1、,第十節(jié),蛋白質(zhì) 的分離與純化,一、 引言 二、 蛋白質(zhì)（酶）分離純化的前處理 三、蛋白質(zhì)（酶）分離與純化 四、層析技術(shù) 五、電泳技術(shù) 六、離心技術(shù),一、 引言,蛋白質(zhì)（酶）存在于一切生物體中，是非常重要的生物大分子。蛋白質(zhì)是生物功能的執(zhí)行者，擔(dān)負(fù)著生物催化、物質(zhì)運輸、運動、防御、調(diào)控及記憶、識別等多種生理功能。,（一）分離純化的意義,從生物材料中分離制備蛋白質(zhì)、核酸，研究其結(jié)構(gòu)與功能，對于了解生命活動的規(guī)律，闡明生命現(xiàn)象的本質(zhì)有重大意義。 工業(yè)生產(chǎn)的需要：食品、發(fā)酵、紡織、制革等工業(yè)，需要大量的高活性的酶制劑。如用淀粉酶制造葡萄糖、麥芽糖、糊精以及糖漿等。 醫(yī)療的需要：如用豬胰島素治療糖尿病

2、。 基因工程的需要,（二）分離純化的要求,1、純度：主要取決于研究的目的和應(yīng)用上的要求。如作為研究一級結(jié)構(gòu)、空間結(jié)構(gòu)，一級結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系的蛋白質(zhì)制劑、工具酶和標(biāo)準(zhǔn)蛋白、酶法分析的酶制劑，都要求均一；工業(yè)、醫(yī)藥方面應(yīng)用的酶和蛋白質(zhì)制劑，達到一定純度即可，不要求均一。 2、活性：要求大分子保持天然構(gòu)象狀態(tài)，有高度的生物活性。 3、收率：希望收率越高越好，但在分離純化過程中總有不少損失。而且提純步驟越多，損失越大。,（三）分離純化的一般程序,生物大分子的分離純化一般可分為以下幾個階段： 材料的選擇和預(yù)處理 破碎細胞及提?。ㄓ袝r還需要進行細胞器的分離） 分離純化：包括粗分級分離和細分級分離 其中前兩

3、個階段為生物大分子分離純化的前處理。,選擇材料,破碎細胞,提取,分離純化,分析及鑒定,二、 蛋白質(zhì)（酶） 分離純化的前處理,（一）材料的選擇與預(yù)處理 選擇材料主要根據(jù)實驗?zāi)康亩?。工業(yè)生產(chǎn)上注意選擇含量高、來源豐富、易獲得、制備工藝簡單、成本低的動植物組織或微生物做原料?？蒲羞x材則無需考慮上述問題，只要能達到實驗?zāi)康募纯伞?實驗材料選定后，常常需要進行預(yù)處理，如動物材料需要除去一些與實驗無關(guān)的結(jié)締組織、脂肪組織；植物種子需要除殼；微生物需要將菌體與發(fā)酵液分開。另外，必須盡可能保持材料的新鮮，盡快加工處理。若不立即進行實驗或加工，應(yīng)冷凍保存。,（二）細胞的破碎,分離提取某一生物大分子，首先要求生

4、物大分子從原來的組織或細胞中以溶解的狀態(tài)釋放出來，并保持原來的天然狀態(tài)，不丟生物活性。因此應(yīng)選擇適當(dāng)?shù)姆椒▽⒔M織和細胞破碎。但若材料是體液（如血）或生物體分泌到體外的分泌物，則不必進行組織細胞的破碎。 組織細胞的破碎方法很多，不同的實驗規(guī)模，不同的實驗材料和實驗要求，使用的破碎方法和條件也不同。,1. 機械法： 1) 研磨：將剪碎的動物組織置于研缽或勻漿器中，加入少量石英砂研磨或勻漿。 2) 組織搗碎器：這是一種較劇烈的破碎細胞的方法，通常可先用家用食品加工機將組織打碎，然后再用10000r/min20000r/min的內(nèi)刀式組織搗碎機(即高速分散器)將組織的細胞打碎。,2.物理法： 1) 反

5、復(fù)凍融法：將待破碎的細胞冷至15到20，然后放于室溫(或40)迅速融化，如此反復(fù)凍融多次，由于細胞內(nèi)形成冰粒使剩余胞液的鹽濃度增高而引起細胞溶脹破碎。 2) 超聲波處理法：此法是借助超聲波的振動力破碎細胞壁和細胞器。破碎微生物細菌和酵母菌時，時間要長一些。 3) 壓榨法：這是一種溫和的、徹底破碎細胞的方法。在1000105Pa2000105Pa 的高壓下使細胞懸液通過一個小孔突然釋放至常壓，細胞將徹底破碎。 4) 冷熱交替法：從細菌或病毒中提取蛋白質(zhì)和核酸時可用此法。在90左右維持?jǐn)?shù)分鐘，立即放入冰浴中使之冷卻，如此反復(fù)多次，絕大部分細胞可以被破碎。,3. 化學(xué)與生物化學(xué)方法： 1) 自溶法：

6、將新鮮的生物材料存放于一定的pH和適當(dāng)?shù)臏囟认?，細胞結(jié)構(gòu)在自身所具有的各種水解酶（如蛋白酶和酯酶等）的作用下發(fā)生溶解，使細胞內(nèi)含物釋放出來。 2) 溶脹法：細胞膜為天然的半透膜，在低滲溶液和低濃度的稀鹽溶液中，由于存在滲透壓差，溶劑分子大量進入細胞，將細胞膜脹破釋放出細胞內(nèi)含物。 3) 酶解法：利用各種水解酶，如溶菌酶、纖維素酶、蝸牛酶和酯酶等，于37，pH8，處理15分鐘，可以專一性地將細胞壁分解。 4) 有機溶劑處理法：利用氯仿、甲苯、丙酮等脂溶性溶劑或SDS（十二烷基硫酸鈉）等表面活性劑處理細胞，可將細胞膜溶解，從而使細胞破裂，此法也可以與研磨法聯(lián)合使用。,（三）細胞器的分離,細胞器包括

7、細胞核、線粒體、核糖體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，植物細胞還有葉綠體。 如果要分離制備分布在這些細胞器中的生物大分子，為了防止其他細胞組分中的物質(zhì)對制備物的干擾或污染，還需先將細胞器分離出來，然后在某一細胞器中分離某一物質(zhì)。 細胞器的分離一般采用差速離心法，即將破碎后的細胞在適當(dāng)?shù)慕橘|(zhì)中進行離心，常用的介質(zhì)有蔗糖、甘露醇、檸檬酸、聚乙二醇等。各種細胞組分按質(zhì)量大小的不同，經(jīng)過不同速度的離心后，沉降于離心管的不同部位，經(jīng)多次分步離心后，即可獲得所需組分。,（四）提取,組織細胞破碎過程中，大量的胞內(nèi)酶及細胞內(nèi)含物被釋放出來，必須立即將其置于一定條件下和溶劑中，讓制備物充分溶解，并盡可能保持原來的天然狀態(tài)，避免因長久

8、放置造成制備物的分解破壞，這就是提取。,1. 影響提取的因素,目的產(chǎn)物在提取的溶劑中溶解度的大?。?由固相擴散到液相的難易； 溶劑的pH值和提取時間等。 通常： 極性物質(zhì)易溶于極性溶劑，非極性物質(zhì)易溶于非極性溶劑； 堿性物質(zhì)易溶于酸性溶劑，酸性物質(zhì)易溶于堿性溶劑； 溫度升高，溶解度加大； 遠離等電點的pH值，溶解度增加。 提取時所選擇的條件應(yīng)有利于目的產(chǎn)物溶解度的增加和保持其生物活性。,2. 水溶液提取,蛋白質(zhì)和酶的提取一般以水溶液為主。用水溶液提取生物大分子應(yīng)注意的幾個主要影響因素是： 1) 鹽濃度（即離子強度）： 離子強度對生物大分子的溶解度有極大的影響，絕大多數(shù)蛋白質(zhì)和酶，在低離子強度的

9、溶液中都有較大的溶解度，如在純水中加入少量中性鹽，蛋白質(zhì)的溶解度比在純水時大大增加，稱為“鹽溶”現(xiàn)象。鹽溶現(xiàn)象的產(chǎn)生主要是少量離子的活動，減少了偶極分子之間極性基團的靜電吸引力，增加了溶質(zhì)和溶劑分子間相互作用力的結(jié)果。 為了提高提取效率，有時需要降低或提高溶劑的極性。向水溶液中加入蔗糖或甘油可使其極性降低，增加離子強度（如加入KCl、NaCl、NH4Cl或(NH4)2SO4）可以增加溶液的極性。,2) pH值：蛋白質(zhì)、酶的溶解度和穩(wěn)定性與pH值有關(guān)。過酸、過堿均應(yīng)盡量避免，一般控制在pH=68范圍內(nèi)，提取溶劑的pH應(yīng)在蛋白質(zhì)和酶的穩(wěn)定范圍內(nèi)，通常選擇偏離等電點的兩側(cè)。 3) 溫度：為防止變性和

10、降解，制備具有活性的蛋白質(zhì)和酶，提取時一般在05的低溫操作。 4) 防止蛋白酶的降解作用：加入抑制劑或調(diào)節(jié)提取液的pH、離子強度或極性等方法使相應(yīng)的水解酶失去活性，防止它們對欲提純的蛋白質(zhì)、酶的降解作用。,5) 攪拌與氧化：攪拌能促使被提取物的溶解，一般采用溫和攪拌為宜，速度太快容易產(chǎn)生大量泡沫，增大了與空氣的接觸面，會引起酶等物質(zhì)的變性失活。因為一般蛋白質(zhì)都含有相當(dāng)數(shù)量的巰基，有些巰基常常是活性部位的必需基團，若提取液中有氧化劑或與空氣中的氧氣接觸過多都會使巰基氧化為分子內(nèi)或分子間的二硫鍵，導(dǎo)致酶活性的喪失。在提取液中加入少量巰基乙醇或二硫蘇糖醇以防止巰基氧化。,3. 有機溶劑提取,一些和脂

11、類結(jié)合比較牢固或分子中非極性側(cè)鏈較多的蛋白質(zhì)和酶難溶于水、稀鹽、稀酸、或稀堿中，常用不同比例的有機溶劑提取。 常用的有機溶劑有乙醇、丙酮、異丙醇、正丁酮等，這些溶劑可以與水互溶或部分互溶，同時具有親水性和親脂性。 有些蛋白質(zhì)和酶既溶于稀酸、稀堿，又能溶于含有一定比例的有機溶劑的水溶液中，在這種情況下，采用稀的有機溶液提取常?？梢苑乐顾饷傅钠茐?，并兼有除去雜質(zhì)提高純化效果的作用。 例如，胰島素。,4. 膜蛋白的提取,膜蛋白的種類繁多，多數(shù)膜蛋白分子數(shù)目較少，但卻賦予細胞膜非常重要的生物學(xué)功能。 根據(jù)膜蛋白分離的難易及其與脂分子的結(jié)合方式，膜蛋白可分為兩大類型：外周膜蛋白和內(nèi)在膜蛋白。(1) 外

12、周膜蛋白為水溶性蛋白，靠離子鍵或其它較弱的鍵與膜表面的蛋白質(zhì)分子或脂分子結(jié)合，因此只要改變?nèi)芤旱碾x子強度甚至提高溫度就可以從膜上分離下來，膜結(jié)構(gòu)并不被破壞。(2) 內(nèi)在膜蛋白與膜結(jié)合非常緊密，一般講只有用去垢劑(detergent)使膜溶解后才可分離出來。,膜蛋白 即內(nèi)在蛋白溶解性不好，提取膜蛋白的基本方法就是用不同的離心速度去掉胞質(zhì)蛋白等，最后用去污劑把蛋白從膜中釋放出來。 膜蛋白分離純化的重要步驟是選擇適當(dāng)?shù)脑鋈苡帽砻婊钚詣?，一般常用的有膽酸鹽，Triton-100，Tween-80, SDS等表面活性劑。,分離膜蛋白的方法（原則性）,1） 先分離膜，然后提??；如選用冷熱交替法、反復(fù)凍融法

13、、超聲破碎法、玻璃勻漿法、自溶法和酶處理法使得細胞破碎，然后通過剃度離心得到含有膜蛋白的粗組分。 2 ）用特殊的去污劑選擇性的分離。在多數(shù)情況下，都是采用去垢劑將疏水蛋白從其膜結(jié)構(gòu)中溶解下來。,三、分離與純化,從細胞中提取得到的生物大分子往往是不純凈的，含有大量雜質(zhì)，必須進一步分離純化，這一階段可分為粗分級分離和細分級分離兩步進行。 蛋白質(zhì)分離純化的方法很多，主要是根據(jù)蛋白分子之間特異性的差異，如分子大小，溶解度，電荷等建立起來的。,常用的蛋白質(zhì)分離純化技術(shù),溶解度,鹽析、等電點沉淀、有機溶劑沉淀,分子大小,透析、超過濾,密度梯度離心、凝膠過濾,帶電特性,電泳、離子交換層析,吸附特性,吸附層析

14、,對配體分子的親和性,親和層析、金屬螯合層析,分配層析,（一）粗分級分離,主要是利用鹽析法、等電點沉淀、有機溶劑沉淀等方法，使目的蛋白與其它較大量的雜蛋白分開。 優(yōu)點：簡便、處理量大、既能除去大量雜質(zhì)，又能濃縮蛋白質(zhì)。 缺點：分辨率低，產(chǎn)品雜質(zhì)多。,1. 鹽析（中性鹽沉淀）,在溶液中加入中性鹽使生物大分子沉淀析出的過程稱為“鹽析”。除了蛋白質(zhì)和酶以外，多肽、多糖和核酸等都可以用鹽析法進行沉淀分離。 鹽析法應(yīng)用最廣的還是在蛋白質(zhì)領(lǐng)域，已有八十多年的歷史，其突出的優(yōu)點是： 成本低，不需要特別昂貴的設(shè)備。 操作簡單、安全。 對許多生物活性物質(zhì)具有穩(wěn)定作用。, 鹽析的基本原理,蛋白質(zhì)溶液為親水溶膠體系

15、，其穩(wěn)定因素：水化膜和電荷。 中性鹽的親水性大于蛋白質(zhì)分子的親水性。 加入大量中性鹽后，奪走了水分子，破壞了水化膜，暴露出疏水區(qū)域，同時又中和了電荷，破壞了親水溶膠，蛋白質(zhì)分子即聚集而形成沉淀。,溶解度,鹽濃度,Salting-out,Salting-in,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,等點電時的蛋白質(zhì)（親水膠體）,帶負(fù)電荷蛋白質(zhì)（親水膠體）,脫水,脫水,脫水,帶負(fù)電荷蛋白質(zhì)（疏水膠體）,不穩(wěn)定蛋白顆粒,陰離子,陽離子,堿,酸,酸,蛋白質(zhì)聚集沉淀,帶正電荷蛋白質(zhì)（親水膠體）,堿,+,+,水化膜,帶正電荷蛋白質(zhì)（疏水膠體）,水化膜, 中性鹽的選擇,常用的中性鹽中

16、最重要的是(NH4)2SO4，因為它與其他常用鹽類相比有十分突出的優(yōu)點： 1) 溶解度大：尤其是在低溫時仍有相當(dāng)高的溶解度，這是其他鹽類所不具備的。由于酶和各種蛋白質(zhì)通常是在低溫下穩(wěn)定，因而鹽析操作也要求在低溫下（04）進行。由下表可以看到， 硫銨在0時的溶解度，遠遠高于其它鹽類：,幾種鹽在不同溫度下的溶解度（克/100毫升水）,0 20 80 100 （NH4)2SO4 70.6 75.4 95.3 103 Na2SO4 4.9 18.9 43.3 42.2 NaH2PO4 1.6 7.8 93.8 101 硫銨在0時的溶解度，遠遠高于其它鹽類,2) 分離效果好：有的提取液加入適量硫酸銨鹽析

17、，一步就可以除去75的雜蛋白，純度提高了四倍。 3) 不易引起變性，有穩(wěn)定酶與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的作用。有的酶或蛋白質(zhì)用23mol/L濃度的(NH4)2SO4保存可達數(shù)年之久。 4) 價格便宜，廢液不污染環(huán)境。,（3）分段鹽析,不同的蛋白質(zhì)分子，由于其分子表面的極性基團的種類、數(shù)目以及排布的不同，其水化層厚度不同，故鹽析所需要的鹽濃度也不一樣，因此調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)溶液中的鹽濃度，可以使不同的蛋白質(zhì)分別沉淀。,血清,球蛋白,清蛋白,(NH4)2SO4,50%飽和度,飽和,析出,析出,飽和度：在給定條件下以可能達到的最大濃度的百分?jǐn)?shù)表示的鹽濃度。,（4）鹽析的影響因素,1) 蛋白質(zhì)的濃度：高濃度的蛋白質(zhì)用稍低的

18、硫酸銨飽和度沉淀，若蛋白質(zhì)濃度過高，易產(chǎn)生各種蛋白質(zhì)的共沉淀作用。低濃度的蛋白質(zhì)，共沉淀作用小，但回收率降低。較適中的蛋白質(zhì)濃度是2.53.0，相當(dāng)于25 mg/mL30mg/mL。 2) pH值對鹽析的影響：在等電點處溶解度小，pH值常選在該蛋白質(zhì)的等電點附近。 3) 溫度的影響：對于蛋白質(zhì)、酶和多肽等生物大分子，在高離子強度溶液中，溫度升高，它們的溶解度反而減小。在低離子強度溶液或純水中蛋白質(zhì)的溶解度大多數(shù)還是隨溫度升高而增加的。一般情況下，可在室溫下進行。但對于某些對溫度敏感的酶，要求在04下操作，以避免活力喪失。,2.有機溶劑沉淀法,基本原理 有機溶劑對于許多蛋白質(zhì)（酶）、核酸、多糖和

19、小分子生化物質(zhì)都能發(fā)生沉淀作用，是較早使用的沉淀方法之一。其原理主要是： 降低水溶液的介電常數(shù)，向溶液中加入有機溶劑能降低溶液的介電常數(shù)，減小溶劑的極性，從而削弱了溶劑分子與蛋白質(zhì)分子間的相互作用力，導(dǎo)致蛋白質(zhì)溶解度降低而沉淀。 由于使用的有機溶劑與水互溶，它們在溶解于水的同時，從蛋白質(zhì)分子周圍的水化層中奪走了水分子，破壞了蛋白質(zhì)分子的水膜，因而發(fā)生沉淀作用。,（2）有機溶劑沉淀法的優(yōu)點,分辨能力比鹽析法高，即一種蛋白質(zhì)或其他溶質(zhì)只在一個比較窄的有機溶劑濃度范圍內(nèi)沉淀。 沉淀不用脫鹽，過濾比較容易（如有必要，可用透析袋脫有機溶劑）。因而在生化制備中有廣泛的應(yīng)用。 其缺點是對某些具有生物活性的大

20、分子容易引起變性失活，操作需在低溫下進行。,（3）有機溶劑的選擇和濃度的計算,用于生化制備的有機溶劑的選擇首先是要能與水互溶。沉淀蛋白質(zhì)和酶常用的是乙醇、甲醇和丙酮。 為了獲得沉淀而不著重于進行分離，可用溶液體積的倍數(shù)：如加入一倍、二倍、三倍原溶液體積的有機溶劑，來進行有機溶劑沉淀。,（4）有機溶劑沉淀的影響因素,1) 溫度：多數(shù)生物大分子如蛋白質(zhì)、酶和核酸在有機溶劑中對溫度特別敏感，溫度稍高就會引起變性，且有機溶劑與水混合時產(chǎn)生放熱反應(yīng)，因此必須預(yù)冷，操作要在冰鹽浴中進行，加入有機溶劑時必須緩慢且不斷攪拌以免局部過濃。 一般規(guī)律是溫度越低，得到的蛋白質(zhì)活性越高。 2) 樣品濃度：低濃度樣品回

21、收率低，要使用比例更大的有機溶劑進行沉淀。高濃度樣品，可以節(jié)省有機溶劑，減少變性的危險，但雜蛋白的共沉淀作用大。 通常使用5mg/mL20mg/mL的蛋白質(zhì)初濃度為宜。,3) pH值：選擇在樣品穩(wěn)定的pH值范圍內(nèi)，通常是選在等電點附近，從而提高此沉淀法的分辨能力。 4) 離子強度：鹽濃度太大或太小都有不利影響，通常鹽濃度以不超過5為宜，使用乙醇的量也以不超過原蛋白質(zhì)水溶液的倍體積為宜，少量的中性鹽對蛋白質(zhì)變性有良好的保護作用，但鹽濃度過高會增加蛋白質(zhì)在水中的溶解度，降低了沉淀效果，通常是在低濃度緩沖液中沉淀蛋白質(zhì)。 沉淀所得的固體樣品，如果不是立即溶解進行下一步的分離，則應(yīng)盡可能抽干沉淀，減少

22、其中有機溶劑的含量，如若必要可以裝透析袋透析脫有機溶劑，以免影響樣品的生物活性。,3.等電點沉淀法,利用具有不同等電點的兩性電解質(zhì)，在達到電中性時溶解度最低，易發(fā)生沉淀，從而實現(xiàn)分離的方法。氨基酸、蛋白質(zhì)、酶和核酸都是兩性電解質(zhì)，可以利用此法進行初步的沉淀分離。 由于許多蛋白質(zhì)的等電點十分接近，而且?guī)в兴さ牡鞍踪|(zhì)等生物大分子仍有一定的溶解度，不能完全沉淀析出，因此，單獨使用此法分辨率較低，此法常與鹽析法、有機溶劑沉淀法或其他沉淀劑一起配合使用，以提高沉淀能力和分離效果。,pH和離子強度對-乳球蛋白溶解度的影響,4. 選擇性變性沉淀法,這一方法是利用生物大分子與非目的生物大分子在物理化學(xué)性質(zhì)等

23、方面的差異，選擇一定的條件使雜蛋白等非目的物變性沉淀而得到分離提純。 熱變性 利用生物大分子對熱的穩(wěn)定性不同，加熱升高溫度使非目的生物大分子變性沉淀而保留目的物在溶液中。 表面活性劑和有機溶劑變性 使那些對表面活性劑和有機溶劑敏感性強的雜蛋白變性沉淀。通常在冰浴或冷室中進行。 選擇性酸堿變性 利用對pH值的穩(wěn)定性不同而使雜蛋白變性沉淀。通常是在分離純化流程中附帶進行的分離純化步驟。,5. 有機聚合物沉淀法,有機聚合物是六十年代發(fā)展起來的一類重要的沉淀劑，最早應(yīng)用于提純免疫球蛋白和沉淀一些細菌和病毒。近年來廣泛用于核酸和酶的純化。其中應(yīng)用最多的是 “聚乙二醇”【HOCH2(CH2OCH2)nCH

24、2OH (n 4)】( Polyethylene Glycol 簡寫為 PEG )，它的親水性強，溶干水和許多有機溶劑，對熱穩(wěn)定，有廣泛圍的分子量，在生物大分子制備中，用的較多的是分子量為600020000的 PEG。 本方法的優(yōu)點是： 操作條件溫和，不易引起生物大分子變性。 沉淀效能高，使用很少量的PEG即可以沉淀相當(dāng)多的生物大分子。 沉淀后有機聚合物容易去除。,6. 透析,自Thomas Graham 1861年發(fā)明透析方法至今已有一百多年。透析已成為生物化學(xué)實驗室最簡便最常用的分離純化技術(shù)之一。在生物大分子的制備過程中，除鹽、除少量有機溶劑、除去生物小分子雜質(zhì)和濃縮樣品等都要用到透析的技

25、術(shù)。 透析只需要使用專用的半透膜即可完成。,保留在透析袋內(nèi)未透析出的樣品溶液稱為“保留液”，袋（膜）外的溶液稱為“滲出液”或“透析液”。截留分子量MwCO通常為1萬左右。 用1 BaCl2檢查(NH4)2SO4，用1 AgNO3 檢查NaCl、KCl等。,7. 超濾,超過濾即超濾，自20年代問世后，直至60年代以來發(fā)展迅速，很快由實驗室規(guī)模的分離手段發(fā)展成重要的工業(yè)單元操作技術(shù)。 超濾現(xiàn)已成為一種重要的生化實驗技術(shù)，廣泛用于含有各種小分子溶質(zhì)的各種生物大分子（如蛋白質(zhì)、酶、核酸等）的濃縮、分離和純化。 超濾是一種加壓膜分離技術(shù)，即在一定的壓力下，使小分子溶質(zhì)和溶劑穿過一定孔徑的特制的薄膜，而使

26、大分子溶質(zhì)不能透過，留在膜的一邊，從而使大分子物質(zhì)得到了部分的純化。,加壓的蛋白質(zhì)溶液,濃縮的蛋白質(zhì)溶液,含小分子的溶液,超濾根據(jù)所加的操作壓力和所用膜的平均孔徑的不同，可分為微孔過濾、超濾和反滲透三種。 微孔過濾所用的操作壓通常小于4104Pa，膜的平均孔徑為500埃14微米（1微米104埃），用于分離較大的微粒、細菌和污染物等。 超濾所用操作壓為4104Pa7105Pa，膜的平均孔徑為10100埃，用于分離大分子溶質(zhì)。 反滲透所用的操作壓比超濾更大，常達到35105Pa140105Pa，膜的平均孔徑最小，一般為10埃以下，用于分離小分子溶質(zhì)，如海水脫鹽，制高純水等。,（二）精分級分離,一般

27、蛋白質(zhì)樣品經(jīng)粗制分級后，體積較小，雜質(zhì)大部分被除去。進一步提純，通常使用高分辨率的柱層析及電泳方法。 常用的柱層析方法有分子篩層析、離子交換層析、疏水吸附層析、親和層析和金屬螯合層析等。 常用的電泳方法有聚丙烯酰胺凝膠電泳、等電聚焦電泳等。 另外，結(jié)晶也是蛋白質(zhì)分離純化的方法之一，制備的結(jié)晶物常常作為蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析之用。,第十節(jié),蛋白質(zhì) 的分離與純化,一、 引言 二、 蛋白質(zhì)（酶）分離純化的前處理 三、蛋白質(zhì)（酶）分離與純化 四、層析技術(shù) 五、電泳技術(shù) 六、離心技術(shù),四、層析技術(shù),層析法也稱色譜法，是1906年俄國植物學(xué)家Michael Tswett發(fā)現(xiàn)并命名的。他將植物葉子的色素通過裝填有吸

28、附劑的柱子，各種色素以不同的速率流動后形成不同的色帶而被分開，由此得名為“色譜法”（Chromatography) 。 后來無色物質(zhì)也可利用吸附柱層析分離。 1944年出現(xiàn)紙層析。 以后層析法不斷發(fā)展，相繼出現(xiàn)氣相層析、高壓液相層析、薄層層析、親和層析、凝膠層析等。,（一）層析的分類,按層析的分離機理分類 排阻層析(exclusion chromatography) 離子交換層析(ion exchange chromatography) 吸附層析(absorption chromatography) 分配層析(partition chromatography) 親和層析(affinity ch

29、romatography) 金屬螯合層析(metal chelating chromatography) 疏水層析(hydrophobic chromatography) 反向?qū)游?reverse phase chromatography) 聚焦層析(focusing chromatography) 灌注層析(perfusion chromatography),（二）排阻層析 （凝膠層析）,凡是利用生物大分子的相對分子質(zhì)量差異進行層析分離的方法，均稱之為排阻層析。 用于層析的分離介質(zhì)稱為排阻層析介質(zhì)。 凝膠層析介質(zhì)主要是以葡聚糖、瓊脂糖、聚丙烯酰胺等為原料，通過特殊工藝合成的層析介質(zhì)。目前已成

30、為生物化學(xué)、分子生物學(xué)和生物制藥的研究和生產(chǎn)中必不可少的分離介質(zhì)。,1、凝膠層析的特點及應(yīng)用,特點：設(shè)備簡單、操作方便、樣品回收率高、實驗重復(fù)性好、特別是不改變樣品生物學(xué)活性等優(yōu)點。 用途：蛋白質(zhì)(包括酶)、核酸、多糖等生物分子的分離純化，同時還應(yīng)用于蛋白質(zhì)分子量的測定、脫鹽、樣品濃縮等。,2、凝膠層析的原理,凝膠層析的固定相是惰性的珠狀凝膠顆粒，凝膠顆粒的內(nèi)部具有立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，形成很多孔穴。 概念（排阻層析，分子篩層析）：當(dāng)生物大分子通過裝有凝膠顆粒的層析柱時，根據(jù)它們分子大小不同而進行分離的技術(shù)。 原理：凝膠顆粒內(nèi)部具有多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，被分離的混合物流過層析柱時，比凝膠孔徑大的分子不能進入凝

31、膠孔內(nèi)，在凝膠顆粒之間的空隙向下移動，并最先被洗脫出來；比網(wǎng)孔小的分子能不同程度的自由出入凝膠孔內(nèi)外，在柱內(nèi)經(jīng)過的路程較長移動速度較慢，最后被洗脫出來。,3. 凝膠的種類和性質(zhì),(1)交聯(lián)葡聚糖凝膠（Sephadex) 1) Sephadex G G 后的數(shù)字為凝膠吸水值的10倍。 G 反應(yīng)凝膠的交聯(lián)程度、膨脹程度和分部范圍。 2） SephadeX LH20，是Sephadex G25的羧丙基衍生物，溶于水和親脂性溶劑，用于分離不溶于水的物質(zhì)。 (2)瓊脂糖凝膠（Sepharose ; pharmacia;Bio-Gel(Blo-Rad) 依靠糖鏈之間的次級鍵維持網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，瓊脂糖密度越大，網(wǎng)

32、狀結(jié)構(gòu)越密集。 (3)聚丙烯酰胺 一種人工合成的凝膠，以丙烯酰胺為單位，由甲叉雙丙烯酰胺交聯(lián)而成。交聯(lián)劑越多，孔隙度越小。 商品名為生物膠P（Bio-Gel P). (4) 聚丙乙烯凝膠（Styrogel) 大網(wǎng)孔結(jié)構(gòu)。,葡聚糖凝膠(Sephadex )的物理特性,4. 層析柱的重要參數(shù),柱體積：柱體積是指凝膠裝柱后，從柱的底板到凝膠沉積表面的體積。在色譜柱中充滿凝膠的部分稱為凝膠床，因引柱體積又稱“床”體積，常用Vt 表示。 外水體積：色譜柱內(nèi)凝膠顆粒間隙，這部分體積稱外水體積，亦稱間隙體積，常用Vo表示。,內(nèi)水體積：因為凝膠為三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，顆粒內(nèi)部仍有空間，液體可進入顆粒內(nèi)部，這就分間隙的

33、總和為內(nèi)水體積，又稱定相體積，常用Vi表示。 不包括固體支持物的體積（Vg）。 峰洗脫體積：是指被分離物質(zhì)通過凝膠柱所需洗脫液的體積，常用Ve 表示。 當(dāng)使用樣品的體積很少時，（與洗脫體積比較可以忽略不計），在洗脫圖中，從加樣到峰頂位置所用洗脫液體積為Ve。 當(dāng)樣品體積與洗脫體積比較不能忽略時，洗脫體積計算可以從樣品體積的一半到峰頂位置。當(dāng)樣品很大時，洗脫體積計算可以從應(yīng)用樣品開始到洗脫峰升高的彎曲點（或半高處）。,5. 凝膠過濾在試驗室中的應(yīng)用,1）生物大分子物質(zhì)的分離純化 2）分子量的測定 3）分級分離 4）溶液濃縮 5）平衡常數(shù)的測定 6）細胞及顆粒的分離,6. 分子量的測定,蛋白質(zhì)通過

34、凝膠柱的速度即洗脫體積與其分子量有關(guān):,LogM=k1-k2Ve,（Ve為洗脫體積）,先測得幾種標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的 Ve，并以其分子量對數(shù)對 Ve作圖得一直線，再測出 待測樣品的Ve，查標(biāo)準(zhǔn)曲 線即可確定分子量。,（三）離子交換層析,根據(jù)離子交換樹脂對需要分離的各種離子的親和力不同而達到分離的目的。 離子交換樹脂通常是不溶于水的高分子物質(zhì)，分子中含有可解離的基團。 含有酸性可解離基團的稱為陽離子交換樹脂，可解離出H+； 含有堿性可解離基團的稱為陰離子交換樹脂，可解離出OH-。,1.離子交換層析的原理,生物大分子如蛋白質(zhì)、核酸等多價電解質(zhì)有不同的分子大小及電荷排列方式。 當(dāng)在一定pH下凈電荷為負(fù)的蛋白

35、質(zhì)分子可通過靜電鍵結(jié)合到帶正電荷的陰離子交換劑上； 當(dāng)在一定pH下凈電荷為正的蛋白質(zhì)分子可通過靜電鍵結(jié)合到帶負(fù)電荷的陽離子交換劑上； 大分子依其與離子交換劑親和力的不同，而在以不同牢度被吸附于離子交換劑，通過改變離子強度或(和)pH使大分子再從離子交換劑上先后被洗脫下來。,2. 離子交換層析的應(yīng)用,1)水處理 離子交換層析是一種簡單而有效的雜質(zhì)及各種離子的方法，聚丙乙烯樹脂廣泛的應(yīng)用于高純水的制備、硬水軟化以及污水處理等方面。 2)分離純化小分子物質(zhì) 離子交換層析廣泛應(yīng)用于無機離子、有機酸、核苷酸、氨基酸、抗生素等小分子物質(zhì)的分離純化。例如對氨基酸的分析使用強酸性陽離子聚苯乙烯樹脂，將氨基酸混

36、合液在pH值為23上柱。這時氨基酸都結(jié)合在樹脂上，再逐步提高洗脫液的離子強度和pH值，這樣各種氨基酸將以不同的速度被洗脫下來，可以進行分離鑒定。全自動氨基酸分析儀就是采用這種原理制成。,3)分離純化生物大分子物質(zhì) 離子交換層析是依據(jù)物質(zhì)的帶電性質(zhì)的不同來進行分離純化的，是分離純化蛋白質(zhì)等生物大分子的一種重要手段。 由于生物樣品的復(fù)雜性，一般很難只經(jīng)過一次離子交換層析就達到高純度，往往要與其它分離方法結(jié)合使用。 使用離子交換層析分離樣品要充分利用其按帶電性質(zhì)來分離的特性，只要選擇合適的條件，通過離子交換層析可以得到較滿意的分離效果。,（四）吸附層析(absorption chromatograp

37、hy),吸附作用是指某些物質(zhì)能夠從溶液中將溶質(zhì)濃集在其表面的現(xiàn)象。 利用吸附層析介質(zhì)表面的活性分子或活性基團，對流動相中不同溶質(zhì)產(chǎn)生吸附作用，利用其對不同溶質(zhì)吸附能力的強弱而進行分離的一種方法，稱之為吸附層析。 固定相為固體，流動相為液體。,物質(zhì)之所以能在固體表面停留，這是因為固體表面的分子和固體內(nèi)部分子所受的吸引力不同。在固體內(nèi)部，分子之間互相作用的力是對稱的，其力場互相抵消。而處于固體表明的分子所收的力是不對稱的，向內(nèi)的一面受到固體內(nèi)部分子的作用力大，而表面層所受的作用力小，因而氣體或溶質(zhì)分子在運動中遇到固體表面時受到這種剩余力的影響，就會被吸引而停留下來。 吸附過程是可逆的，被吸附物在一

38、定條件下可以解吸出來。在單位時間內(nèi)被吸附于吸附劑的某一表面積上的分子和同一單位時間內(nèi)離開此表面的分子之間可以建立動態(tài)平衡，稱為吸附平衡。 吸附層析過程就是不斷地產(chǎn)生平衡和不平衡、吸附與解吸的動態(tài)平衡過程。,實驗中常用的固體吸附劑有氧化鋁、硅酸鎂、磷酸鈣、氫氧化鈣、活性鈣、蔗糖、纖維素和淀粉。 常用的洗脫液有乙烷、苯乙醚、氯仿，以及乙醇、丙酮或水與有機溶劑形成的各種混合物。 吸附層析通常用于分離脂類、類固醇類、類胡羅卜素、葉綠素以及它們的前體等非極性和極性不強的有機物。,（五）分配層析(partition chromatography),分配層析是利用混合物中各組分在兩相中分配系數(shù)不同而達到分離

39、目的的層析技術(shù)，相當(dāng)于一種連續(xù)性的溶劑抽提方法。 在分配層析中，固定相是極性溶劑（例如水、稀硫酸、甲醇等）。此類溶劑能和多孔的支持物(常用的是吸附力小、反應(yīng)性弱的惰性物質(zhì)如淀粉、纖維素粉，濾紙等)緊密結(jié)合，使呈不流動狀態(tài)；流動相則是非極性的有機溶劑。,分配系數(shù)()是指在一定溫度和壓力條件下達到平衡，物質(zhì)在固定相和流動相兩部分的濃度比值。,在層析過程中，當(dāng)有機溶劑流動相流經(jīng)樣品點時，樣品中的溶質(zhì)便按其分配系數(shù)部分地轉(zhuǎn)入流動相向前移動。當(dāng)經(jīng)過前方固定相時，流動相中的溶質(zhì)就會進行分配，一部分進入固定相。通過這樣不斷進行的流動和再分配，溶質(zhì)沿著流動方向不斷前進。各種溶質(zhì)由于分配系數(shù)不同，向前移動的速度

40、也各不相同。分配系數(shù)較大的物質(zhì)，由于分配在固定相多些，分配在流動相少些，溶質(zhì)移動較慢；而分配系數(shù)較小的物質(zhì)，流動速度較快。從而將分配系數(shù)不同的物質(zhì)分離開來。,（六）親和層析(Affinity Chromatography),許多物質(zhì)都具有和某化合物發(fā)生特異性可逆結(jié)合的特性。例如：酶與輔酶或酶與底物（產(chǎn)物或競爭性抑制劑等），抗原與抗體，凝集素與受體，維生素與結(jié)合蛋白，凝集素與多糖（或糖蛋白、細胞表面受體），核酸與互補鏈（或組蛋白、核酸多聚酶、結(jié)合蛋白）以及細胞與細胞表面特異蛋白（或凝集素）等。,1. 親和層析的原理,親和層析法就是利用化學(xué)方法將可與待分離物質(zhì)可逆性特異結(jié)合的化合物（稱配體）連接到

41、某種固相載體上，并將載有配體的固相載體裝柱，當(dāng)待提純的生物大分子通過此層析柱時，此生物大分子便與載體上的配體特異的結(jié)合而留在柱上，其他物質(zhì)則被沖洗出去。然后再用適當(dāng)方法使這種生物大分子從配體上分離并洗脫下來，從而達到分離提純的目的 。,配體,蛋白質(zhì),蛋白質(zhì)和配體復(fù)合物,2. 親和層析的特點,純化效率極高：親和層析由于配體與待分離物質(zhì)進行特異性結(jié)合，所以分離提純的效率極高，提純度可達幾千倍 。,3. 親和層析的應(yīng)用,1） 抗原和抗體 利用抗原、抗體之間高特異的親和力而進行分離的方法又稱為免疫親和層析。例如將抗原結(jié)合于親和層析基質(zhì)上，就可以從血清中分離其對應(yīng)的抗體。 抗原、抗體間親和力一般比較強，

42、其解離常數(shù)為108 - 1012 M，所以洗脫時是比較困難的，通常需要較強烈的洗脫條件。,2) 激素和受體蛋白 激素的受體蛋白屬于膜蛋白，利用去污劑溶解后的膜蛋白往往具有相似的物理性質(zhì)，難于用通常的層析技術(shù)分離。但去污劑溶解通常不影響受體蛋白與其對應(yīng)激素的結(jié)合。所以利用激素和受體蛋白間的高親和力（10-61012 M）而進行親和層析是分離受體蛋白的重要方法。目前已經(jīng)用親和層析方法純化出了大量的受體蛋白，如乙酰膽堿、腎上腺素、生長激素、嗎啡、胰島素等等多種激素的受體。,3) 凝集素和糖蛋白 凝集素是一類具有多種特性的糖蛋白，幾乎都是從植物中提取。它們能識別特殊的糖，因此可以用于分離多糖、各種糖蛋

43、白、免疫球蛋白、血清蛋白甚至完整的細胞。 用凝集素作為配體的親和層析是分離糖蛋白的主要方法。 伴刀豆球蛋白A能結(jié)合含-D-吡喃甘露糖苷或 -D-吡喃葡萄糖苷的糖蛋白。 麥胚凝集素可以特異的與N-乙酰氨基葡萄糖或N-乙酰神經(jīng)氨酸結(jié)合，可以用于血型糖蛋白A、紅細胞膜凝集素受體等的分離。 洗脫時只需用相應(yīng)的單糖或類似物，就可以將待分離的糖蛋白洗脫下來。,4）多核苷酸和核酸 利用poly-U作為配體可以用于分離mRNA以及各種poly-U結(jié)合蛋白。poly-A可以用于分離RNA聚合酶以及其它poly-A結(jié)合蛋白。 以DNA作為配體可以用于分離各種DNA結(jié)合蛋白、DNA聚合酶、RNA聚合酶、核酸外切酶等

44、多種酶類。 5）輔酶 核苷酸及其許多衍生物、各種維生素等是多種酶的輔酶或輔助因子，利用它們與對應(yīng)酶的親和力可以對多種酶類進行分離純化。 例如固定的各種腺嘌呤核苷酸輔酶，包括AMP、cAMP、ADP、ATP、CoA、NAD+、NADP+等等應(yīng)用很廣泛，可以用于分離各種激酶和脫氫酶。,6）分離病毒、細胞 利用配體與病毒、細胞表面受體的相互作用，親和層析也可以用于病毒和細胞的分離。 利用凝集素、抗原、抗體等作為配體都可以用于細胞的分離。 例如各種凝集素可以用于分離紅細胞以及各種淋巴細胞，胰島素可以用于分離脂肪細胞等。,（七）金屬螯合層析(metal chelating chromatography)

45、,利用固定相載體上偶聯(lián)的亞胺基乙二酸為配基與二價金屬離子發(fā)生螯合作用，結(jié)合在固定相上，二價金屬離子可以與流動相中含有的半胱氨酸、組氨酸、咪唑及其類似物發(fā)生特異螯合作用而進行分離的方法，稱之為金屬螯合層析。,金屬螯合層析技術(shù)在現(xiàn)代基因工程中常用于表達蛋白的分離,（八）高效液相色譜（ HPLC ）,高效液相色譜法是以液體作為流動相，用顆粒極細的高效固定相的柱色譜分離技術(shù)。 高效液相色譜對樣品的適用性廣，不受分析對象揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性的限制，因而彌補了氣相色譜法的不足。 目前已知的有機化合物中，可用氣相色譜分析的約占20%，而80%則需用高效液相色譜來分析。,1. 高效液相色譜法的特點,特點：高壓、高

46、效、高速 高沸點、熱不穩(wěn)定有機及生化試樣的高效分離分析方法。,2. 液相色譜儀、主要部件及流程,主要部件,(1) 高壓輸液泵 主要部件之一，壓力：150350105 Pa。 為了獲得高柱效而使用粒度很小的固定相（10m），液體的流動相高速通過時，將產(chǎn)生很高的壓力，因此高壓、高速是高效液相色譜的特點之一。,(2) 梯度淋洗裝置,外梯度: 利用兩臺高壓輸液泵，將兩種不同極性的溶劑按一定的比例送入梯度混合室，混合后進入色譜柱。 內(nèi)梯度: 一臺高壓泵, 通過比例調(diào)節(jié)閥,將兩種或多種不同極性的溶劑按一定的比例抽入高壓泵中混合。,(3) 進樣裝置,流路中為高壓力工作狀態(tài)， 通常使用耐高壓的六通閥進樣裝置，

47、 其結(jié)構(gòu)如圖所示：,(4) 高效分離柱,柱體為直型不銹鋼管，內(nèi)徑16 mm，柱長540 cm。發(fā)展趨勢是減小填料粒度和柱徑以提高柱效。,(5) 高效液相色譜檢測器,紫外光度檢測器（UV）：最小檢測量10-9gmL-1，對流量和溫度的波動不敏感，可用于梯度洗脫。 最常用的檢測器。,光電二極管陣列檢測器：1024個二極管陣列，各檢測特定波長，計算機快速處理，三維立體譜圖，如圖所示。,3. 影響分離的因素,影響分離的主要因素有: 固定相及分離柱； 流動相的流量、性質(zhì)和極性;,1）固定相及分離柱,選擇合適的固定相，降低填料粒度可顯著提高柱效，但在高效液相色譜中，分離柱的制備是一項技術(shù)要求非常高的工作，

48、一般很少自行制備。 選擇短柱、細內(nèi)徑提高分析速度； 研制高效柱填料是一活躍領(lǐng)域。,2）流動相及流動相的極性,（1）可顯著改變組分分離狀況的流動相選擇在液相色譜中顯得特別重要。 液相色譜的流動相又稱為：淋洗液，洗脫劑。 （2）親水性固定液常采用疏水性流動相，即流動相的極性小于固定相的極性，稱為正相液液色譜法，極性柱也稱正相柱。 （3）若流動相的極性大于固定液的極性，則稱為反相液液色譜，非極性柱也稱為反相柱。組分在兩種類型分離柱上的出峰順序相反。,流動相組成,流動相按組成不同可分為單組分和多組分； 按極性可分為極性、弱極性、非極性； 按使用方式有固定組成淋洗和梯度淋洗。 常用溶劑: 己烷、四氯化碳

49、、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。 采用二元或多元組合溶劑作為流動相可以靈活調(diào)節(jié)流動相的極性或增加選擇性，以改進分離或調(diào)整出峰時間。,4. 高效液相色譜法的主要分離類型,1）吸附色譜（液-固吸附色譜） 以固體吸附劑為固定相，如硅膠、氧化鋁等，較常使用的是510m的硅膠吸附劑。流動相可以是各種不同極性的一元或多元溶劑。 2）分配色譜（液-液分配色譜） 早期通過在擔(dān)體上涂漬一薄層固定液制備固定相, 現(xiàn)多為化學(xué)鍵合固定相，即用化學(xué)反應(yīng)的方法通過化學(xué)鍵將固定液結(jié)合在擔(dān)體表面。,3）離子交換色譜 固定相為離子交換樹脂，流動相為無機酸或無機堿的水溶液。各種離子根據(jù)它們與樹脂上的交換基團的交換能力的不同而得

50、到分離。 4）凝膠色譜（空間排阻色譜） 以凝膠為固定相。凝膠是一種經(jīng)過交聯(lián)的、具有立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)和不同孔徑的多聚體的通稱。如葡聚糖凝膠、瓊脂糖等軟質(zhì)凝膠；多孔硅膠、聚苯乙烯凝膠等硬質(zhì)凝膠；,五、電泳技術(shù),電泳的概念：帶電物質(zhì)在電場中向相反電極移動的現(xiàn)象稱為電泳（electrophoresis）。 電泳現(xiàn)象早在十九世紀(jì)初就已發(fā)現(xiàn)（1808年俄國物理學(xué)家Ress進行了世界上第一次電泳實驗）。但電泳技術(shù)的廣泛應(yīng)用，則是在1937年用濾紙作為支持介質(zhì)成功地進行紙電泳以后，特別是近幾十年以來，電泳技術(shù)發(fā)展很快，各種類型的電泳技術(shù)相繼誕生，在生物化學(xué)、醫(yī)學(xué)、免疫學(xué)等領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。,電泳技術(shù)發(fā)展簡史,1

51、809年俄國物理學(xué)家首次發(fā)現(xiàn)電泳現(xiàn)象。他在濕粘土中插上帶玻璃管的正負(fù)兩個電極，加電壓后發(fā)現(xiàn)正極玻璃管中原有的水層變混濁，即帶負(fù)電荷的粘土顆粒向正極移動，這就是電泳現(xiàn)象。 1909年Michaelis首次將膠體離子在電場中的移動稱為電泳。他用不同pH的溶液在U形管中測定了轉(zhuǎn)化酶和過氧化氫酶的電泳移動和等電點。,1937年瑞典Uppsala大學(xué)的Tiselius對電泳儀器作了改進，創(chuàng)造了Tiselius電泳儀，建立了研究蛋白質(zhì)的移動界面電泳方法，并首次證明了血清是由白蛋白及、球蛋白組成的，由于Tiselius在電泳技術(shù)方面作出的開拓性貢獻而獲得了1948年的諾貝爾化學(xué)獎。 1948年Wieland

52、和Fischer重新發(fā)展了以濾紙作為支持介質(zhì)的電泳方法，對氨基酸的分離進行過研究。 1950年Durrum用紙電泳進行了各種蛋白質(zhì)的分離以后，開創(chuàng)了利用各種固體物質(zhì)（如各種濾紙、醋酸纖維素薄膜、瓊脂凝膠、淀粉凝膠等）作為支持介質(zhì)的區(qū)帶電泳方法。,1959年Raymond和Weintraub利用人工合成的凝膠作為支持介質(zhì)，創(chuàng)建了聚丙烯酰胺凝膠電泳，極大地提高了電泳技術(shù)的分辨率，開創(chuàng)了近代電泳的新時代。 30多年來，聚丙烯酰胺凝膠電泳仍是生物化學(xué)和分子生物學(xué)中對蛋白質(zhì)、多肽、核酸等生物大分子使用最普遍，分辨率最高的分析鑒定技術(shù)，是檢驗生化物質(zhì)的最高純度：即“電泳純”（一維電泳一條帶或二維電泳一個點

53、）的標(biāo)準(zhǔn)分析鑒定方法，至今仍被人們稱為是對生物大分子進行分析鑒定的最后、最準(zhǔn)確的手段，即“Last Check”。 80年代發(fā)展起來的新的毛細管電泳技術(shù)，是化學(xué)和生化分析鑒定技術(shù)的重要新發(fā)展，己受到人們的充分重視和應(yīng)用。,（一）電泳的分類,原則上按電泳的原理來分，可分為二類： 自由界面電泳：又稱移動界面電泳，是指在沒有支持介質(zhì)的溶液中進行的電泳。其裝置復(fù)雜，價格昂貴，費時費力，不便于推廣應(yīng)用。 區(qū)帶電泳：是指有支持介質(zhì)的電泳，待分離物質(zhì)在支持介質(zhì)上分離成若干區(qū)帶。支持介質(zhì)的作用主要是防止電泳過程中的對流和擴散，以使被分離的成分得到最大分辨率的分離。區(qū)帶電泳由于采用的介質(zhì)不同以及技術(shù)上的差異，又

54、可分為不同的類型。,按支持介質(zhì)種類的不同，區(qū)帶電泳可分為： 紙電泳：用濾紙作為支持介質(zhì)，多用于核苷酸的定性定量分析。 醋酸纖維素薄膜電泳：醫(yī)學(xué)上，常用于分析血清蛋白、胎盤球蛋白，其優(yōu)點是簡便迅速，便于保存照相，比紙電泳分辨率高。 以上二種類型的電泳，由于介質(zhì)的孔徑度大，沒有分子篩效應(yīng)，主要靠被分離物的電荷多少進行分離。,淀粉凝膠電泳：多用于同工酶分析，凝膠鋪厚些，可一層一層剝層分析（一板多測）。天然淀粉經(jīng)加工處理即可使用，但孔徑度可調(diào)性差，并且由于其批號之間的質(zhì)量相差很大，很難得到重復(fù)的電泳結(jié)果，加之電泳時間長，操作麻煩，分辨率低，實驗室中已很少使用。 瓊脂糖凝膠電泳：一般用于核酸的分離分析。

55、瓊脂糖凝膠孔徑度較大，對大部分蛋白質(zhì)只有很小的分子篩效應(yīng)。 聚丙烯酰胺凝膠電泳：可用于核酸和蛋白質(zhì)的分離、純化及檢測。其分辨率較高。 聚丙烯酰胺和瓊脂糖是目前實驗室最常用的支持介質(zhì),（二）電泳的基本原理,電泳是在電場的作用下而產(chǎn)生的物質(zhì)運動，不同的物質(zhì)在一定的電場強度下，由于所帶電荷不同，因此受到的引力不同，向相反電極泳動速度不同進而達到分離目的。,若將帶凈電荷Q的粒子放入電場，則該粒子所受到的電荷引力為： F引= E Q （1） 在溶液中,運動粒子與溶液之間存在阻力F阻 F阻= 6rV 當(dāng)F引=F阻時 EQ = 6rV V = 由上式可以看出,粒子的移動速度(泳動速度V)與電場強度(E) 和

56、粒子所帶電荷量(Q)成正比,而與粒子的半徑(r)及溶液的粘度 ()成反比。非球形分子（如線狀DNA）在電泳過程中受到更大 的阻力，即粒子的泳動速度與粒子形狀有關(guān)。,EQ,6r,（2）,（3）,（4）,由（4）可知，帶電粒子的泳動速度受電場強度影響，使得同一種帶電粒子在不同電場里泳動速度不同。 在一次電泳中，蛋白質(zhì)處在同一電場中，為了便于比較，常用遷移率 m（或稱泳動度，指帶電粒子在單位電場強度下的泳動速度）代替泳動速度表示粒子的泳動情況。 m = V/E = Q/6r （5） 由上式可以看出，在同一電場中，遷移率僅與球形粒子所帶電荷數(shù)量、粒子大小及溶液粘度有關(guān)，而與電場強度無關(guān)。,EQ,6r,

57、（4）,V=,以上討論的是在溶液中進行的自由界面電泳的情況，在用支持介質(zhì)的區(qū)帶電泳中，除上述影響因素外，有效遷移率還受電滲（是指在電場中，液體對于固體支持物的相對移動）的影響。電泳時應(yīng)避免用高電滲物質(zhì)作支持介質(zhì)。 最后要考慮選用離子強度適宜的溶液。離子強度影響粒子的電動電勢，溶液的離子強度越高，由于溶液中的離子會分擔(dān)大部分電流，則粒子的電動電勢越小，泳動速度越慢，反之越快。 總之，電泳受粒子本身大小、形狀、所帶電量、溶液粘度、溫度、pH、電滲及離子強度多種因素的影響。,（三）聚丙烯酰胺凝膠電泳,聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）

58、是以聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質(zhì)的一種電泳方法。聚丙烯酰胺凝膠具有機械強度好，有彈性，透明，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，對pH和溫度變化小，沒有吸附和電滲作用小的特點，是一種很好的電泳支持介質(zhì)。 聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺單體（acrylamide，簡稱Acr）和交聯(lián)劑N，N-甲叉雙丙烯酰胺（methylane bisacrylamide，簡稱Bis）在催化劑作用下合成的。 聚丙烯酰胺凝膠電泳按原理和操作形式的不同，主要有不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，聚丙烯酰胺凝膠等電聚焦電泳，雙向電泳等類型。,丙烯酰胺,N, N-甲叉 雙丙烯酰胺,聚丙烯酰胺,1. 聚丙烯酰胺凝膠的制備,聚丙烯酰胺凝膠聚合為自由基聚合，其催化體系有兩種： 1.化學(xué)聚合 化學(xué)聚合的催化劑（引發(fā)劑）通常采用過硫酸銨（ammonium persulfate，Ap），此外還需要加速劑TEMED（N，N，N，N-四甲基乙二胺），它能以自由基的形式存在。微量TEMED的加入，可促使過硫酸銨形成自由基： S2O82- 2SO4- 這些自由基的產(chǎn)生可引發(fā)丙烯酰胺與甲叉雙丙烯酰胺的聚合、交聯(lián)反應(yīng)，形成有一定平均孔徑的聚丙烯酰胺。,2.光聚合,光聚合通常用核黃素為催化劑，核黃素經(jīng)光照形成無色基，