1、熒光分析法簡述,指導教師：趙成國,一 、概 述 什么是熒光呢？當某些物質(zhì)被光照射后， 它會吸收一定頻率的光，而發(fā)射出波長更長的 光，當光停止時，發(fā)射光也隨即消失，這就是 熒光現(xiàn)象，它發(fā)出的光就叫熒光。第一次發(fā)現(xiàn) 熒光現(xiàn)象的是16世紀西班牙的內(nèi)科醫(yī)生和植物 學家莫納德斯 （N.Monardes）, 在一種木頭 切片的水溶液中，看到了極為可愛的天藍色， 以此開始了熒光研究。,直到1852年在考察奎寧和葉綠素的熒光時，用分光計觀察到其熒光的波長比入射光的波長稍長些，才判明這種現(xiàn)象是這些物質(zhì)在吸收光能后重新發(fā)射不同波長的光，而不是由光的漫射作用所引起的，才確立了熒光是光發(fā)射的概念。到19世紀末人們已經(jīng)

2、知道了包括熒光素、曙紅、多環(huán)芳烴等600種以上的熒光物質(zhì)。,20世紀以來，熒光現(xiàn)象被研究得更多了，發(fā)現(xiàn)了共振熒光、增感熒光，能夠進行熒光產(chǎn)率得絕對測定，還進行了熒光壽命的直接測定等等。,二、熒光發(fā)生機理,當一些物質(zhì)被光照射后，物質(zhì)的分子吸收光以后，便以基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，成為激發(fā)分子，然后通過相互碰撞或和其它溶劑分子碰撞等去活化的過程而消耗了能量，回到第一激發(fā)態(tài)的最低振動能級，這種躍遷稱為無輻射躍遷，它不會發(fā)光。當電子由激發(fā)態(tài)的最低振動能級躍遷回基態(tài)的不同振動能級時，則以熒光的形態(tài)發(fā)出能量。,1. 激 發(fā) 通常在室溫下物質(zhì)分子 大部分處于基態(tài)的最低振動 能級（ =0）。當電子吸 收一定頻率的電磁

3、輻射發(fā)生 能級躍遷時，可上升至不同 激發(fā)態(tài)的各振動能級，其中 大部分分子上升至第一激發(fā) 單重態(tài)（ S1 ），這一過程 稱為激發(fā)。,2.去活化過程 處于激發(fā)態(tài)的分子是不穩(wěn)定，它可以通過 不同的途徑回到基態(tài)，這一過程稱為去活化。 去活化過程有以下幾種： （1）振動馳豫 溶液中分子間碰撞機會很 多，通過碰撞溶質(zhì)分子將過剩的能量轉(zhuǎn)移給溶 劑分子，通過非輻射躍遷而降至同一能態(tài)的最 低振動能級，這一過程稱為振動馳豫。,（2）內(nèi)部轉(zhuǎn)換 同一多重態(tài)的不同電子能級間可能發(fā)生內(nèi)部轉(zhuǎn)換。 S2 S1或T2 T1 條件：當S2較低振動能級與S1較高振動能級的能量相當，且發(fā)生重疊時分子才有可能S2 S1或T2 T1,（

4、3）熒光發(fā)射 處于第一激發(fā)的 最低振動能級的分 子，躍遷回基態(tài)的 各振動能級，這一 過程稱為熒光發(fā)射。,（4）體系間跨越躍遷 分子從激發(fā)單重態(tài)轉(zhuǎn)至能量較低的激發(fā)三重態(tài)的過程，稱體系間跨越躍遷。 三重態(tài)：電子自旋方向相同 單重態(tài): 電子自旋方向相反 這些分子從第一激發(fā)三重態(tài)的最低振動能級下降至第一基態(tài)的各振動能級，所發(fā)出的輻射即為磷光。,1.激發(fā)光譜和發(fā)射光譜 任何熒光化合物都有兩個特征性光譜：激 發(fā)光譜和發(fā)射光譜 （1）激發(fā)光譜 繪制激發(fā)光譜時，固定熒光的最大發(fā)射波 長，然后改變激發(fā)光的波長，所測得的熒光強 度與激發(fā)波長的譜線關(guān)系即為激發(fā)光譜。,三、熒光的特性,（2）發(fā)射光譜 發(fā)射光譜簡稱熒光

5、光譜。繪制發(fā)射光譜 時，固定熒光的最大激發(fā)波長，然后改變發(fā)射 光的波長，所測得的熒光強度與發(fā)射波長的譜 線關(guān)系即為發(fā)射光譜。,2.熒光光譜形狀與激發(fā)波長無關(guān) 由于分子無論被激發(fā)到高于S1哪一個激發(fā) 態(tài)，都經(jīng)過無輻射的振動馳豫或內(nèi)部轉(zhuǎn)換等過 程，最終回到S1態(tài)的最低振動能級，然后躍遷 回基態(tài)產(chǎn)生熒光。,3.吸收光譜和熒光光譜有很好的鏡像關(guān)系 由于分子的S0態(tài)和S1態(tài)中各振動能級的能量分 布情況相似決定的。因此吸收光譜和發(fā)射光譜的形 狀相似。,蒽的吸收光譜和發(fā)射光譜, 吸收光譜 發(fā)射光譜,四、熒光與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系,（）發(fā)光分子中要具有共軛鍵體系 共軛的程度越大，電子越容易激發(fā)，分子 放光越容易產(chǎn)生

6、。,（2）具有剛性平面結(jié)構(gòu)分子有利于熒光發(fā)射 分子的共平面越大，其電子的共軛程度越大。如熒光素和酚酞結(jié)構(gòu)十分相似，熒光素有很強的熒光，而酚酞沒有，這是由于熒光素有剛性平面結(jié)構(gòu)，減少了分子振動，減少了去活化的概率。,（3）取代基的作用,給電子基增強熒光: OH, NH2,NHR, NR2,CN,吸電子基減弱熒光：Br , Cl , NO2, NN, COOH,五、影響熒光強度的因素,1.熒光的減退 熒光物質(zhì)經(jīng)紫外線長時間照射及空氣的氧化 作用，會使熒光逐漸減退。,2.熒光強度與溶液濃度的關(guān)系 在稀溶液中： FKc F 為熒光強度 K檢測效率（由儀器決定） c 為液體的濃度,F,c,高濃度時，熒光

7、物質(zhì)發(fā)生熄滅和自吸收現(xiàn)象，使F與c不呈線性關(guān)系,3.溫度的影響 溫度對熒光強度的影響較敏感。溶液溫度 下降時，介質(zhì)的粘度增大，熒光物質(zhì)與分子的 碰撞也隨之減少，去活化過程也減少，則熒光 強度增加。相反，隨著溫度上升，熒光物質(zhì)與 分子的碰撞頻率增加，使去活化幾率增加，則 熒光強度下降。,帶有酸性或堿性官能團的大多數(shù)芳香族化 合物的熒光一般都與溶液PH值有關(guān)，例如：在 pH=712的溶液中苯胺以分子形式存在，會發(fā)出 藍色熒光；而在pH13的溶液中苯胺以離 子形式存在，都不會發(fā)出熒光。同時所用酸的種 類也影響熒光的強度，例如：奎寧在硫酸溶液中 的熒光比在鹽酸中的要強。,4. pH的影響,許多有機物及

8、金屬的有機絡合物，在乙醇 溶液中的熒光比在水溶液中強。乙醇、甘油、 丙酮、氯仿及苯都是常用的有機溶劑，其中大 多有熒光，應設法避免；一般避免的辦法是稀 釋，或加入一部分水。,5.溶 劑,6.熒光強度達到最高點所需要的時間不同，有 的反應加入試劑后熒光強度立即達到最高峰。有 的反應需要經(jīng)過1530分鐘才能達到最高峰。,7.有機溶劑中常有產(chǎn)生熒光的雜質(zhì)，可用蒸餾法提純。橡皮塞、軟木塞及濾紙中也常有能溶于溶劑的一些帶熒光的物質(zhì)。,包括有光源、單色器、樣品池、檢測器和記錄顯示裝置五個部分。,六、熒光分析儀器的基本組成部件,激發(fā)光源應具有足夠的強度、適用波長范圍 寬、穩(wěn)定等特點。常用的光源有高壓汞燈和氙

9、弧 燈。 氙弧燈又稱氙燈，是目前熒光分光分度計中 應用最廣泛的一種光源。它是一種短弧氣體放電 燈，外套為石英，內(nèi)充氙氣，光強度大氙燈的燈 內(nèi)氣壓高，啟動時的電壓高（2040KV）,因此使 用時一定要注意安全。,1. 激發(fā)光源,熒光分析儀中應用最多的單色器為光柵單色器 單色器有兩塊： 第一塊為激發(fā)單色器，用于選擇激發(fā)光的波長； 第二塊為發(fā)射單色器，用于選擇熒光發(fā)射波長。 一般后者的光柵閃耀波長比前者來得長一些。 第一濾光片用以分離出所需用的激發(fā)光，第二濾 光片用以濾去雜散光、拉曼光和雜質(zhì)所發(fā)射的熒光。,2. 單色器,熒光分析的比色皿通常用石英材料做成，熒光比色皿四面均為磨光透明面，同時一般僅有一

10、種厚度為1cm的液池。,3.樣品池,4. 檢 測 器,熒光計多采用光電倍增管進行檢測。檢測器的方向應與激發(fā)光的方向成直角，以消除樣品池中透射光和雜散光的干擾。,5. 記錄、顯示裝置,熒光儀的讀出裝置有數(shù)字電壓表或記錄儀?，F(xiàn)代儀器都配上計算機，進行自動控制和顯示熒光光譜及各種參數(shù)。,熒光分析儀,光源,樣本池,第一（激發(fā)） 單色器,第二（發(fā)射）單色器,檢驗器,顯示、記錄裝置,七、熒光測定方法,1.標準曲線法 將已知量的標準物經(jīng)過與試樣相同的處理 后，配成一定濃度的標準溶液，并測定他們的 熒光強度，繪制一條以熒光強度和標準溶液濃 度的標準曲線，然后測定未知樣的濃度。,（2）熒光猝滅法 在一般熒光分析

11、中，熒光的猝滅現(xiàn)象是不 可避免的，但是我們可以利用猝滅現(xiàn)象，進行 熒光分析。例如一物質(zhì)本身不會發(fā)光，也不會 與其它物質(zhì)形成熒光物質(zhì)，但它會使另外一種 會發(fā)射熒光的物質(zhì)熒光強度降低，熒光強度的 下降程度與該物質(zhì)的濃度成比例，此法成為熒 光猝滅法。,1.特 點 靈敏度高：測定下限0.10.001 gmL-1,比分光光度法高24個數(shù)量級. 儀器設備相對簡單、 體積小 操作較簡便 反應時間也較快,八、熒光分析法的特點及應用,生物化學分析、生理醫(yī)學研究、臨床檢測 （1)直接測定能產(chǎn)生熒光的物質(zhì) 帶苯環(huán) 的氨基酸：色氨酸、酪氨酸、苯基丙氨酸 (2)測定能與熒光試劑反應生成熒光化合物的 物質(zhì) 熒光生色團標記

12、蛋白質(zhì)，研究蛋白質(zhì) 的結(jié)構(gòu)；致癌物同核酸結(jié)合常引起顯著的熒光 (3)熒光熄滅法測定猝滅劑,2.熒光光度法的應用,實驗一 熒光法測定醫(yī)用維生素B2中核黃素的含量,1.學習和掌握熒光光度分析法的基本原理和方法 2.學會使用熒光分光度計,一、實驗目的：,核黃素易溶于水而不溶于乙醚等有機溶劑，在中性或酸性溶液中穩(wěn)定，光照易分解，對熱穩(wěn)定。核黃素在堿性溶液中經(jīng)光線照射會發(fā)生分解而轉(zhuǎn)化為光黃素，光黃素的熒光比核黃素的熒光強的多，故測核黃素時溶液要控制在酸性范圍內(nèi)，且在避光條件下進行。,二、實驗原理,化學名：7,8-二甲基10(2S,3S,4R) - 2,3,4,5-四羥基戊基苯并蝶啶-2,4（3H， 10

13、H）-二酮 分子式：C17H20N4O6 分子量：376.36,三、實驗儀器,RF-5301PC熒光光度計 日本島津公司,1.儀器介紹 擁有世界最高水平的S/N，可達到150以上。最適合高靈敏度、高分辨率測定。其主要參數(shù)和特點 測定范圍：220900nm 帶 寬：1.5、3、5、10、20nm 靈敏度：S/N150 測定方式：定性分析、同步光譜分析、定量分析、時間過程測定。,打開電腦和RF-5301系統(tǒng)的開關(guān)，點擊桌面的RF-5301的快捷圖標，啟動儀器的控制程序 從“Acquire Mode”菜單中選Spectrum光譜，進入光譜模式。,2.操作規(guī)程,從“Configure設置”菜單中選擇P

14、arameters參數(shù),若樣品激發(fā)光譜的發(fā)射波長或發(fā)射光譜的激 發(fā)波長未知，則在上述對話框中設置合適的激發(fā) 發(fā)射狹縫寬度，靈敏度，放置標樣，在光度計按 鍵中點擊 ，在彈出的對話框中選擇激發(fā)光 和發(fā)射光的范圍以及激發(fā)光的波長的間隔，點“Search”鍵，等待一段時間，由儀器給出 最優(yōu)波長。,掃描完成后出現(xiàn)的譜圖,定量分析的參數(shù)設置,設置激發(fā)發(fā)射光波長，激發(fā)發(fā)射狹縫寬度，靈敏度， 反應時間，單位，濃度以及強度范圍。,將裝有蒸餾水的樣品池放入池槽中，點擊“ ”自動回零。,將第一個標準樣品裝入池槽中，點擊 彈出如下對話框，輸入標準樣品的濃度,以此測完5個標準樣品后，屏幕上會 出現(xiàn)工作曲線，也會出現(xiàn)標準

15、曲線方程。,在工作曲線繪制完成后，可以定量測定未知樣的濃度，點擊 。然后將未知樣品放入池槽中，點擊 開始濃度的測定。,最后，在File菜單中選擇Save，儲存獲得的數(shù)據(jù),1. 10.0 gmL-1核黃素標準溶液的配制： 稱取0.01g核黃素置于50mL燒杯中，以 蒸餾水溶解后，定溶于1000mL容量瓶中，搖 勻，備用。,四、實驗試劑,1.配制系列標準溶液取4個 50 ml容量瓶，分別加入 1.00，2.00， 3.00，4.00 ml核黃素標準溶液，用水稀釋至刻度， 搖勻。 2.掃描核黃素的最大激發(fā)波長和發(fā)射波長 對核黃素標準溶液進行熒光掃描，根據(jù)激發(fā)光譜 曲線和發(fā)射光譜曲線，確定最大激發(fā)波長和最大發(fā)射 波長。,五、實驗步驟,3.標準曲線的繪制 根據(jù)上述核黃素標準溶液的熒光強度，繪制標準 曲線。,4.未知試樣的測定 取醫(yī)用維生素B2片劑1片，置于50mL燒杯中，加 少量蒸餾水溶解，定溶于1000ml容量瓶中，搖勻、備 用。,六、數(shù)據(jù)處理,2）核黃素標準溶液濃度及其熒光強度,4）計算藥片中核黃素的含量，用mg/片表示,3) 繪制核黃素的標準曲線,1）記錄核黃素的最大激發(fā)波長和最大發(fā)射波長,EX EM,在實驗中，拿比色杯要拿4個棱角，切