1、第三章 紫外-可見吸收光譜法（UV-Vis）,基于被測物質(zhì)的分子對紫外-可見光具有選擇吸收的特性而建立的分析方法。,分子光譜 吸收光譜,可見光,遠紫外 （真空紫外）,紫外光,一、紫外-可見光,第一節(jié) 概述,1. 物質(zhì)分子對光的吸收,E = Ee + Ev + Er,2. 分子吸收光譜,A（吸光度）-（波長）關(guān)系圖,Er： 0.05 eV,帶光譜,Ee： 1 20 eV,Ev： 0.05 1 eV,二、紫外-可見吸收光譜,三、紫外-可見吸收光譜 法,定性分析,定量分析,在一定的實驗條件下，物質(zhì)在某波長處的吸光度與物質(zhì)的濃度成正比。,吸收光譜的位置 (max )和形狀,1. 精密度較高,3. 檢出

2、限低,相對誤差 13%,2. 準(zhǔn)確度較高,DL 10-7 10-8 10-9 g / ml,不一定要追求低的檢出限,4. 儀器比較簡單 操作比較簡便,5.應(yīng)用廣泛,選擇性一般比較好。條件適當(dāng)，可不經(jīng)分離進行單組分或多組分測定。,主要干擾： 共存組分與被側(cè)組分的光譜重疊,RSD1%,四、紫外-可見吸收光譜 法的特點( 定量分析 ),承擔(dān)60%的定量分析任務(wù)（無機離子 有機物 生化分析）,一些有機物結(jié)構(gòu)分析的輔助方法,五、研究工作的現(xiàn)狀,提高選擇性,提高靈敏度,第二節(jié) 吸收光譜法基本原理,單色光 復(fù)合光 光的互補,單色光,復(fù)合光,光的互補,單一波長的光,由不同波長的光組合而成的光,若兩種不同顏色的

3、單色光按一定的強度比例混合得到白光（無色的光），那么就稱這兩種單色光為互補色光，這種現(xiàn)象稱為光的互補。,一、物質(zhì)對光的選擇性吸收,當(dāng)溶液中的某種物質(zhì)選擇性地吸收可見光中某種顏色的光時，溶液就會呈現(xiàn)出對應(yīng)的互補色。,黑色-全吸收；白色-全反射；無色-全投射,光,I0,I,L,二、吸收光譜,如果讓不同波長的單色光依次照射某一吸光物質(zhì)，并測量改物質(zhì)在每一波長處對光吸收程度的大?。ㄎ舛?，A），然后以波長為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)作圖，即得到一條吸光度隨波長變化的曲線，稱之為吸收曲線譜圖也稱為吸收光譜。,末端吸收,最強峰,肩峰,峰谷,次強峰,max min ,A,1. 吸收峰的形狀及所在位置 定性的依據(jù)

4、 2. 吸收峰的強度定量的依據(jù) 光吸收定律,A,紫外可見光譜的特征,三、光吸收定律,透光率 T，透光光強度與入射光強度的比值,全部吸收 T = 0.0,全部透射 T = 100.0 %,（一）朗伯-比爾定律,1. 定律,吸光度 A,朗伯-比爾定律 A = Kbc,1） 液氣固介質(zhì)均適用,2）入射光是單色光，平行光,1730年 Lamber A b (C固定),1852年 beer A C ( b固定),3）稀溶液,I0,It,-dIx =k1 Ix adn,dn = CSdb,-dIx=k1 IxaCSdb,-dIx/Ix= k Cdb,dIx,2 . 朗伯-比爾定律推導(dǎo),S,物理意義：當(dāng)一束

5、平行光垂直通過某一均勻非散射的吸光物質(zhì)時，其吸光度A與吸光物質(zhì)的濃度C及吸收池厚度b成正比（定量分析的依據(jù)）,adn C,吸光度 與透光率,T,T = 0.0 %,A = ,T = 100.0 %,A = 0.0,A = 0.434,T = 36.8 %,3. 吸光度的加合性,A = A1 + A2 + + An,各組分之間無相互作用,條件：,多組分測定及扣除空白方法的理論基礎(chǔ),用途：,在某一波長處,C: mol/ L,2) ( L mol1 cm-1),C: g / L,1) a ( L g 1 cm-1),吸光物質(zhì)定性的特征參數(shù),4. 吸光系數(shù),吸光物質(zhì)定量分析的靈敏度參數(shù),物理意義為當(dāng)吸

6、光物質(zhì)的濃度為1mol.L-1，吸收池厚度為1cm時，吸光物質(zhì)對某波長光的吸光度,影響因素：入射光的波長 吸光物質(zhì)的性質(zhì)（吸光質(zhì)點的面積、有效躍遷概率） 溶劑 溫度等環(huán)境因素,3) 檢出限與摩爾吸光系數(shù),若可測量的吸光度為0.001,一般 103 104；靈敏 的 104；個別的可達 106,增大 是提高方法靈敏度的重要途徑,提高躍遷幾率 增大截面積,(二) 導(dǎo)致 A-C 關(guān)系偏離朗伯比爾定律的原因,1. 入射光的單色性不好,設(shè)入射光由 1 和 2 兩種波長組成，,對于 1,總吸光度,對于 2,偏離 減小校準(zhǔn)曲線的線性范圍,若 , 1 = 2= ,在一定的濃度范圍內(nèi) A= b C,若 , 1

7、2,A-C曲線向濃度軸彎曲，偏離beer定律，負偏離,*要獲得較寬的線性范圍, 越大，偏離越嚴(yán)重, 適當(dāng)提高入射光的單色性, 在吸收光譜的峰值(max)處進行測定,1）一種為- 很小，近似的認(rèn)為 1 = 2,2）另外一種為- 很大，但在選擇的入射光波長附近曲線比較平坦， 1 = 2,2. 非平行入射光引起的偏離，光程的變化引起信號的變化,3. 介質(zhì)不均勻引起的偏離，如膠體或渾濁溶液,若不平行，實際光程比吸收池厚度大，產(chǎn)生正偏離,吸收和散射等，使檢測到的吸光度偏大，產(chǎn)生正偏離,濃度增高，吸光物質(zhì)粒子平均距離減小，相互作用增強，電荷分布改變， 改變。 減小，向濃度軸偏離； 增大，向吸光度軸偏離。,

8、4. 溶液濃度過高,5. 溶液中發(fā)生了化學(xué)反應(yīng)（吸光物質(zhì) 離解 締合 異構(gòu)互變 生成新物質(zhì) ）, 絡(luò)合-離解,Cr2O72- + H2O 2CrO42- + 2H+,350,375,Cr2O72- 濃度不同 離解度不同 A-C 關(guān)系偏離beer定律, 聚合-離解,MR M + R,C (1-) C C ,*加入過量顯色劑 ，可使 R保持不變，為定值，MR才能作為C的量度，A=KbC 成立。,稀溶液定律,CM的初始濃度,MR M的測定濃度,恒定MR才能作為C的量度,一、有機物的紫外可見吸收光譜,E E E n E * E *,（一）電子躍遷類型,第三節(jié) 紫外可見吸收光譜,（二） 生色團 及共軛作

9、用,乙烯基、羰基、亞硝基、偶氮基、乙炔基、腈基,1.生色團 含有 鍵的基團，在吸收外來輻射時可發(fā)生-*和 n-*躍遷。,2. 生色團的共軛作用,在共軛體系中電子有更大的離域性，*能量降低，n *和 * 的E降低。導(dǎo)致,吸收波長增大（紅移）；,max 增大,一些含有n電子的基團 OH NH2 X,（三）助色團（Auxochromous group）,1. 助色機理,n-共軛 降低*能量使 *的E降低,2. 效果,max 紅移；max增大,n電子增加，助色作用增強；n電子消失，助色作用消失。,max max,208 nm 7000,230 nm 8800,203 nm 7500,（ 四 ）溶劑效應(yīng)

10、,-* 躍遷的E減小，吸收峰紅移。,1.對吸收波長的影響,n- * 躍遷E 增大，吸收峰藍移,2.對光譜精細結(jié)構(gòu)的影響,溶劑化作用限制了分子的自由轉(zhuǎn)動， 溶劑極性限制了分子的自由振動， 吸收光譜精細結(jié)構(gòu)消失 ，變得平滑。,溶劑選擇原則,1）繪制吸收光譜（定性），應(yīng)選用非極性溶劑；,2）比較已知物和未知物的吸收光譜，應(yīng)選用 同一溶劑；,3）所用溶劑在測量的光譜范圍內(nèi)無吸收或少吸收。,在極性溶劑中,1. dd 配位場躍遷,正八面體配合物dd 配位場躍遷,在配體的作用下過渡金屬離子的d 軌道裂分，吸收輻射后，產(chǎn)生 dd 躍遷。,在實際的分析應(yīng)用中沒有價值，但可以用于配合物結(jié)構(gòu)或無機配位鍵合理論方面的

11、研究。,dd 躍遷概率較小，摩爾吸收系數(shù)一般只有 0.1100 Lmol-1cm-1,二、 無機化合物的紫外-可見吸收光譜,2.電荷轉(zhuǎn)移躍遷,max 在可見區(qū)； max 104,中心離子和配位體之間，一方的電子向另一方軌道轉(zhuǎn)移躍遷，所產(chǎn)生的吸收光譜稱為荷移光譜。,3. 中心離子影響下配位體 的-* 躍遷,當(dāng)金屬離子與含有生色團及助色團的配位體配合后，受到金屬離子的作用，配位體所含的共軛結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，導(dǎo)致其吸收光譜藍移或紅移。,* E 改變 E 藍移 ； E 紅移,例：茜素磺酸鈉在pH45時與Al3+的顯色反應(yīng),Al3+ / 3,max = 420 nm,max = 475 nm,茜素磺酸鈉,

12、E 紅移,一、比色法 1. 目視比色法 用眼睛觀察比較溶液顏色以確定物質(zhì)含量 原理： 間接應(yīng)用比爾定律（觀測吸收光的互補色光） 儀器：比色管 方法：標(biāo)準(zhǔn)系列法 特點：簡單 準(zhǔn)確度不高,第四節(jié) 紫外-可見分光光度法及儀器,2. 光電比色法,用儀器比較溶液顏色以確定物質(zhì)含量原理： 朗伯-比爾定律（測定吸光度） 儀器：比色計 方法：標(biāo)準(zhǔn)曲線法 特點：單色光（純度較差） 靈敏度和準(zhǔn)確度較高 使用參比溶液，一定選擇性 利用吸光度加和性，可做多組分測定,二、分光光度法,用儀器測定溶液吸光度以確定物質(zhì)含量原理： 朗伯-比爾定律 儀器：分光光度計 方法：標(biāo)準(zhǔn)曲線法 特點：單色光（純度高） 靈敏度和準(zhǔn)確度高 選

13、擇性好 利用吸光度加和性，可做多組分測定 擴大波長范圍，可測紫外、紅外吸收,三、分光光度計基本部件,光源,單色器,樣品池,檢測器,信號處理 及輸出,1.光源,基本要求： 強 穩(wěn)定 光譜區(qū)域?qū)?能量分布均勻,可見光源 鹵鎢燈 250 2000 nm,紫外光源 氫燈 氘燈 185 350 nm,2.單色器,作用：從復(fù)合光中獲取單色光,棱鏡,光柵,玻璃， 350 2500 nm, 石英，185 4500 nm,透射光柵 反射光柵；平面光柵 凹面光柵,玻璃，光學(xué)玻璃，石英,多道 ： 二極管陣列 電荷耦合器件（CCD）電荷轉(zhuǎn)移器件（CID）,狹縫 色散元件,3.樣品池,4.檢測器,5.信號處理及輸出 表

14、頭、記錄儀、屏幕、數(shù)字顯示,作用：將光信號轉(zhuǎn)換為電信號，并放大,單道 ： 光電管，光電倍增管；,光電倍增管（PMT）,有暗電流,電壓要穩(wěn)定,放大倍數(shù)104107,1. 工作原理 參比溶液 I0 調(diào) T=100 % A=0 ；試液 I,補償吸收池對光的吸收、反射，溶劑對光的吸收、散射，使I0成為真正只與被測物質(zhì)有關(guān)的I0,2.特點,（一）單波長單光束分光光度計,四、分光光度計構(gòu)造原理,不能進行吸收光譜的自動掃描（不易繪制吸收光譜）, 精密度不高,(參比溶液和試液不在同一時間測量，光源的波動影響測量結(jié)果), 簡單，廉價，適用于常規(guī)分析,（二）雙光束分光光度計,1.工作原理, 精密度好（ I0 和

15、I 變化的幅度一致，補償儀器的不穩(wěn)定性）, 可進行吸收光譜的自動掃描（繪制吸收曲線）, 儀器復(fù)雜 較昂貴,2.特點,I0 和 I 同時（或交替）測量，統(tǒng)計處理。,儀器實物,儀器實物1,第五節(jié) 分析條件的選擇,一、顯色反應(yīng)條件的選擇,（一）顯色反應(yīng)及其類型 無機陽離子的顯色反應(yīng)絕大多數(shù)都屬于絡(luò)合反應(yīng)，其中三元絡(luò)合物體系在光度分析中發(fā)展較快、應(yīng)用較為普遍。重要的三元絡(luò)合物體系主要由以下幾種類型： 1混配型絡(luò)合物體系 例如, V(V)可與H2O2和吡啶偶氮間苯二酚（PAR）形成1：1：1的有色絡(luò)合物。 2離子締合物體系 例如，Ag+ 與鄰二氮菲形成配陽離子，再與溴鄰苯三酚紅的陰離子作用形成深藍色的離

16、子締合物。 3. 金屬離子-配體-表面活性劑體系 如在Au-KI-丁基羅丹明B體系中加入曲通-100，水溶液中即可測定，值高達1.2 106 。,顯色反應(yīng)基本要求,1.選擇性好 顯色劑 R不與共存組分顯色或顯色但不產(chǎn)生干擾, = 顯- 配 60nm,2.靈敏度高 MRn max 大,3.精密度高 MRn 穩(wěn)定，組成恒定,4.顯色反應(yīng)條件易于控制,（二）顯色條件的選擇,1. 顯色劑的用量,M + nR = MRn,過量 定量,實際工作中，作 A CR 曲線，尋找適宜 CR 范圍。,RH = R- + H+,例：磺基水楊酸 Fe 3+,紫紅色,pH = 2 3,FeR,pH = 4 7,FeR2,

17、橙色,pH = 8 10,FeR3,黃色,2. 酸度,影響顯色產(chǎn)物的組成,低酸度下一些金屬離子水解,實際工作中，作 A pH 曲線，尋找適宜 pH 范圍。,影響顯色劑的離解度,3. 顯色溫度,4.顯色反應(yīng)時間,作 A t 曲線，尋找適宜 反應(yīng)時間。,顯色反應(yīng)在一定溫度下才能較快地進行,一般室溫即可 , 若需加熱則須控制溫度。,顯色反應(yīng)完成需要一定的時間；,生成的配合物在一定的時間范圍內(nèi)穩(wěn)定,5.有機溶劑和表面活性劑,表面活性劑：膠束增溶，增穩(wěn)；形成多元配合物,有 機 溶 劑： 提高顯色靈敏度,（二）測量條件的選擇,1.測量波長,無干擾：選擇max,有干擾：選擇不重疊的較高峰,最大吸收原則,吸收

18、較大、干擾最小原則,當(dāng)T = 0.368 = 36.8 %時，儀器測量誤差最小,此時， A = 0.434,A 0.15 0.8,T 70 15%,光源及檢測器的不穩(wěn)定性；吸收池狀態(tài)位置的不確定性；讀數(shù)的不確定性,2.吸光度范圍的控制,改變測量波長,調(diào)節(jié)試液濃度,3.參比液的選擇,作用 調(diào)節(jié)儀器零點，消除器皿及溶劑的吸收 扣除共存組分、顯色劑及其他無關(guān)的吸收,無吸收 不顯色,無吸收,溶劑,吸收 不顯色,無吸收,不加顯色劑的試液,無吸收 不顯色,吸收,顯色劑溶液,顯色 吸收,吸收,掩蔽待測組分后加顯色劑 的試液,A 試液 = A 共存組分+ A其他+ A 待測吸光物質(zhì),A 參比 = A共存組分+

19、 A其他,顯色劑 共存組分 參比溶液,例：鉻天箐測Al 3+， Cr 3+ Ni2+ 干擾。用F-掩蔽Al3+ 作參比,第六節(jié) 吸光光度法的應(yīng)用,一、定性分析,（一）化合物鑒定,（二）有機物結(jié)構(gòu)分析,比較未知物和標(biāo)準(zhǔn)物的吸收光譜,根據(jù)吸收曲線的特征推斷化合物結(jié)構(gòu)中的官能團和共軛體系,1比較光譜法， 2制作試樣的吸收曲線并與標(biāo)準(zhǔn)紫外光譜對照； 3利用Woodward-Fieser經(jīng)驗規(guī)則求最大吸收波長。,二、定量分析,. （一）單組分的測定,1. 校準(zhǔn)曲線法,在確定的最佳顯色反應(yīng)條件和最佳測量條件下分別測量一系列不同含量的標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度,以標(biāo)準(zhǔn)溶液中被測組分的含量為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制

20、A-c曲線，此即校準(zhǔn)曲線。現(xiàn)代分析中大多要求以最小二乘法處理制作校準(zhǔn)曲線的實驗數(shù)據(jù)，得到一元線性回歸方程。 A = bC,例： 人血清中總蛋白的測定。在堿性溶液中，蛋白質(zhì)分子中多肽的肽鍵可與銅離子作用生成紫紅色絡(luò)合物。在37下，反應(yīng)15min，一個銅離子可與6個肽鍵形成配位鍵，不同種類蛋白的顯色能力相似。在540 nm測定所形成絡(luò)合物的吸光度，可以對人血清中總蛋白含量進行測定。 葡萄糖在葡萄糖氧化酶(GOD）作用下生成葡萄糖酸和過氧化氫,后者與酚及4-氨基安替吡啉在過氧化物酶(POD) 作用下生成紅色醌類染料化合物，在500 nm 波長處檢測，可測定人血清或血漿中的葡萄糖含量。 H2O2 +

21、4-氨基安替吡啉 + 對氯苯酚 過氧化物酶 醌染料 + H2O,甘油三脂的測定： 甘油三脂 + H2O 脂肪酶 甘油 + 脂肪酸 甘油 + ATP 甘油激酶 甘油-3-磷酸 + ADP 甘油-3-磷酸 + O2 甘油磷酸氧化酶 磷酸二羥丙酮 + H2O2 H2O2 + 4-氨基安替吡啉 + 對氯苯酚 過氧化物酶 醌染料 + H2O 在500 nm 波長處檢測，可測定人血清中的甘油三脂含量,2. 雙波長法,2) 原理,對于1 ：,對于2 ：,選擇合適的1 2 使Ab1=Ab2,1）儀器,A=Aa+Ab,則 A = A1-A2 = Aa1-Aa2 = KC,3）波長組合的選擇,被測組分的A 最大；

22、干擾組分的A = 0,2,Aa1=K1bC,Aa2=K2bC,1,2,3.示差光度法,常規(guī)方法： A（0.150.80）；T（70%15%）,以空白溶液為參比,示差法,以濃度為 Cs 的標(biāo)準(zhǔn)溶液為參比,（ Cs Cx ）,若樣品濃度較大 T15%,*示差法提高準(zhǔn)確度的實質(zhì),常規(guī)法,Tx,落在測量誤差較 大 的范圍,示差法,Tx,Ts,Ts,落在測量誤差較 小 的范圍,結(jié)論：示差法通過提高測量的準(zhǔn)確度提高了方法的準(zhǔn)確度,假設(shè) T=5%,（二）多組分的測定,解聯(lián)立方程，可求得Cx, Cy, 為物質(zhì)的特征參數(shù)，可通過配制標(biāo)準(zhǔn)溶液測得。,1.若各組分吸收曲線不重疊 各自 進行測定,2.若各組分吸收曲線

23、重疊,聯(lián)立方程組,三、 絡(luò)合物的組成的測定,1.摩爾比法（飽和法）,M + nR = MRn,CM, 固定；,CR, 從 0 開始增大,在特定波長測定,M + nR = MRn,保持 CM+ CR = 常數(shù),CM / C 從 0 1連續(xù)改變,在特定波長測定A作圖,n = 1, CM / C =0.5,n = 2, CM / C =0.33,2.等摩爾連續(xù)變化法,四、絡(luò)合物條件穩(wěn)定常數(shù)的測定,A,A A,由于絡(luò)合物離解引起,離解度,MR = R + M,總濃度 C,平衡濃度,C(1-a),Ca,Ca,五.弱酸弱堿離解常數(shù)的測定,HR = H+ + R-,HR,用光度法可以測定其離解常數(shù),R,E

24、= Ee + Ev + Er,帶光譜,一、紫外-可見吸收光譜,二、朗伯-比爾定律 A = KbC,1. 液、氣、固介質(zhì)均適用,2.入射光是單色光，平行光；稀溶液,A = A1 + A2 + + An,C: mol/ L,三、摩爾吸光系數(shù) ( L mol1 cm-1),吸光物質(zhì)結(jié)構(gòu)的特征參數(shù);,提高躍遷幾率 增大截面積,吸光物質(zhì)定量分析的靈敏度參數(shù),吸光度的加合性,吸收曲線 （A-曲線 ）max 1/2,小結(jié),四、導(dǎo)致A-C關(guān)系偏離朗伯比爾定律的原因,1.入射光的單色性不好,*要獲得較寬的線性范圍, 越大，偏離越嚴(yán)重, 適當(dāng)提高入射光的單色性, 在吸收光譜的峰值(max)處進行測定,2. 溶液濃

25、度過高,3. 溶液中發(fā)生了化學(xué)反應(yīng),單色光 稀溶液 顯色劑過量,五、 分析條件的選擇,1. 顯色反應(yīng)條件的選擇,基本要求,1) 選擇性好 顯色劑不與共存組分顯色或顯色但不產(chǎn)生干擾,2) 靈敏度高 MRn max大,3) 精密度高 MRn 穩(wěn)定，組成恒定,4) 顯色反應(yīng)條件易于控制,1.顯色劑的用量,過量 定量,2. 酸度,3. 顯色溫度,4.顯色反應(yīng)時間,5.有機溶劑和表面活性劑,條件的選擇,六、測量條件的選擇（減小測量誤差 ）,1.測量波長,2.吸光度,3.參比液,扣除共存組分、顯色劑及其他無關(guān)的的吸收,1. 工作原理 參比溶液 I0 調(diào) T=100 % A=0 ；試液 I,補償吸收池對光的

26、吸收、反射，溶劑對光的吸收、散射，使I0成為真正只與被測物質(zhì)有關(guān)的I0,2.特點,（一）單波長單光束分光光度計,七、分光光度計,不能進行波長掃描，不能繪制吸收光譜, 精密度不高,(參比溶液和試液不在同一時間測量，光源的波動影響測量結(jié)果), 簡單，廉價，適用于常規(guī)分析,（二）雙光束分光光度計,1.工作原理, 精密度好（ I0 和 I 變化的幅度一致，補償儀器的不穩(wěn)定性）, 可繪制吸收曲線, 儀器復(fù)雜 昂貴,2.特點,I0 和 I 同時（或交替）測量，統(tǒng)計處理。,波長組合的選擇,被測組分的A 最大；干擾組分的A = 0,. （一）單組分的測定,有共存組分物質(zhì)的光譜干擾,（二）多組分的測定,聯(lián)立方程組法,示差光度法,以濃度為 Cs 的標(biāo)準(zhǔn)溶液為參比,雙波長法,. 八、定量分析,校準(zhǔn)曲線法 標(biāo)準(zhǔn)加入法,九、定性分析,（一）化合物鑒定,（二）有機物結(jié)構(gòu)分析,比較未知物和標(biāo)準(zhǔn)物的吸