1、第四章 目的基因的獲取,目的基因：,準備要分離、改造、擴增或表達的基因。,結構基因的組成,轉錄啟動區(qū),核糖體識別區(qū),編碼區(qū),轉錄終止區(qū),起譯碼ATG,開讀框,休止碼TAG、TAA、TGA,目的基因的獲取方法,1、直接分離法,2、基因文庫分離法,3、PCR分離法,4、化學合成法,比較各種方法獲得目的基因的優(yōu)缺點,第一節(jié) 直接分離法,一、限制性內(nèi)切酶法,用限制性內(nèi)切酶把基因組DNA切成不同大小的片斷。,酶切,由于帶有粘性末端，產(chǎn)物可以直接與載體連接。,1. 優(yōu)點,2. 缺點,目的基因內(nèi)部也可能有該內(nèi)切酶的切點。目的基因也被切成碎片！,BamH I,BamH I,BamH I,gene,適合于從簡單

2、的基因組中分離目的基因,如質粒或病毒的大小只有幾千堿基,大的也超不過幾十萬堿基,編碼基因比較少,獲得也比較簡單.,應用對象,1、對已定序列的DNA分子，只需要用已知識別序列的限制性內(nèi)切酶進行一次或幾次切割，分離純化所需要的DNA片斷，與適當載體連接。 2、對已知定位的目的基因，只要根據(jù)目的基因兩側的已知的酶切識別位點，一次就可以獲得。 3、即使含目的基因的DNA分子未定序或定位，也只須通過酶切分析，隨后再通過部分酶切，構建一個簡單的基因文庫，從鉤出目的基因。,二、隨機片斷化,1. 限制性內(nèi)切酶局部消化法,控制內(nèi)切酶的用量和消化時間，使基因組中的酶切位點只有一部分被隨機切開。, 內(nèi)切酶識別位點的

3、堿基數(shù),影響所切出的產(chǎn)物的長度和隨機程度。,（1）限制性內(nèi)切酶的選用原則,1）4bp的內(nèi)切酶,平均每46（4096）bp一個切點。,2）6bp的內(nèi)切酶,平均每44（256）bp一個切點。,隨機程度高。如Hae、AluI、Sau3A。, 內(nèi)切酶粘性末端,能與常用克隆位點相連。,（Sau3ABamH I）,2. 機械切割法,（1）超聲波,超聲波強烈作用于DNA，可使其斷裂成約300bp的隨機片斷。,（2）高速攪拌,1500轉/分下攪拌30min，可產(chǎn)生約8kb的隨機片斷。,三、物理化學法,基本原理：DNA分子的兩條鏈存在著GC、AT堿基配對，其中GC間存在3個氫鍵、AT間存在2個氫鍵，如果不同基因

4、片段的堿基組成差異較大，其理化性質，如浮力密度和解鏈溫度等也明顯不同，采用相應的方法即可達到從生物基因組中分離目的基因的目的。,密度梯度離心法,非洲爪瞻5SDNA,單鏈酶解法,根據(jù)其熱穩(wěn)定,海膽DNA,目的基因的獲取方法,1、直接分離法,2、基因文庫分離法,3、PCR分離法,4、化學合成法,將某種生物細胞的整個基因組DNA切割成大小合適的片斷，并將所有這些片斷都與適當?shù)妮d體連接，引入相應的宿主細胞中保存和擴增。 理論上講，這些重組載體上帶有了該生物體的全部基因，稱為基因文庫。,一、基因文庫的構建,1. 基因文庫（gene library）,第二節(jié) 構建基因組文庫分離法,（2）目前常用的載體,2

5、. 構建基因文庫的載體選用,載體能夠容載的DNA片斷大小直接影響到構建完整的基因文庫所需要的重組子的數(shù)目。,載體容量越大，所要求的DNA片斷數(shù)目越少，所需的重組子越少。,（1）對載體的要求,載體系列： 容量為 36.451 kp cosmid載體： 容量為 45 kb YAC： 容量為 230kb-1700kb BAC: 容量為 300 kb,斷點完全隨機，片斷長度合適于載體連接。,（1）染色體DNA大片段的制備,3. 基因文庫構建的一般步驟,超聲波（300bp）或機械攪拌（8kb）。, 物理切割法：,內(nèi)切酶Sau3A進行局部消化。可得到10-30kb的隨機片斷。, 酶切法：,（2）載體與基因

6、組DNA大片段的連接, 粘性末端直接連接,載體與外源DNA大片段的兩個末端都有相同的粘性末端。,如：Sau3A與BamHI的酶切末端。,直接連接、人工接頭或同聚物加尾。,人工接頭法（adapter）,人工合成的限制性內(nèi)切酶粘性末端片斷。,各種酶的接頭可以向公司定做或購買。,接上人工接頭,粘性末端,CCC,CCC,末端轉移酶,粘性末端, 同聚物加尾,4. 基因組文庫的大小,一個文庫要包含99%的基因組DNA時所需要的克隆數(shù)目。,N=,ln (1-p),ln (1-f),p: 文庫包含了整個基因組DNA的概率（99%）,f: 插入載體的DNA片斷的平均長度占整個基因 組DNA的百分數(shù),N：所需的重

7、組載體數(shù)（克隆數(shù)）,例如：人的基因組是 3109 bp，插入DNA片斷的平均長度如果是1.7104 bp,N=,ln (1-p),ln (1-f),=,ln (1-99%),ln (1-f),=,4.61,G,f,N=,4.61,G,f,G：Genome大小；f：fragment大小,N=,4.61,G,f,=,4.61,3109,1.7104,= 8.1105,1. cDNA,以mRNA為模板逆轉錄出的DNA稱cDNA。,2. cDNA library,二、 cDNA文庫的構建,mRNA,cDNA,3,3,5,5,反轉錄酶,引物,利用某種生物的總mRNA合成cDNA，再將這些cDNA與載體連

8、接，轉入細菌細胞中進行保存和擴增，稱cDNA文庫。,（1）不含內(nèi)含子序列。 （2）可以在細菌中直接表達。 （3）包含了所有編碼蛋白質的基因。 （4）比DNA文庫小的多，容易構建。,4. 構建cDNA文庫的一般步驟,（1）總RNA（total RNA）提取,3. cDNA文庫的特點,提取總RNA有商業(yè)化的試劑盒（kit）。,分離mRNA用商業(yè)化的Oligo dT纖維柱。,利用mRNA都含有一段polyA尾巴，將mRNA從總RNA（rRNA、tRNA等）中分離純化。 mRNA只占總RNA的1%-2%。,（2）mRNA的分離純化, 原理, mRNA的分離純化,Column（柱）,反轉錄酶,（3）cD

9、NA的合成, cDNA第一鏈合成,逆轉錄酶能以RNA為模板合成cDNA。 用Oligo dT（或隨機引物）作引物，合成cDNA的第一鏈。,mRNA,cDNA,3,5,5,AAAAAAA,TTTTTTT,Oligo dT引物,用堿處理或用RNaseH降解mRNA-DNA雜交分子中的mRNA。,mRNA,cDNA,3,3,5,5,反轉錄酶,引物,mRNA,cDNA第一鏈,3,3,5,5,引物,cDNA第一鏈,3,5,引物, 降解mRNA模板,或RNaseH,堿,剩下的cDNA單鏈的3末端一般形成一個彎回來的雙鏈發(fā)卡結構（機理不明），可成為合成第二條cDNA鏈的引物。用DNA聚合酶合成第二鏈DNA.

10、。,cDNA第一鏈,5,cDNA第二鏈合成,DNA聚合酶,cDNA第一鏈,cDNA第二鏈,5,3, cDNA第二鏈合成,去掉發(fā)卡結構,核酸酶S1,用核酸酶S1可以切掉發(fā)卡結構（但這會導致cDNA中有用的序列被切掉?。?cDNA第一鏈,cDNA第二鏈,5,3,cDNA第一鏈,cDNA第二鏈,5,3,5,3,這種酶能識別mRNA-cDNA雜交分子中的mRNA，并將其降解成許多小片斷。,妙用RNaseH,小片斷正好成為DNA聚合酶的引物，用來合成岡崎片斷。,DNA Pol I除去引物并修補后再使用DNA連接酶連成一整條DNA鏈。,mRNA,cDNA,3,5,反轉錄酶,引物,mRNA,cDNA第一鏈

11、,3,5,引物,mRNA,cDNA第一鏈,3,5,mRNA,mRNA,DNA 聚合酶,DNA 聚合酶,cDNA第二鏈,cDNA第一鏈,3,5,RNaseH,DNA ligase,去引物,在雙鏈cDNA末端接上人工接頭，即可與載體連接，轉入受體菌。 或借助末端轉移酶給載體和雙鏈cDNA的3端分別加上幾個C或G，成為粘性末端。,5.cDNA與載體連接：,接上人工接頭,粘性末端,CCC,CCC,末端轉移酶,6. cDNA文庫的大小,一個cDNA文庫要包含99%的mRNA時所需要的克隆數(shù)目。,N=,ln (1-p),ln (1- ),p: 文庫包含了完整mRNA的概率（99%）,: 某一種低豐度（不足

12、14份拷貝）mRNA占細胞整個mRNA的比例,N：所需的重組載體數(shù)（克隆數(shù)）,1,n,1,n,7. cDNA文庫與基因組文庫相比的優(yōu)越性表現(xiàn)在,1、 cDNA文庫以mRNA為材料，特別適用于某些RNA病毒，例如流感病毒；因其不通過DNA中間體，所以研究其唯一的方法就是cDNA克隆。,2、 cDNA基因文庫的篩選比較簡單易行。,他的文庫所含的克隆數(shù)是基因文庫的十分之一，或更少。,3、由于每一個cDNA克隆都含有一種mRNA序列，這樣在目的基因的選擇中出現(xiàn)假陽性的概率比較低，而相比之下基因組文庫克隆的選擇較復雜，假陽性的概率就高。,4、 cDNA克隆可用于在細菌中能進行表達的基因克隆，直接應用于基

13、因工程操作。,原因是：高等真核生物與原核生物在結構組成上的最大區(qū)別是前者含有內(nèi)含子間隔序列，而后者沒有。通過基因文庫中篩選的目的基因難以在原核生物中表達。而cDNA是經(jīng)過轉錄后得來的其內(nèi)含子部分已被刪除。,5、 cDNA克隆還可以用于真核細胞mRNA的結構和功能的研究,一種特異的mRNA在細胞中往往占很小的比例，難以直接研究其序列、結構和功能。一般是通過比較基因組進行確定,8. cDNA文庫與基因組文庫相比的缺點,1、受材料來源的影響,2、遺傳信息量有限,3、 構建的cDNA文庫中高豐度的（含量） mRNA含量比低豐度的易得和分離，其實現(xiàn)在構建的cDNA基本上是高豐度的而低豐度的很少,三、文庫

14、的查詢（screening）,用目的基因探針與文庫中的重組載體進行Southern blot雜交。,文庫,載體,探針,電泳后雜交放射自顯影,測序分析,目的基因的獲取方法,1、直接分離法,2、基因文庫分離法,3、PCR分離法,4、化學合成法,第三節(jié) PCR擴增獲得目的基因,如果知道目的基因的全序列或其兩端的序列，通過合成一對與引物互補的引物，就可以十分有效的擴增出所需的目的基因。,省時,省力,1. 直接從基因組中擴增,（1）提取基因組DNA作模板,（2）根據(jù)目的基因序列設計引物,（3）PCR擴增,真核生物基因組含有內(nèi)含子！,適合擴增原核生物基因。,原核基因組部分,原核細胞,提取基因組DNA,PC

15、R擴增,（1）提取基因組 total RNA,（2）反轉錄合成總cDNA作模板,（4）PCR擴增,（3）根據(jù)目的基因序列設計引物,2. 從mRNA中擴增: RT-PCR,原核生物不易得到mRNA，也不含有polyA尾。,適合擴增真核生物基因。,目的基因 的引物1,反轉錄成目的基因cDNA第一鏈,目的基因 的引物2,目的 基因cDNA第二鏈,PCR,mRNA,值得注意的是常規(guī)PCR，可以合成的DNA片段長度有限，一般在1KB以內(nèi)，大于他擴增效果顯著下降。,？,未知序列的DNA,更長的DNA,特殊類型的PCR,1、套式PCR（nested PCR）,利用兩對引物，從一個模板的同一區(qū)域擴增出不同長度

16、而設計的特殊方法。他較常規(guī)PCR靈敏度大大提高，同時也能有較強的特異性。,2、不對稱PCR,利用引物濃度不同（50：1或100：1）-單鏈DNA，用作DNA序列分析的模板。,3、反向PCR,未知序列的一種PCR方法,條件為：此未知序列的某側序列必須已知,此外，還有錨定PCR，長程PCR，鍋柄PCR，等等,目的基因的獲取方法,1、直接分離法,2、基因文庫分離法,3、PCR分離法,4、化學合成法,1976年H.G. Khorana提出了用化學方法合成基因的設想，并于1979年在science上發(fā)表了率先成功地合成大腸桿菌酪氨酸t(yī)RNA基因的論文。,第四節(jié) 化學合成目的基因,一、目前常用的方法,磷酸

17、二酯法、,磷酸三酯法、,亞磷酸三酯法、,固相合成法,自動化合成法。, 保護dNTP的5端P 或3端-OH, 用酸或堿的脫保護,（1）原理,1. 磷酸二酯法, 帶保護的單核苷酸連接,保證合成反應的定向進行。,帶5保護的單核苷酸與帶3保護的另一個單核苷酸以磷酸二酯鍵連接起來。,具體做法：將一個大的保護基團，如芳香磺酰氯（ArSO2Cl）或二環(huán)己基碳二亞胺（DCC）加到脫氧核苷酸的3或5羥基上。這樣，具有5-保護的單核苷酸，便能夠通過它的5-OP同另一個3-保護的單核苷酸的3-OH之間定向地形成一個二酯鍵，從而使它們縮合成兩端都受保護的二核苷酸分子。,實驗中使用的各種不同的保護基團，有些可以通過酸處

18、理移去，有些可以通過堿處理移去。所以不論是5-的保護基團還是3-的保護基團，都可以通過酸或堿的脫保護作用而除掉。這樣的一個帶5-保護的合成的二核苷酸分子，又能夠同另一個帶3-保護的單核苷酸或二核苷酸進行第二次縮合反應，形成一個三核苷酸或四核苷酸分子。,原理與磷酸二酯法一樣。只是參加反應的單核苷酸都是在3端磷酸和5-OH上都先連接了一個保護基團。,2. 磷酸三酯法,將第一個核苷酸的3-OH端固定在固相支持物上。,固相磷酸三酯合成法,是目前通用的合成方法。,15,合成的二核苷酸連接處有三個酯鍵！,固相磷酸三酯合成過程,固相支持物,結果是全保護的DNA：5 DMT, 3固相支持物, 核苷酸之間對氯苯。最后脫保護,固相 支持物,固相 支持物,C,化學合成的DNA片斷一般在200bp以內(nèi)。,二、 化學合成DNA片斷的組裝,用T4多核苷酸激酶使各個片段的5端帶上磷酸。,1. 互補連接法,預先設計合成的片斷之間都有互補區(qū)域，不同片斷之間的互補區(qū)域能形成有斷點的完整雙鏈。,（2）5端磷酸化,（1）互補配對,（合成的DNA單鏈的5端是-OH）,T4 DNA連接酶,T4多核苷酸激酶,使5-OH磷酸化,完整的DNA雙鏈,（3）連接酶連成完整雙鏈,2. 互補延伸連接