1、五 高效液相色譜分析,高效液相色譜法的出現(xiàn)、儀器及特點 高效液相色譜儀器結(jié)構(gòu) 高效液相色譜基本原理 高效液相色譜固定相和流動相 高效液相色譜梯度洗脫技術(shù) 高效液相色譜類型簡介,高效液相色譜法的出現(xiàn),由于氣相色譜只能分析M1000、高沸點、難揮發(fā)、熱穩(wěn)定差的樣品就無能為力了，隨著工業(yè)生產(chǎn)的需要，高效液相色譜的研究成為一個迫切課題。 液相色譜法開始階段是用大直徑的玻璃管柱在室溫和常壓下用液位差輸送流動相，稱為經(jīng)典液相色譜法，此方法柱效低、時間長（常有幾個小時）。 在經(jīng)典液相色譜法的基礎(chǔ)上，于60年代后期，氣相色譜理論迅速發(fā)展以及高壓泵的研制成功，為高效液相色譜的發(fā)展奠定了基礎(chǔ)，高效液相色譜又稱高壓

2、液相色譜法(HPLC)，也稱現(xiàn)代液相色譜。 Stein和Moore獲得了1972年的諾貝爾化學(xué)獎 （研制出氨基酸分析儀 ）,返回,高效液相色譜儀舉例,高效液相色譜法的特點,與經(jīng)典液相色譜比較（四高） ： 高壓： 壓力可達(dá)150300Kg/cm2。 高速： 流速為 0.110.0 mL/min。 高效： 可達(dá)5000塊塔板/米。在一根柱中同時分離成份可達(dá)100種。 高靈敏度：紫外檢測器靈敏度可達(dá)0.01ng(1ng=109g)。同時消耗樣品少。 如用LichrosorbODS色譜柱，采用梯度洗脫，可在不到0.5h內(nèi)分離出尿中104個組分.,與氣相色譜相比,高沸點、熱不穩(wěn)定有機化合物及生化試樣的高

3、效分離分析方法。 （l)氣相色譜法分析對象只限于分析氣體和沸點較低的化合物，它們僅占有機物總數(shù)的20。對于占有機物總數(shù)近80的那些高沸點、熱穩(wěn)定性差、摩爾質(zhì)量大的物質(zhì)，目前主要采用高效液相色譜法進(jìn)行分離和分析。 (2)氣相色譜采用流動相是惰性氣體，它對組分沒有親和力，即不產(chǎn)生相互作用力，僅起運載作用。而高效液相色譜法中流動相可選用不同極性的液體，選擇余地大，它對組分可產(chǎn)生一定親和力，并參與固定相對組分作用的劇烈競爭。因此，流動相對分離起很大作用，相當(dāng)于增加了一個控制和改進(jìn)分離條件的參數(shù)，這為選擇最佳分離條件提供了極大方便。 （3）氣相色譜一般都在較高溫度下進(jìn)行的，而高效液相色譜法則經(jīng)?？稍谑覝?/p>

4、條件下工作。,5-2高效液相色譜儀器結(jié)構(gòu),色譜儀器的流程由液體流動相的輸液系統(tǒng)、進(jìn)樣系統(tǒng)、分離系統(tǒng)、檢測系統(tǒng)、信號放大記錄系統(tǒng)組成，其中高壓泵、色譜柱和檢測系統(tǒng)是高效液相色譜的主要部件。,返回,輸液系統(tǒng),包括流動相儲液瓶、過濾器、脫氣裝置、高壓泵、壓力脈動阻尼器、梯度洗脫裝置等部件組成,返回,脫氣裝置,脫氣就是驅(qū)除溶解在溶劑中的氣體。(1)脫氣是為了防止流動相從高壓柱內(nèi)流出時，釋放出氣泡。這些氣泡進(jìn)入檢測器后會使噪聲劇增，甚至不能正常檢測。(2)溶解氧會與某些流動相與固定相作用，破壞它們的正常功能。對水及極性溶劑的脫氣尤為重要，因為氧在其中的溶解度較大。 常用的脫氣方法有： 低壓脫氣法：電磁攪

5、拌、水泵抽空，可同時加溫或向溶劑吹氮。由于抽空或加熱過程中可能引起流動相中低沸點溶劑的揮發(fā)而影響其組成，此法不適于二元以上溶劑組成的流動相脫氣。 吹氦脫氣法：氦氣經(jīng)由一圓筒過濾器通入沖洗劑中，在0.5公斤厘米壓力下保持1015分鐘，氦氣的小氣泡可將溶于流動相中的空氣帶出，此法簡單方便，適用于所有沖洗劑脫氣，但由于氦氣價格昂貴，在國內(nèi)尚難于普及。 超聲波脫氣法：將溶劑儲液瓶置于超聲波清洗槽中，以水為介質(zhì)超聲脫氣。一般500ml溶劑約需超聲2030min即可達(dá)到驅(qū)氣目的。此法方便，不影響溶劑組成，并適用于各種溶劑，目前國內(nèi)使用較為普遍。,返回,高壓泵,目前高效液相色譜使用的高壓泵分為恒壓和恒流泵，

6、恒流泵使輸出的液體流量穩(wěn)定，而恒壓泵則使輸出的液體壓力穩(wěn)定。恒流泵中有往復(fù)泵、累積型往復(fù)泵、注射泵，恒壓泵有氣動放大泵。各種高壓泵均具有以下性能： (1) 泵體材料能耐化學(xué)腐蝕。通常使用普通耐酸不銹鋼或優(yōu)質(zhì)耐酸不銹鋼。 (2) 能在高壓下連續(xù)上作。通常要求耐壓4050MPacm-2，能在824h連續(xù)上作，壓力平穩(wěn)。 (3) 輸出流量范圍寬。一般在0.0110mL/min。 (4) 輸出流量穩(wěn)定可調(diào)。高效液相色譜使用的檢測器，大多數(shù)對流量變化敏感，高壓輸液泵應(yīng)提供無脈沖流量。這樣可以降低基線噪聲并獲較好的檢測下限，流量控制的精密度應(yīng)小于1，最好為0.5，重復(fù)性最好為0.5。,返回,往復(fù)泵,往復(fù)泵

7、有兩類，一種是活塞式，另一種是隔膜式,形成脈沖式供液,返回,累積型往復(fù)泵,累積型往復(fù)泵有兩個泵頭，以串聯(lián)方式連接在一起，這樣可以提供平穩(wěn)的液流。所以如此是因為兩級泵腔排液體積不同，第一級泵腔是第二級泵控的一倍,1-高壓流動相出口；2-二級活塞；3-一級活塞；4-流動相,返回,注射泵,注射泵類似于注射器，用一臺步進(jìn)電機驅(qū)動注射泵的活塞把液流從泵腔中擠出泵腔體積較大(250500mL)，密封性好的活塞把泵腔中的液體等速流出.,1-電機；2-渦輪；3-螺旋；4-螺桿；5-活塞；6-至色譜柱,返回,氣動放大泵,氣動放大泵是利用氣體為動力源 。適合于液相色譜柱的裝填，近代的液相色譜儀不用這種泵。,1-接

8、色譜柱；2-流動相入口；3-高壓氣入口；4-氣體放空,返回,梯度洗脫裝置,外梯度: 將兩種不同極性的溶劑按一定的比例送入混合室，用高壓輸液泵混合液輸入色譜柱。,內(nèi)梯度: 一臺高壓泵, 通過比例調(diào)節(jié)閥，將兩種或多種不同極性的溶劑按一定的比例抽入高壓泵中混合。,進(jìn)樣系統(tǒng),通常使用耐高壓的六通閥進(jìn)樣裝置和自動進(jìn)樣系統(tǒng)。分部分進(jìn)樣和整體進(jìn)樣。,返回,自動進(jìn)樣系統(tǒng),分離系統(tǒng)-色譜柱,柱材料及規(guī)格 柱連接方式 柱溫控制 柱填充技術(shù),返回,柱材料及規(guī)格,柱體為直型不銹鋼管，內(nèi)徑16mm，柱長1050cm。發(fā)展趨勢是減小填料粒度和柱徑提高柱效。 采用直形柱管，標(biāo)準(zhǔn)填充柱柱管內(nèi)徑為4.6mm或3.9mm，長10

9、50cm，填料粒度510m時，柱效達(dá)500010000塊/m理論塔板數(shù)。,返回,柱連接方式,柱接頭通過過濾片與色譜柱管連接。在色譜柱管的上下兩端要安裝過濾片，過濾片一般用多孔不銹鋼燒結(jié)材料，此燒結(jié)片上的孔徑小于填料顆粒直徑，卻可讓流動相順利通過，并可阻擋流動相中的極小的機械雜質(zhì)以保護(hù)色譜柱。,返回,柱溫控制,以下幾種情況需精確控制柱溫： （1）在一些法定標(biāo)準(zhǔn)分析方法中，要求保留時間具有再現(xiàn)性。 （2）必須通過改變柱溫來提高分離效率。 （3）對高分子化合物或粘度大的樣品，柱溫必須高于室溫。 （4）具有生物活性的生物分子，要求分析時柱溫應(yīng)低于室溫。 （5）對某些組成復(fù)雜的樣品，在單一色譜柱不能實現(xiàn)

10、完全分離，需要使用二維色譜技術(shù)，利用柱切換，使兩根色譜柱在不同柱溫下操作，以實現(xiàn)多組分的完全分離。,返回,柱填充技術(shù),填充色譜柱的方法，根據(jù)固定相微粒的大小有干法和濕法兩種。微粒大于20m的可用干法填充，要邊填充邊敲打和震動，要填得均勻扎實。直徑10m以下的微粒，不能用干法填充，必須采用濕法。 干法裝柱與氣相色譜法相似。 濕法裝柱又稱等密度勻槳裝填法。,返回,濕法裝柱,常用對二氧六環(huán)和四氯化碳，或叫氯乙烯和四溴乙烷等溶劑，根據(jù)固定相的密度不同，采用不同的溶劑比例，配成密度與固定相相似的混合液為勻漿劑。,1-頂替液槽；2-高壓泵；3-壓力表；4-三通閥；5-勻漿罐；6-色譜柱；7-廢液槽,返回,

11、檢測系統(tǒng),高效液相色譜檢測器按適用性分為選擇性檢測器和通用型檢測器。 紫外和紫外-可見分光光度檢測器 示差折光檢測器 熒光檢測器 電化學(xué)檢測器,返回,紫外和紫外-可見分光光度檢測器,檢測原理： 紫外及紫外可見光吸收光度檢測器相當(dāng)于一臺吸收光度計，在高效液相色譜儀的流通池內(nèi)樣品的濃度與吸光度的關(guān)系遵循Beer定律： A=log(I0/I)=bc 式中：A為吸光度，I0為入射光強度，I為透射光強度，是樣品的摩爾吸光度，b為流通池的光程長度，c為樣品濃度。,示差折光檢測器,檢測器原理： 示差折光檢測器是通過連續(xù)監(jiān)測流動相的折光指數(shù)變化來測定樣品的濃度。各種物質(zhì)都具有不同的折射率,溶液的折射率是溶劑(

12、洗脫劑)和溶質(zhì)(待測組分)各自的折射率乘以各自的摩爾濃度之和。設(shè)溶液的折射率為n，則: 式中c1和c2為溶劑和溶質(zhì)的摩爾分?jǐn)?shù)，c1+c2=1；n1和n2為溶劑和溶質(zhì)的折光指數(shù)。,熒光檢測器,檢測原理： 當(dāng)某些溶液受紫外光照射后，能吸收紫外光線而處于不穩(wěn)定的激發(fā)狀態(tài)，緊接著輻射出比紫外光波更長的光線，即熒光。在被測溶質(zhì)濃度較低時，溶質(zhì)受激發(fā)而發(fā)生的熒光強度與被測溶質(zhì)的濃度成正比關(guān)系。,儀器結(jié)構(gòu),高靈敏度、高選擇性； 對多環(huán)芳烴，維生素B、黃曲霉素、卟啉類化合物、農(nóng)藥、藥物、氨基酸、甾類化合物等有響應(yīng)；,返回,電化學(xué)檢測器,電化學(xué)檢測器是根據(jù)電化學(xué)分析方法而設(shè)計的檢測器。主要有兩種類型：一種是根據(jù)

13、溶液的導(dǎo)電性質(zhì)，通過測定流經(jīng)檢測器的離子溶液電導(dǎo)率的大小來測量離子濃度，此類檢測器是高效離子色譜采用的主要檢測器；另一類是根據(jù)化合物在電解池中工作電極上發(fā)生的氧化-還原反應(yīng)，通過測量電位、電流和電量來確定化合物在溶液中的濃度。,返回,5-3高效液相色譜基本原理,表征液相色譜柱填充性能的重要參數(shù) 總孔率、柱壓力降和柱滲透率 高效液相色譜塔板理論 高效液相色譜的速率理論,返回,總孔率,式中：F流動相的體積流速，cm3s； u流動相的平均線速，cm/s; r一柱內(nèi)徑的半徑，cm; tM柱的死時間； L柱長，cm； V色譜柱的空體積，cm3。 T表達(dá)了色譜柱填料的多孔性能，當(dāng)使用全多孔硅膠固定相時，T

14、約為0.85，使用非多孔的玻璃微珠(或硅膠)固定相時，T約為0.40，可認(rèn)為是柱中顆粒之間的孔率，用表示。,返回,柱壓力降,式中 一流動相的粘度，MPas; k0色譜柱的比滲透系數(shù)； dp固定相顆較直徑，m； 色譜柱的阻抗因子； P1、P0色譜柱的入口壓力和出口壓力，MPa。,返回,柱滲透率,柱滲透率KF ：表示流動相通過柱子的難易程度。在高效液相色譜法中，由于使用液體流動相，其粘度大于氣體流動相，且固定相粒度又小，為保證柱子在較低壓力下正常操作，總希望柱滲透率要大。,返回,高效液相色譜的速率理論,其中：Cd為填充系數(shù)，為一常數(shù)； Cm是容量因子k的函數(shù)，為一常數(shù)，其值取決于柱直徑、形狀和填充

15、狀況，當(dāng)柱填充均勻緊密時，其值下降； Csm是與固定相顆粒微孔中被流動相所占據(jù)部分的分?jǐn)?shù)以及容量因子k有關(guān)，為一常數(shù)； Cs是與容量因子k有關(guān)的常數(shù)； Dm為組分在流動相中的擴散系數(shù)，比氣相擴散系數(shù)小45個數(shù)量級； Ds為組分分子在固定液內(nèi)的擴散系數(shù)；,返回,5-4 高效液相色譜流動相,一、液相色譜的流動相 流動相特性 流動相類別 流動相選擇 選擇流動相時應(yīng)注意的幾個問題,返回,（1）液相色譜的流動相又稱為：淋洗液，洗脫劑。流動相組成改變，極性改變，可顯著改變組分分離狀況。 （2）親水性固定液常采用疏水性流動相，即流動相的極性小于固定相的極性，稱為正相液-液色譜法，極性柱也稱正相柱。 （3）若

16、流動相的極性大于固定液的極性，則稱為反相液-液色譜，非極性柱也稱為反相柱。 組分在兩種類型分離柱上的出峰順序相反。,流動相的特性,返回,流動相類別,按流動相組成分：單組分和多組分； 按極性分：極性、弱極性、非極性； 按使用方式分：等度淋洗和梯度淋洗。 常用溶劑： 己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、 乙腈、水。 采用二元或多元組合溶劑作為流動相可以靈活調(diào)節(jié)流動相的極性或增加選擇性，以改進(jìn)分離或調(diào)整出峰時間。,流動相選擇,在選擇溶劑時，溶劑的極性是選擇的重要依據(jù)。 采用正相液-液分配分離時：首先選擇中等極性溶劑，若組分的保留時間太短，降低溶劑極性，反之增加。 也可在低極性溶劑中，逐漸增加其中的

17、極性溶劑，使保留時間縮短。 常用溶劑的極性順序： 水(最大) 甲酰胺 乙腈 甲醇 乙醇 丙醇 丙酮 二氧六環(huán) 四氫呋喃 甲乙酮 正丁醇 乙酸乙酯 乙醚 異丙醚 二氯甲烷氯仿溴乙烷苯四氯化碳二硫化碳環(huán)己烷己烷煤油(最小),返回,選擇流動相時應(yīng)注意的幾個問題,（1）盡量使用高純度試劑作流動相，防止微量雜質(zhì)長期累積損壞色譜柱和使檢測器噪聲增加。 （2）避免流動相與固定相發(fā)生作用而使柱效下降或損壞柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶劑破壞氧化鋁固定相等。 （3）試樣在流動相中應(yīng)有適宜的溶解度，防止產(chǎn)生沉淀并在柱中沉積。 （4）流動相同時還應(yīng)滿足檢測器的要求。當(dāng)使用紫外檢測器時，流動相不應(yīng)有紫外吸收。,返回

18、,5-5 高效液相色譜梯度洗脫技術(shù),一、單一洗脫劑： 二、等度洗脫：流動相的k值恒定 三、梯度洗脫：改變流動相的k值 梯度變化速率 梯度范圍,返回,等度洗脫,返回,梯度變化速率,返回,梯度范圍,是指兩種流動相起止百分比之差。 如（起）80%水：20%甲醇20%水：80%甲醇（止） 初始的試探性實驗可進(jìn)行一次全范圍梯度(即5100B)。B是指甲醇或乙腈等。,返回,5-6 高效液相色譜類型簡介,液-固吸附色譜 液-液分配色譜 離子交換色譜 離子色譜 排阻色譜 親和色譜 高效液相色譜分離方法的選擇,返回,液-固吸附色譜,固定相：固體吸附劑為，如硅膠、氧化鋁等，較常使用的是510m的硅膠吸附劑； 流動

19、相：各種不同極性的一元或多元溶劑。 基本原理：組分在固定相吸附劑上的吸附與解吸； 適用于分離相對分子質(zhì)量中等的油溶性試樣，對具有官能團(tuán)的化合物和異構(gòu)體有較高選擇性。 缺點：非線形等溫吸附常引起峰的拖尾。,返回,液-液分配色譜,固定相與流動相均為液體（互不相溶）； 基本原理：組分在固定相和流動相上的分配； 流動相：對于親水性固定液，采用疏水性流動相，即流動相的極性小于固定液的極性（正相色譜），反之，流動相的極性大于固定液的極性（反相色譜）。正相與反相的出峰順序相反； 固定相：早期涂漬固定液，固定液流失較多，較少采用； 化學(xué)鍵合固定相：（將各種不同基團(tuán)通過化學(xué)反應(yīng)鍵合到硅膠（擔(dān)體）表面的游離羥基上

20、。C-18柱（反相柱）。,返回,正相高效液相色譜,正相高效液相色譜是指以親水性的填料作固定相(如在硅膠上鍵合羥基、氨基或氰基的極性固定相)，以疏水性溶劑或混合物作流動相(如己烷)的液相色譜。在液相色譜發(fā)展的早期，類似于氣相色譜把含羥基、氨基或氰基的極性固定相涂漬在硅膠上這樣容易被流動相沖洗掉，現(xiàn)在幾乎都使用鍵合固定相了。,返回,反相高效液相色譜,反相高效液相色譜是指以強疏水性的填料作固定相、以可以和水混溶的有機溶劑做流動相的液相色譜。如在硅膠上鍵合C18或C8烷基的非極性固定相，以極性強的水、甲醇、乙腈作流動相的高效液相色譜。,返回,返回,正、反相色譜中極性和保留時間的關(guān)系,返回,化學(xué)鍵合固定

21、相是通過化學(xué)反應(yīng)將有機分子鍵合在載體表面所形成的柱填充劑，具有穩(wěn)定、流失小、適于梯度淋洗等特點。這種固定相分離機理既不是簡單的吸附，也不是單一的液液分配，而是二者兼而有之?；瘜W(xué)鍵合的表面覆蓋度決定哪種機理起主要作用。對多數(shù)鍵合相來說，以分配機理為主。 通常，化學(xué)鍵合相的載體主要是硅膠（表面有硅醇基）： Si-O-R：對熱不穩(wěn)定、遇水、乙醇等強極性會水解，使酯鏈斷裂，因此只適于 以不含水或醇的流動相。 Si-R(或Si-N)：不水解，熱穩(wěn)定性比硅酸脂好。但所用的格氏反應(yīng)不方便。使 用水溶液作流動相時，其pH應(yīng)在4-8之間。 Si-O-Si-R：不水解，熱穩(wěn)定性好，在pH2-8范圍內(nèi)對水穩(wěn)定。,化

22、學(xué)鍵合固定相,返回,離子交換色譜,固定相：陰離子離子交換樹脂或陽離子離子交換樹脂； 流動相：陰離子離子交換樹脂作固定相，采用酸性水溶液；陽離子離子交換樹脂作固定相，采用堿性水溶液； 基本原理：組分在固定相上發(fā)生的反復(fù)離子交換反應(yīng)；組分與離子交換劑之間親和力的大小與離子半徑、電荷、存在形式等有關(guān)。親和力大，保留時間長； 陽離子交換：RSO3H +M+ = RSO3 M + H + 陰離子交換：RNR4OH +X- = RNR4 X + OH- 應(yīng)用：離子及可離解的化合物，氨基酸、核酸等。,返回,固定相,按固定相制作方法可分為： 多孔型離子交換樹脂(包括微孔型和大孔型)； 表面多孔型(包括薄膜型)離子