yǎng)有集體成長規(guī)律嗎？ 4細胞球大規(guī)模培養(yǎng)有哪些培養(yǎng)系統(tǒng)紫杉醇：二萜類化合物類化合物最早從太平洋紅豆杉Taxus brevifolia的樹皮中分離，廣泛用于卵巢癌、乳腺癌、非小細胞球肺癌等十多種癌的治療，目前主要來源于紅豆杉屬植物，紫杉醇簡介、理化性質(zhì)、 英文名： Paclitaxel，Taxol or TM分子式： c440 pH 8容易分解的紫杉醇可以在特定條件下氧化，但還原極為困難，紫杉醇的研究開發(fā)過程， NCI是過去15年研制的最優(yōu)秀抗癌藥物20世紀90年代抗腫瘤藥的三大成果之一湯姆森科學技術桂冠獎，Ramesh Panchagnula，internationaljour

13、nalofpharmaceutics.1998 (172 ) 抗癌一線藥的銷售額，一年5億美元的理論需求量為2g /人，500萬人/年1000kg/年的實際銷售量為350 kg/年，紫杉醇的供求有相當大的差別，圖1 :國際紫杉醇原料藥的需求動向圖(單位： kg )，圖2 :國際紫杉醇的銷售上游產(chǎn)業(yè)藥源問題下游制劑產(chǎn)業(yè)藥效(活性、水溶性)安全性生物相容性、藥源問題， 紅豆杉主要原料植物國家一級保護野生植物世界10大瀕危種之一是生長緩慢分布的有限Taxol含量低的樹皮中的Taxol含量為：0.00001-0.069% 3000棵樹=10噸樹皮=1kg Taxol=500人的患者，人工栽培是種子繁殖

14、， 扦插等無性繁殖方法快，采用大面積人工繁殖紅豆杉幼苗尋找紅豆杉替代物，從紅豆杉非樹皮部位提取生產(chǎn)紫杉醇的非紅豆杉植物，優(yōu)點：生長周期縮短簡便，直接，缺點： 1，紫杉醇含量低生長慢2，提取工藝復雜，藥源問題解決方法(1)、 藥源問題解決化學合成全合成1994年成功的目前6個途徑半合成是以10-DAB和Baccatin為半合成原料得到紫杉醇的新方法采用10-DAT，缺點： 1，合成過程復雜，幾十步2，費用高，化學制劑昂貴，總收率過低(2% )。 充分利用再生資源2，生產(chǎn)效率高，具有最實用的價值，可以進行工業(yè)生產(chǎn)，取得紫杉醇的結構效果關系信息，可以進行結構改造，缺點：合成過程相對復雜(11階段化學

15、轉(zhuǎn)化和7階段分離)，藥源問題解決方法(3)、 生物方法組織和細胞球培養(yǎng)微生物發(fā)酵生物合成研究階段的紅豆杉生物合成路線基本上有10種相關酶催化劑基因愛沙尼亞克朗表達，利用基因工程手段改造紅豆杉，有利于提高紫杉醇產(chǎn)量的分離純化4，低成本，生長周期短5，為半合成提供原料6，有望工業(yè)化生產(chǎn)，缺點： 1， 產(chǎn)量低，不穩(wěn)定2，工業(yè)化擴大研究，水溶性紫杉醇使用0.77mM/L增加溶劑差：聚氧乙烯蓖麻籽油和乙醇問題穩(wěn)定性和水溶性差(7mm )我國是中藥飲片資源最豐富的國家，有詳細記載的約5000種。 中藥飲片治療疾病的歷史長達一千年，中藥壓電石英已形成完整的科學系統(tǒng)。 植物藥效成分研究形成了“天然藥物化學”研

16、究的新領域。 在藥用植物中，具有藥物功能的物質(zhì)種類很多，結構復雜。 除了小分子的天然有機化合物以外，還有很多生物大分子活性物質(zhì)。 不同組方的藥用成分和功能研究是一項巨大的工程，相當于染色體組和蛋白質(zhì)組研究。中藥飲片復方復雜系統(tǒng)研究(北京牌高等院校漢啟德院士)，二、植物來源藥物種類1、天然有機化合物(1)糖和氰苷類類(2)苯丙類：苯丙酸、丙酸、庫陸戰(zhàn)隊員等(3)醌類：補酶催化劑Q10、紫草素(。 (6)萜類：青蒿素、齊墩果酸(7)甾類化合物：牛葡萄糖苷、毛第黃毒葡萄糖苷(8)生物堿：咖啡因、喜樹鹽化學基、2、植物蛋白、多肽、酶催化劑類生理活性物質(zhì)表2-16 3，植物糖類藥物含單糖表2-17 4，植物脂質(zhì)藥物(1) 脂肪和脂肪酸類：亞油酸、亞麻油酸、花生四烯酸油脂(2)磷脂復合物類：大豆磷脂復合物(3)固醇類：豆固醇、-谷固醇。 三、植物來源藥物的植被實例1、植物SOD 2、植酸鈣元素鎂和肌醇3、植物不飽和脂肪酸4、植物來源藥物的研究前景1、植物細胞培養(yǎng)2、植物組織培養(yǎng)3、有效成分的分離、純化、結構和功能測定。 3、生產(chǎn)一些有用物質(zhì)，生物堿多數(shù)生物堿已經(jīng)被用作醫(yī)藥。 嗎啡等生物堿通?？蓮镍f片中提取，用作神經(jīng)麻醉劑，利用罌粟種子愈傷組織培養(yǎng)可提取嗎啡堿及其生物堿。 氰苷類物質(zhì)利用胡籮卜愈傷組織培養(yǎng)生產(chǎn)皂角苷，進入工廠化生產(chǎn)。 醌系物質(zhì)利用紫草