1、,1,2,3,4,第四章 遺傳多樣性及保護(hù),了解：遺傳多樣性的檢測(cè)方法，我國(guó)的遺傳多樣性研究 理解：遺傳多樣性的定義 掌握：遺傳多樣性的表現(xiàn)形式,5,4.1遺傳多樣性概述,遺傳多樣性是物種多樣性和生態(tài)系統(tǒng)多樣性的前提和條件。,4.1.1遺傳多樣性的概念 遺傳多樣性( Genetic diversity)主要是指種內(nèi)不同群體之間或同一群體內(nèi)不同個(gè)體遺傳變異的總和。 遺傳多樣性最直接的表達(dá)是遺傳變異性的高低及其分布格局。,6,4.1.2遺傳多樣性的表現(xiàn)形式,表型的多態(tài)（形態(tài)、生理、數(shù)量等形狀） (2) 染色體的多態(tài)（染色體的變異） (3) 蛋白質(zhì)的多態(tài)（同功酶Isozyme、等位酶等Alleles

2、） (4) 基因的多態(tài)（復(fù)等位基因）,7,鴿子形態(tài)多樣性,8,表型水平的遺傳多樣性雞冠的形狀,9,16份黃秋葵種質(zhì)的ISSR分析(詳解遺傳多樣性),10,4.1.3遺傳多樣性的研究意義,1群體的遺傳結(jié)構(gòu)可以反映物種的進(jìn)化歷史 2探討物種瀕危機(jī)制，制定科學(xué)合理的保護(hù)策略 3種質(zhì)資源的保存及取樣策略,11,遺傳多樣性的研究意義： 自然種群的遺傳變異的量與種群的數(shù)量是正相關(guān)。 變異個(gè)體的數(shù)量和特定物種種群數(shù)量相關(guān)。 保持物種遺傳穩(wěn)定種群的質(zhì)量，必須在一定的數(shù)量條件下才能實(shí)現(xiàn)，所以保護(hù)物種遺傳變異需要研究種群的數(shù)量特征。,12,4.1.4種群遺傳結(jié)構(gòu),遺傳物質(zhì)在種群水平上的存在格局或特征，包括基因頻率

3、、基因型頻率、交配與繁殖模式、種群遺傳分化、種群間基因交流模式等。,13,1 基因重組 基因重組（gene recombination）是通過(guò)有性過(guò)程基因型形成過(guò)程?；蛑亟M不改變基因本身，但新的組合可導(dǎo)致新的表型。,基因重組與變異多樣性 基因重組可以引起變異的多樣性。,基因,基因重組,基因型,形狀多樣性,4.2遺傳多樣性的來(lái)源,4.2.1遺傳多樣性產(chǎn)生的基礎(chǔ),14,例1: 對(duì)等位基因可能形成的基因型有3種：AA Aa aa 對(duì)等位基因可以產(chǎn)生的基因型有9種（32）： AABB AABb AAbb AaBB AaBb aaBB aaBb Aabb aabb 例2: 根據(jù)等位基因的數(shù)量與基因型數(shù)

4、量的關(guān)系式 Tg = 3N Tg 為基因型的數(shù)量，N為等位基因的數(shù)量 如有10對(duì)等位基因，那么就可得到310 =59049種不同的基因型。其中有210 個(gè)是純合子，其余全是雜合子。,15,染色體數(shù)目變異： 染色體結(jié)構(gòu)變異：,1 染色體畸變 是指染色體發(fā)生數(shù)目和結(jié)構(gòu)上的異常改變。擾亂了遺傳物質(zhì)和基因間相互作用的平衡，使細(xì)胞的遺傳功能受到影響而造成機(jī)體不同程度的損害，是染色體病形成的基礎(chǔ)。造成染色體畸變的因素是多方面的，通?？捎呻婋x輻射、誘變劑等理化因素和病毒等生物因素誘發(fā)產(chǎn)生。,4.2.1遺傳多樣性產(chǎn)生的基礎(chǔ),4.2遺傳多樣性的來(lái)源,16,一、染色體數(shù)目異常,二倍體（diploid）2n，一個(gè)體

5、細(xì)胞中染色體數(shù)為46，XX或46，XY。 整倍體 （euploid）n或 n 的倍數(shù)。23、46、69 非整倍體 （aneuploid） 不是n 或n的倍數(shù)。增加或減少1條或幾條。 三體性 （trisomy）某號(hào)染色體多一個(gè)拷貝，如21三體，47，XX，+21。 單體性 （monosomy） 某號(hào)染色體少一個(gè)拷貝，如Turner綜合征，45，X。,17,二 染色體結(jié)構(gòu)異常類型：,1、缺失 deletion-del 2、重復(fù) duplication-dup 3、倒位 inversion-inv 4、易位 translocation-t 相互易位 羅伯遜易位 Robertsonian transl

6、ocation-rob 5、插入 insersion-ins 6、等臂染色體 isochromosome-iso 7、雙著絲粒染色體dicentric chromosome-dic 8、環(huán)狀染色體 ring chromosome r,18,19,三 基因突變,20,1.小種群效應(yīng) （1）生態(tài)破壞 （2）生境破碎化 （3）大氣污染和氣溫升高等環(huán)境脅迫均會(huì) 減少動(dòng)、植物的種群數(shù)量，形成小種群 形成分隔的遺傳格局 影響遺傳多樣性。 2.生殖方式對(duì)遺傳多樣性有什么影響？ 3.基因流動(dòng)對(duì)遺傳多樣性有什么影響？,4.2.2影響遺傳多樣性的一些重要過(guò)程,21,4.3遺傳多樣性的檢測(cè)方法,4.3.1 形態(tài)學(xué)標(biāo)

7、記（morphological marker） 4.3.2 細(xì)胞學(xué)標(biāo)記(cytological marker) 4.3.3 生化標(biāo)記(biochemical marker) 4.3.4 分子標(biāo)記(molecular marker)：DNA分子遺傳標(biāo)記，或DNA標(biāo)記,22,即植物的外部形態(tài)特征。主要包括肉眼可見(jiàn)的外部特征，如：矮稈、紫鞘、卷葉等；也包括色素、生理特性、生殖特性、抗病蟲(chóng)性等有關(guān)的一些特性。 優(yōu)點(diǎn)：形態(tài)標(biāo)記簡(jiǎn)單直觀、經(jīng)濟(jì)方便； 缺點(diǎn):(1)數(shù)量在多數(shù)植物中是很有限的;(2)且多態(tài)性較差，表現(xiàn)易受環(huán)境影響，(3)有一些標(biāo)記與不良性狀連鎖。(4)形態(tài)標(biāo)記的獲得需要通過(guò)誘變、分離純合的過(guò)程

8、，周期較長(zhǎng)。因此形態(tài)標(biāo)記在作物遺傳育種中的作用是有限的。,形態(tài)標(biāo)記,23,即植物細(xì)胞染色體的變異：包括染色體核型（染色體數(shù)目、結(jié)構(gòu)、隨體有無(wú)、著絲粒位置等）和帶型（C帶、N帶、G帶等）的變化。 與形態(tài)標(biāo)記相比，細(xì)胞學(xué)標(biāo)記的優(yōu)點(diǎn)是能進(jìn)行一些重要基因的染色體或染色體區(qū)域定位。但細(xì)胞學(xué)標(biāo)記材料需要花費(fèi)較大的人力和較長(zhǎng)時(shí)間來(lái)培育，難度很大；同時(shí)某些物種對(duì)染色體變異反應(yīng)敏感；還有些變異難以用細(xì)胞學(xué)方法進(jìn)行檢測(cè)。因此到目前為止，真正應(yīng)用于作物遺傳育種研究中的細(xì)胞學(xué)標(biāo)記還很少。,細(xì)胞學(xué)標(biāo)記,24,主要包括同工酶和等位酶標(biāo)記。同工酶是：指結(jié)構(gòu)不同、功能相似的酶，也即具有同一底物專一性的不同分子形式的酶。屬于一

9、個(gè)以上基因座位編碼的酶的不同形式；而等位酶是指由一個(gè)基因座位的不同等位基因編碼的酶的不同分子形式。分析方法是從植物組織的蛋白粗提物中通過(guò)電泳和組織化學(xué)染色法將酶的多種形式轉(zhuǎn)變成肉眼可辯的酶譜帶型。,生化標(biāo)記,25,與形態(tài)標(biāo)記、細(xì)胞學(xué)標(biāo)記相比，生化標(biāo)記具兩個(gè)方面的優(yōu)點(diǎn)：一是表現(xiàn)近中性，對(duì)植物經(jīng)濟(jì)性狀一般沒(méi)有大的不良影響；二是直接反映了基因產(chǎn)物差異，受環(huán)境影響較小。但目前可使用的生化標(biāo)記數(shù)量還相當(dāng)有限，且有些酶的染色方法和電泳技術(shù)有一定難度，因此其實(shí)際應(yīng)用受到一定限制。,26,目前的分子標(biāo)記類型,第一類是以分子雜交為核心的分子標(biāo)記技術(shù)，包括RFLP、DNA指紋技術(shù)（DNA Fingerprinti

10、ng）等； 第二類是以PCR為核心的分子標(biāo)記技術(shù)，包括RAPD、簡(jiǎn)單序列重復(fù)標(biāo)記SSR、序標(biāo)位STS、序列特征化擴(kuò)增區(qū)域SCAR等； 第三類是一些新型的分子標(biāo)記，如：SNP標(biāo)記、表達(dá)序列標(biāo)簽EST標(biāo)記等。,27,幾種主要的分子標(biāo)記,28,分子標(biāo)記的特點(diǎn)： （1）直接以DNA的形式表現(xiàn)，表現(xiàn)穩(wěn)定 （2）數(shù)量多 （3）多態(tài)性高 （4）表現(xiàn)為中性，不影響目標(biāo)性狀的表達(dá)； （5）許多標(biāo)記表現(xiàn)為共顯性的特點(diǎn)，能區(qū)別純合體和雜合體。 （6）成本不太高,29,1.RFLP標(biāo)記,(1)原理 植物基因組DNA上的堿基替換、插入、缺失或重復(fù)等，造成某種限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)的增加或喪失，從而產(chǎn)生限制性片斷長(zhǎng)度多態(tài)性

11、。,RFLP 是根據(jù)不同品種（個(gè)體）基因組的限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)堿基發(fā)生突變，或酶切位點(diǎn)之間發(fā)生了堿基的插入、缺失，導(dǎo)致酶切片段大小發(fā)生了變化，這種變化可以通過(guò)特定探針雜交進(jìn)行檢測(cè)，從而可比較不同品種（個(gè)體）的DNA 水平的差異（即多態(tài)性），多個(gè)探針的比較可以確立生物的進(jìn)化和分類關(guān)系。,30,基 本 步 驟,用DNA限制性內(nèi)切酶消化,Southern雜交,放射性自顯影或酶學(xué)檢測(cè),DNA提取,凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)移到濾膜上,（2）RFLP實(shí)驗(yàn)流程,31,（3）特點(diǎn) A 無(wú)表型效應(yīng)，RFLP標(biāo)記的檢測(cè)不受環(huán)境條件和發(fā)育階段的影響。 B RFLP標(biāo)記在等位基因之間是共顯性的，因此在配制雜交組合時(shí)不受雜

12、交方式的影響。 C 在非等位的RFLP標(biāo)記之間不存在上位效應(yīng)，因而互不干擾。 D RFLP標(biāo)記起源于基因組DNA的自身變異，在數(shù)量上幾乎不受限制 E DNA需要量大，檢測(cè)技術(shù)繁雜，難以用于大規(guī)模的育種實(shí)踐中。在植物分子標(biāo)記輔助育種中需要將RFLP轉(zhuǎn)換成以PCR為基礎(chǔ)的標(biāo)記。,32,PCR-based markers,PCR: polymerase chain reaction（多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)） amplification of tracts of DNA defined by border sequences that hybridize to selected DNA polymerase

13、primers,Requires: - target DNA - thermostable DNA polymerase (Taq) - oligonucleotide primer(s) (7-30nt) - dNTPs + Mg+,33,2.RAPD標(biāo)記,RAPD（Random Amplified Polymorphic DNA），即隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA技術(shù)，是由美國(guó)科學(xué)家Wiliams和Welsh于1990年分別研究提出的，又稱任意引物PCR。它的應(yīng)用是基于這樣的一個(gè)推理：對(duì)于同一模板DNA，用同一引物擴(kuò)增既可能得到相同的帶譜（模板基因組間可能具有同源性），也可能得到不同的帶譜。僅在某一

14、特定模板中出現(xiàn)的條帶就可作為該模板的分子標(biāo)記。事實(shí)上，不同基因組DNA總是一定差異的，所以用RAPD就可以進(jìn)行分子標(biāo)記研究。理論上講，在一定的擴(kuò)增條件下，擴(kuò)增的條帶數(shù)取決于基因組的復(fù)雜性。對(duì)特定的引物，復(fù)雜性越高的基因組所產(chǎn)生的擴(kuò)增條帶數(shù)也越多。,運(yùn)用隨機(jī)引物擴(kuò)增尋找多態(tài)性DNA 片段可作為分子標(biāo)記。這種方法即為RAPD(Random amplified polymorphic DNA ，隨機(jī)擴(kuò)增的多態(tài)性DNA)。盡管RAPD 技術(shù)誕生的時(shí)間很短, 但由于其獨(dú)特的檢測(cè)DNA 多態(tài)性的方式以及快速、簡(jiǎn)便的特點(diǎn),使這個(gè)技術(shù)已滲透于基因組研究的各個(gè)方面。,1.RAPD標(biāo)記原理,34,RAPD標(biāo)記的主

15、要特點(diǎn)有： （1）不需DNA探針，設(shè)計(jì)引物也無(wú)須知道序列信息； （2）顯性遺傳（極少數(shù)共顯性），不能鑒別雜合子和純合子； （3）技術(shù)簡(jiǎn)便，不涉及分子雜交和放射性自顯影等技術(shù)； （4）DNA樣品需要量少，引物價(jià)格便宜，成本較低； （5）實(shí)驗(yàn)重復(fù)性較差，結(jié)果可靠性較低。,35,3.ISSR標(biāo)記(簡(jiǎn)單序列重復(fù)),ISSR（inter-simple sequence repeat）標(biāo)記是一種類似RAPD，但利用包含重復(fù)序列并在3或5錨定的單寡聚核酸引物對(duì)基因組進(jìn)行擴(kuò)增的標(biāo)記系統(tǒng)，即用SSR引物來(lái)擴(kuò)增重復(fù)序列之間的區(qū)域。 其原理具體是，ISSR標(biāo)記根據(jù)生物廣泛存在SSR的特點(diǎn)，利用在生物基因組常出現(xiàn)的S

16、SR本身設(shè)計(jì)引物，無(wú)需預(yù)先克隆和測(cè)序。用于擴(kuò)增的引物一般為16-18個(gè)堿基序列，由1-4個(gè)堿基組成的串聯(lián)重復(fù)和幾個(gè)非重復(fù)的錨定堿基組成，從而保證了引物與基因組DNA中SSR的5或3末端結(jié)合，導(dǎo)致位于反向排列、間隔不太大的重復(fù)序列間的基因組節(jié)段進(jìn)行PCR擴(kuò)增。,36,凝膠自動(dòng)成像,凝膠電泳,樣品采集,DNA的提取,PCR反應(yīng)體系建立,ISSRPCR擴(kuò)增,ISSR引物篩選,DNA質(zhì)量檢測(cè),數(shù)據(jù)分析,ISSR的操作流程簡(jiǎn)圖：,37,4.SSR標(biāo)記（簡(jiǎn)單序列重復(fù)）,SSR簡(jiǎn)單序列重復(fù)標(biāo)記（Simple sequence repeat, 簡(jiǎn)稱SSR標(biāo)記），也叫微衛(wèi)星序列重復(fù)，是由一類由幾個(gè)核苷酸（15個(gè)

17、）為重復(fù)單位組成的長(zhǎng)達(dá)幾十個(gè)核苷酸的重復(fù)序列，長(zhǎng)度較短，廣泛分布在染色體上。由于重復(fù)單位的次數(shù)的不同或重復(fù)程度的不完全相同，造成了SSR長(zhǎng)度的高度變異性，由此而產(chǎn)生SSR標(biāo)記或SSLP標(biāo)記。雖然SSR在基因組上的位置不盡相同，但是其兩端序列多是保守的單拷貝序列，因此可以用微衛(wèi)星區(qū)域特定順序設(shè)計(jì)成對(duì)引物，通過(guò)PCR技術(shù)，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳，即可顯示SSR位點(diǎn)在不同個(gè)體間的多態(tài)性。,38,優(yōu)點(diǎn)： （1）標(biāo)記數(shù)量豐富，具有較多的等位變異，廣泛分布于各條染色體上； （2）是共顯性標(biāo)記，呈孟德?tīng)栠z傳； （3）技術(shù)重復(fù)性好，易于操作，結(jié)果可靠。 缺點(diǎn)： 開(kāi)發(fā)此類標(biāo)記需要預(yù)先得知標(biāo)記兩端的序列信息，而且引

18、物合成費(fèi)用較高。,4.SSR標(biāo)記（簡(jiǎn)單序列重復(fù)）,39,5 AFLP,基本原理是：以PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))為基礎(chǔ)，結(jié)合了RFLP、RAPD的分子標(biāo)記技術(shù)。把DNA進(jìn)行限制性內(nèi)切酶酶切，然后選擇特定的片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增(在所有的限制性片段兩端加上帶有特定序列的“接頭”，用與接頭互補(bǔ)的但3-端有幾個(gè)隨機(jī)選擇的核苷酸的引物進(jìn)行特異PCR擴(kuò)增，只有那些與3-端嚴(yán)格配對(duì)的片段才能得到擴(kuò)增)，再在有高分辨力的測(cè)序膠上分開(kāi)這些擴(kuò)增產(chǎn)物，用放射性法、熒光法或銀染染色法均可檢測(cè)之。,40,5.AFLP標(biāo)記的主要特點(diǎn)有： （1）由于AFLP分析可以采用的限制性內(nèi)切酶及選擇性堿基種類、數(shù)目很多，所以該技術(shù)所產(chǎn)生的

19、標(biāo)記數(shù)目是無(wú)限多的； （2）典型的AFLP分析，每次反應(yīng)產(chǎn)物的譜帶在50-100條之間，所以一次分析可以同時(shí)檢測(cè)到多個(gè)座位，且多態(tài)性極高； （3）表現(xiàn)共顯性，呈典型孟德?tīng)柺竭z傳； （4）分辯率高，結(jié)果可靠； （5）目前該技術(shù)受專利保護(hù)，用于分析的試劑盒昂貴，實(shí)驗(yàn)條件要求較高。但也存在假陽(yáng)性帶出現(xiàn)頻繁、技術(shù)復(fù)雜、成本高等缺點(diǎn)。,41,第一代測(cè)序技術(shù)是雙脫氧鏈末端終止法根據(jù)核苷酸在某一固定的點(diǎn)開(kāi)始，隨機(jī)在某一個(gè)特定的堿基處終止，產(chǎn)生A，T，C，G四組不同長(zhǎng)度的一系列核苷酸，然后在尿素變性的PAGE膠上電泳進(jìn)行檢測(cè)，從而獲得DNA序列。 第二代測(cè)序技術(shù)是焦磷酸測(cè)序法由4種酶催化的同一反應(yīng)體系中的酶級(jí)聯(lián)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，適于對(duì)已知的短序列的測(cè)序分析。 第三代測(cè)序技術(shù)則是基于納米孔的單分子讀取技術(shù)，這種方法讀取數(shù)據(jù)更快、有望大大降低測(cè)序成本，改變個(gè)人醫(yī)療的前景。這一技術(shù)的研發(fā)是系統(tǒng)工程，涉及生物、半導(dǎo)體、計(jì)算機(jī)、化學(xué)、光學(xué)等多個(gè)領(lǐng)域，需要不同學(xué)科頂尖力量的合作。,6. DNA序列分析,DNA測(cè)序是檢測(cè)遺傳多樣性最徹底的方法。,42,6. DNA序列分析目前發(fā)