1、第十二章 分子發(fā)光分析法,12.2 熒光和磷光分析基本原理,12.3 熒光和磷光分析儀,12.1 分子發(fā)光分析概述,12.4 熒光和磷光分析法的特點和應用,12.5 化學發(fā)光分析,本章學習要求,12.1 分子發(fā)光分析概述,物質分子吸收能量躍遷到電子激發(fā)態(tài)后，在返回基態(tài)的過程中伴隨有光輻射，這種現(xiàn)象稱為分子發(fā)光，以此建立起來的分析方法稱為分子發(fā)光分析法。,一、熒光和磷光的產生,分子能級與躍遷 基態(tài)(S0)激發(fā)態(tài)(S1、S2、激發(fā)態(tài)振動能級)：吸收特定頻率的輻射；是量子化的；躍遷一次到位； 激發(fā)態(tài)基態(tài)：多種途徑和方式(見圖12-1)；速度最快、激發(fā)態(tài)壽命最短的途徑占優(yōu)勢； 第一、第二、電子激發(fā)單重

2、態(tài) S1 、S2 ； 第一、第二、電子激發(fā)三重態(tài) T1 、 T2 ；,12.2 熒光和磷光分析基本原理,2.電子激發(fā)態(tài)的多重度,電子激發(fā)態(tài)的多重態(tài)：M=2S+1 S為電子自旋量子數(shù)的代數(shù)和(0或1)； 大多數(shù)有機分子的基態(tài)處于單重態(tài)；,S0T1 為禁阻躍遷；必須通過其他途徑進入，進入的幾率??；,根據(jù)洪特規(guī)則，平行自旋比成對自旋穩(wěn)定；而三重態(tài)能級比相應單重態(tài)能級低，所以平均壽命長。,3.激發(fā)態(tài)基態(tài)的能量傳遞途徑,電子從激發(fā)態(tài)返回基態(tài)時，通過輻射躍遷(發(fā)光)和無輻射躍遷等方式失去能量：,熒光：10-710 -9 s,第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動能級基態(tài)； 磷光：10-410s；第一激發(fā)三重態(tài)的最低振動

3、能級基態(tài)；,非輻射能量傳遞過程,振動弛豫：同一電子能級內以熱能量交換形式由高振動能級至低相鄰振動能級間的躍遷。發(fā)生振動弛豫的時間10 -12 s。 內轉移：同多重度電子能級中,等能級間的無輻射能級交換。 通過內轉換和振動弛豫，高激發(fā)單重態(tài)的電子躍回第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動能級。 外轉移：激發(fā)分子與溶劑或其他分子之間產生相互作用而轉移能量的非輻射躍遷； 外轉移使熒光或磷光減弱或“猝滅”。 系間竄躍：不同多重態(tài),有重疊的轉動能級間的非輻射躍遷。 改變電子自旋，禁阻躍遷，通過自旋軌道耦合進行。,輻射能量傳遞過程,熒光發(fā)射：電子由第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動能級基態(tài)（ 多為 S1 S0躍遷），發(fā)射波長為

4、2的熒光； 10-710 -9 s 。 磷光發(fā)射： 電子由第一激發(fā)三重態(tài)的最低振動能級基態(tài)（ T1 S0躍遷）； 電子由S0進入T1的過程：（ S0 T1禁阻躍遷） S0 激發(fā)振動弛豫內轉移系間跨越振動弛豫 T1 發(fā)光速度很慢： 10-410 s 。 光照停止后，可持續(xù)一段時間。,二、激發(fā)光譜和發(fā)射光譜,1.熒光(磷光)的激發(fā)光譜曲線 固定待觀測的發(fā)射波長(一般選最大發(fā)射波長),改變激發(fā)光波長，根據(jù)化合物發(fā)射的熒光(磷光)強度與激發(fā)光波長的關系得激發(fā)光譜曲線 。,激發(fā)光譜曲線的最高處，處于激發(fā)態(tài)的分子最多，熒光強度最大；,2.熒光發(fā)射光譜(或磷光光譜),固定激發(fā)光波長(選最大激發(fā)波長),掃描發(fā)

5、射光波長，根據(jù)化合物發(fā)射的熒光(或磷光)強度與發(fā)射光波長關系得到的曲線(圖中曲線II或III)。,3.激發(fā)光譜與發(fā)射光譜的關系,a.Stokes位移 激發(fā)光譜與發(fā)射光譜之間的波長差值。 發(fā)射光譜的波長比激發(fā)光譜的長，是振動弛豫消耗了能量。 b.發(fā)射光譜的形狀與激發(fā)波長無關 電子躍遷到不同激發(fā)態(tài)能級，吸收不同波長的能量(如能級圖 2 , 1)，產生不同吸收帶，但均回到第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動能級再躍遷回到基態(tài)的各振動能級，產生波長一定的熒光(如2 )。 c. 鏡像規(guī)則 通常熒光發(fā)射光譜與它的吸收光譜成鏡像對稱關系。,200,250,300,350,400,450,500,熒光激發(fā)光譜,熒光發(fā)射光

6、譜,nm,蒽的激發(fā)光譜和熒光光譜,4.熒光效率,熒光效率（）：,分子產生熒光必須具備的條件： （1）具有合適的結構； （2）具有一定的熒光效率（熒光量子產率）。,1。 熒光量子產率與激發(fā)態(tài)能量釋放各過程的速率常數(shù)有關。如果外轉換過程速度快，不出現(xiàn)熒光發(fā)射；,5.熒光與分子結構的關系,（1）躍遷類型：* 的熒光效率高，系間跨越過程的速率常數(shù)小，有利于熒光的產生； （2）共軛效應：提高共軛度有利于增加熒光效率并產生紅移。,（3）剛性平面結構：可降低分子振動，減少與溶劑的相互作用，故具有很強的熒光。如熒光素和酚酞有相似結構，熒光素有很強的熒光，酚酞卻沒有。 （4）取代基效應：芳環(huán)上的不同取代基對該化

7、合物的熒光強度和熒光光譜有很大影響。給電子基團使熒光增強；吸電子基團使熒光減弱甚至猝滅。參看P349表12-1。,5.熒光定量分析原理,(1)熒光定量關系式 熒光強度 If正比于吸收的光量Ia和熒光量子效率 ： If Ia 由比耳定律： Ia I0-It I0 (1-10- b c ) If I0(1-10- b c ) I0(1-e-2.3 bc ) 濃度很低時，將括號項近似處理后：（參看P.349） If 2.3 I0 b c Kc 熒光定量關系式,（2）定量方法,標準曲線法： 配制一系列標準濃度試樣測定熒光強度，繪制標準曲線，再在相同條件下測量未知試樣的熒光強度，在標準曲線上求出濃度。

8、比較法： 在線性范圍內，測定標樣和試樣的熒光強度，比較。,（3）影響熒光強度的因素,1）溶劑的影響 除一般溶劑效應外，溶劑的極性、氫鍵、配位鍵的形成都將使化合物的熒光發(fā)生變化。 2）溫度的影響 熒光強度對溫度變化敏感，溫度增加，外轉換去活的幾率增加。 3）溶液pH的影響 對酸堿化合物，溶液pH的影響較大，需要嚴格控制。,4）各種散射光的影響,5）激發(fā)光照射的影響,由溶劑產生的散射光（瑞利或拉曼散射）有可能產生較嚴重的干擾。 消除方法：通過選擇合適的激發(fā)波長來消除。,有些熒光物質會發(fā)生光分解，使熒光強度降低。 消除方法：采用低強度激發(fā)光、縮短測定時間。,6）熒光猝滅,熒光物質與溶劑分子或其它溶質

9、分子相互作用，引起熒光強度下降或消失的現(xiàn)象稱為熒光猝滅。 碰撞猝滅：M+ Q(熄滅劑) M + Q + 熱（熄滅） 或M+ Q(熄滅劑) M + Q 氧的熄滅作用：溶液中溶解氧分子可加速系間竄躍。 自熄滅和自吸收：熒光物質濃度大時產生。 自熄滅激發(fā)態(tài)之間碰撞引起能量損失形成。 自吸收當熒光光譜與吸收光譜重疊時，熒光被溶液中基態(tài)分子吸收。,7）內濾光作用,溶液中含有能吸收激發(fā)光或熒光物質發(fā)射的熒光，如色胺酸中的重鉻酸鉀等。,6.熒光定性分析,根據(jù)熒光物質的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜可以鑒別化合物。,常用比較法： 在相同的分析條件下，將待測物的熒光發(fā)射光譜與預期化合物的熒光光譜比較，若特征峰波長及形態(tài)一致

10、，則可能為該物質。也可采用預期化合物的激發(fā)光譜進行比較亦可。若使用兩者結合，則結果可信度大大提高。 參看P.351圖12-3,12.3熒光和磷光的分析儀器,四部分組成：激發(fā)光源、試樣池、雙單色器系統(tǒng)、檢測器。 特殊點：有兩個單色器，光源與檢測器通常成直角。,基本流程如圖： 光源：高壓汞燈，染料激光器(可見與紫外區(qū))。 單色器：選擇激發(fā)光波長的第一單色器和選擇發(fā)射光(測量)波長的第二單色器； 檢測器：光電倍增管。,同步掃描技術,同步掃描技術可簡化光譜，譜帶變窄，減少光譜重疊，提高分辨率。 合適的可減少光譜重疊； 酪氨酸和色氨酸的熒光激發(fā)光譜相似，發(fā)射光譜嚴重重疊，但60nm時，只顯示色氨酸的特征

11、光譜，實現(xiàn)分別測定。,磷光檢測,熒光計上配上磷光測量附件即可對磷光進行測量。在有熒光發(fā)射的同時測量磷光。,測量方法： （1）通常借助于熒光和磷光壽命的差別，采用磷光鏡的裝置將熒光隔開。 （2）采用脈沖光源和可控檢測及時間分辨技術。 室溫測量時，不需要杜瓦瓶。,12.4熒光和磷光分析法的特點與應用,1. 特點 （1）靈敏度高 比紫外-可見分光光度法高24個數(shù)量級； （2）選擇性強 既可依據(jù)特征發(fā)射光譜，又可根據(jù)特征吸收光譜； （3）試樣量少 缺點：應用范圍小。,2.熒光分析法的應用,1)無機化合物的分析 與有機試劑配合物后測量；可測量約60多種元素。 2)生物與有機化合物的分析 見下表,2007

12、-11-8,主要用于痕量物質分析，也可用于分子結構性能測定。,三、磷光分析法的應用,1.稠環(huán)芳烴分析 采取固體表面室溫磷光分析法快速靈敏測定稠環(huán)芳烴和雜環(huán)化合物（致癌物質）；見下表 2.農藥、生物堿、植物生長激素的分析 煙堿、降煙堿、新煙堿，2，4-D等分析 檢測限0.01 g/cm-3 3.藥物分析和臨床分析 見下表,2007-11-8,12.5化學發(fā)光分析,化學發(fā)光機理： 一些物質在進行化學時，吸收了的化學能，使產物分子激發(fā)至激發(fā)態(tài)，返回基態(tài)時發(fā)射出光子。,能產生化學發(fā)光的反應的基本要求： 化學反應能提供足夠的能量； 吸收化學能后的分子必須能釋放出光子或轉移給另一分子放出光子。,1. 化學

13、發(fā)光反應,在化學反應過程中，某些化合物接受能量而被激發(fā)，從激發(fā)態(tài)返回基態(tài)時，發(fā)射出一定波長的光。 A +B = C + D* D* D + h （1）能夠發(fā)光的化合物大多為有機化合物，芳香族化合物； （2）化學發(fā)光反應多為氧化還原反應，激發(fā)能與反應能相當 E=170300 kJ/mol；位于可見光區(qū)； （3）發(fā)光持續(xù)時間較長，反應持續(xù)進行； 化學發(fā)光反應存在于生物體(螢火蟲、海洋發(fā)光生物)中，稱生物發(fā)光。,2.化學發(fā)光強度與化學發(fā)光分析的依據(jù),定量依據(jù)： （1）在一定條件下，峰值光強度與被測物濃度成線性；,（2）在一定條件下，曲線下面積為發(fā)光總強度(S)，其與被測物濃度成線性：,3.化學發(fā)光反

14、應的類型,（1）氣相化學發(fā)光反應 a. 一氧化氮與O3的發(fā)光反應 NO + O3 NO2* NO2* NO2 + h 發(fā)射的光譜范圍：600875nm，靈敏度1ng/cm-3； b.氧原子與SO2、NO、CO的發(fā)光反應 氧原子與SO2的發(fā)光反應： O3 O2 + O （1000 C石英管中進行） SO2 + O + O SO2* + O2 SO2 * SO2* + h 最大發(fā)射波長：200nm；靈敏度1ng/cm-3；,O3 O2 + O （1000 C石英管中進行） NO + O NO2* NO2 * NO2 + h 發(fā)射光譜范圍：4001400nm；靈敏度1ng/cm-3； 氧原子與CO的

15、發(fā)光反應： CO + O CO2* CO2 * CO2 + h 發(fā)射光譜范圍：300500nm；靈敏度1ng/cm-3；,氧原子與NO的發(fā)光反應：,c. 乙烯與O3的發(fā)光反應,乙烯與O3反應，生成激發(fā)態(tài)乙醛：,CH2O* CH2O + h 最大發(fā)射波長：435nm；對O3的特效反應；線性響應范圍1 ng/cm-3 1g/cm-3；,（2）火焰中的化學發(fā)光反應,在富氫火焰中，也存在著很強的化學發(fā)光反應； a. 一氧化氮 NO + H HNO* HNO * HNO + h 發(fā)射光譜范圍：660770nm； 最大發(fā)射波長：690nm； 在富氫火焰中： NO2 + 2H NO + H2O 該反應十分迅速；,b.硫化物,揮發(fā)性硫化物SO2 、H2S 、CH3SH、 CH3SCH3等在富氫火焰中燃燒，產生很強的化學發(fā)光（藍色）： SO2 + 2H2 S + 2H2O S + S 2S2 * S2 * S2 + h 發(fā)射光譜范圍：350460nm； 最大發(fā)射波長：394nm