1、PCR原理和基本操作過程,2015.12.5,臨床146生化實驗小組,第一節(jié) PCR技術(shù)原理,聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reation,PCR)是一種DNA體外核酸擴增技術(shù)。該技術(shù)能在短時間內(nèi)將極微量的目的基因或某DNA片段擴增至十萬乃至百萬倍，從極微量的標(biāo)本中擴增出足量的DNA供分析研究和檢測鑒定。PCR技術(shù)具有特異、敏感、產(chǎn)率高、快速、簡便、重復(fù)性好、易自動化等突出優(yōu)點。 PCR基本原理 PCR基本反應(yīng)步驟,一、PCR的原理,PCR技術(shù)是一種在體外模擬DNA的復(fù)制過程的核酸擴增技術(shù)。其原理是根據(jù)DNA的半保留復(fù)制，以及DNA分子在體外不同的溫度下雙鏈和單鏈可相互轉(zhuǎn)變

2、的機制，在體外人為地控制反應(yīng)系統(tǒng)的溫度，使雙鏈DNA變性，成為單鏈DNA；其次，單鏈DNA與人工引物鏈在退火過程中配對結(jié)合；最后，在DNA聚合酶的催化作用下，使引物沿單鏈模板延伸為雙鏈DNA，實現(xiàn)DNA的擴增。PCR三個基本反應(yīng)步驟構(gòu)成，即變性、退火、引物延伸。,二、三個基本步驟,變性(denaturation)-高溫下將模板DNA雙鏈打開 退火(annealing)-引物在較低溫度下以共價鍵結(jié)合到模板DNA互補部位 延伸(extension)-TaqDNA聚合酶作用下，不斷向引物3端添加DNTP，DNA鏈不斷延伸,反應(yīng)液中含有所有成分，以溫度變化來控制反應(yīng)階段： 變性95度，退火55度，延伸

3、72度。,重復(fù)13步 2530輪,目的DNA片段 擴增100萬倍以上,DNA雙螺旋,DNA單鏈 與引物復(fù)性,DNA變性 形成2條單鏈,子鏈延伸 DNA加倍,PCR的基本原理,PCR反應(yīng)條件 PCR過程 PCR的特點,模板DNA,變 性,第一輪擴增,PCR的基本原理,PCR反應(yīng)條件 PCR過程 PCR的特點,引物1,引物2,退 火,PCR的基本原理,PCR反應(yīng)條件 PCR過程 PCR的特點,引物1,引物2,Taq酶,Taq酶,延 伸,PCR的基本原理,PCR反應(yīng)條件 PCR過程 PCR的特點,第1輪結(jié)束,第2輪開始,PCR的基本原理,PCR反應(yīng)條件 PCR過程 PCR的特點,Taq,Taq,Ta

4、q,Taq,PCR的基本原理,PCR反應(yīng)條件 PCR過程 PCR的特點,第2輪結(jié)束,PCR的基本原理,PCR反應(yīng)條件 PCR過程 PCR的特點,模板DNA,第1輪擴增,第2輪擴增,第3輪擴增,第4輪擴增,第5輪擴增,第6輪擴增,PCR的特點,PCR 的特點,第二節(jié)PCR的實驗步驟,標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)體系,10X 擴增緩沖液： 5l 模板DNA: 0.12g 引物： 各0.21mol/L 4種dNTP: 各200mol/L Mg2+: 1.5mmol/L Taq DNA聚合酶： 2.5U ddH2O 補齊 總體積： 50l,可以按照比例放大或者縮小體系，不同的PCR反應(yīng)需要優(yōu)化 按照實驗方案進行即

5、可,1.加樣 將上述總體積為50l的反應(yīng)體系加入一無菌0.5ml離心管中 2離心 將加入的反應(yīng)物混合均勻后稍離心，加入一滴礦物油覆蓋于反應(yīng)混合物上 3擴增 在PCR儀上設(shè)置PCR反應(yīng)參數(shù)（具體數(shù)據(jù)根據(jù)引物和擴增片段的大小而定）：94下加熱4分鐘左右；依次94變性1分鐘，45退火1分鐘，72延伸2分鐘，循環(huán)32次左右；72下保溫7分鐘，使反應(yīng)產(chǎn)物擴增充分 4PCR擴增產(chǎn)物分析 PCR產(chǎn)物是否為特異性擴增，其結(jié)果是否可靠，必須對其進行嚴(yán)格的分析與鑒定，才能得出正確的結(jié)論。產(chǎn)物的分析，可依據(jù)研究對象和目的不同而采用不同的分析方法,PCR循環(huán)參數(shù),（熱力學(xué)參數(shù)）,94 ，3min；94 ，45s；58 ，1min； 循環(huán)30次72 ，1min；72 ，10min；16 保溫,94 預(yù)變性，3min使DNA雙鏈完全打開,退火： 58，1min 溫度由引物長度和GC含量決定。 增加溫度能減少引物與模板的非特異性結(jié)合，降低溫度可增加