1、上海市精品課程系列-生物化學,第四章RNA的生物合成,第四章 RNA的生物合成,4.1 概述,以DNA分子中一條鏈的部分片段為模板，按照堿基配對原則，按53方向合成出一條與模板DNA鏈互補的RNA分子的過程。,4.1 概述,轉錄的部位,真核生物：細胞核 原核生物：核質區(qū),核仁：rRNA 核質：mRNA，tRNA,原料：NTP 模板：DNA 酶：RNA聚合酶 其它蛋白質因子,參與轉錄的物質,4.1 概述,轉錄的反應,酶,模板,4.1 概述,不對稱轉錄：轉錄區(qū)只有一小段DNA的一條鏈作為模板鏈進行轉錄。,4.1 概述,模板鏈（反義鏈、負鏈）：可作為轉錄模板的DNA的一條鏈，與轉錄的RNA反義，編碼

2、鏈是針對某一基因而言。,編碼鏈（有義鏈、正鏈）：不參與轉錄的DNA的一條鏈，其序列與轉錄的RNA相同，只是編碼鏈中的T在RNA中為U。,4.1 概述,模板鏈不固定在DNA的某一條鏈上，而是兩條鏈中交互出現(xiàn)，使轉錄也交替出現(xiàn)。,轉錄單位：DNA鏈上從啟動子直到終止子為止的序列。一個轉錄單位包括一個或幾個基因。,4.1 概述,4.1 概述,4.2 原核生物RNA的合成,RNA聚合酶,特點,以DNA為模板 都以四種三磷酸核苷為底物和原料 都遵循DNA與RNA之間的堿基配對原則 RNA鏈的延長方向是53的連續(xù)合成 需要Mg2+或Mn2+離子 不需要引物 缺乏35外切酶活性,4.2 原核生物RNA的合成

3、,大腸桿菌RNA聚合酶,啟動子,a2bbs（全酶） = a2bb（核心酶） + s,識別DNA上轉錄起始信號的堿基序列（啟動子）,與啟動子結合，決定哪個基因被轉錄,與DNA模板結合,催化磷酸二酯鍵的形成，與轉錄全過程有關,4.2 原核生物RNA的合成,利福平和利福霉素可與b亞基結合，阻止RNA鏈的延伸，從而抑制轉錄的發(fā)生。,肝素是一種多價陰子化合物，能與b亞基結合，從而在體外抑制轉錄作用。,s70：轉錄大多數(shù)基因,4.2 原核生物RNA的合成,啟動子,結構,4.2 原核生物RNA的合成,RNA聚合酶識別和結合的DNA上一段特殊的核苷酸序列，位于轉錄起點附近。,RNA聚合酶與啟動子的結合,4.2

4、 原核生物RNA的合成,RNA聚合酶能與-35和-10區(qū)中的堿基及DNA主鏈中的磷酸基相接觸；與保守序列差別較遠的啟動子活性較弱；破壞啟動子功能的突變中有75%是改變了保守序列中的堿基，其余25%為離保守序列較近的。,s因子與啟動子,4.2 原核生物RNA的合成,s因子結構的不同區(qū)域分別參與了和編碼鏈的接觸、熔鏈反應以及與核心酶相互作用。-35區(qū)作為啟動子的識別域，-10區(qū)為“解鏈域”。,s70被證明其Tyr425、Tyr430、Trp433、Trp434等四個氨基酸殘基直接與啟動子-10區(qū)的TATAAT序列作用，解開DNA雙螺旋。,啟動 起始 延伸 終止,4.2 原核生物RNA的合成,4.2

5、 原核生物RNA的合成,轉錄的啟動,由RNA聚合酶全酶結合于啟動子而被啟動，形成閉合二元復合物。,4.2 原核生物RNA的合成,轉錄的起始,局部解鏈 （約17個堿基對）,第一個核苷三磷酸結合到全酶上,第二個核苷三磷酸參入，形成第一個磷酸二酯鍵,s因子從全酶上掉下，核心酶在DNA鏈上向下游滑動,開放二元復合物,鏈的延伸,4.2 原核生物RNA的合成,轉錄的終止,4.2 原核生物RNA的合成,終止子： DNA分子上一段終止轉錄的特殊核苷酸序列。,終止依賴于RNA產(chǎn)物，而不是由轉錄中DNA序列來決定。,依賴r因子的終止,不依賴r因子的終止,4.2 原核生物RNA的合成,共同序列特征：在轉錄終止前有一

6、段回文結構，之間由幾個堿基隔開，因此轉錄的RNA片段會形成莖環(huán)結構，阻止聚合酶前進。,4.2 原核生物RNA的合成,不依賴r因子的終止,4.2 原核生物RNA的合成,依賴r因子的終止,r因子：活性形式為六聚體，亞基具有一個RNA結合域和ATP水解域。六聚體具有依賴ATP的解旋酶活性。,4.3 真核生物RNA的合成,4.3 真核生物RNA的合成,與RNA聚合酶II特異性結合，從而抑制磷酸二酯鍵的形成。用于真核細胞RNA聚合酶的識別或RNA聚合酶II的定量等。,真核RNA聚合酶,4.3 真核生物RNA的合成,真核啟動子,TATA盒決定轉錄起點的選擇。,CAAT盒與轉錄起始頻率有關。,4.3 真核生

7、物RNA的合成,增強子能增強啟動子的活性，可存在于啟動子上游或下游。,4.3 真核生物RNA的合成,轉錄的起始,轉錄因子可與RNA聚合酶II形成轉錄起始復合物，共同參與轉錄起始過程。,4.3 真核生物RNA的合成,TFIID能與啟動子結合，并吸引其它轉錄因子及聚合酶進到轉錄啟動區(qū)。,4.3 真核生物RNA的合成,轉錄的終止,RNA聚合酶II所轉錄的基因在最后一個外顯子下游都具有一個加poly-A的信號AATAAA序列，而RNA聚合酶II一般在該位點下游停止轉錄。,4.4 轉錄后加工及其機制,4.4 轉錄后加工及其機制,mRNA,原核生物的結構基因是連續(xù)編碼序列，轉錄形成的mRNA絕大數(shù)不需加工

8、修飾。原核生物沒有核膜，轉錄和翻譯是偶聯(lián)的，往往轉錄還未完成已開始翻譯。,rRNA,4.4 轉錄后加工及其機制,7個編碼rRNA的操縱子分散于基因組中，組成基本相 同，均含有16S-23S-5S的三個rRNA分子。 16S rRNA后有1-2個tRNA基因，23S和5SrRNA后有0、 1或2個tRNA基因。,4.4 轉錄后加工及其機制,rRNA在修飾酶催化下進行堿基的甲基化修飾； rRNA前體被RNase III、RNase E、RNase P、RNase F等 剪切成一定鏈長的rRNA分子； rRNA與蛋白質結合形成核糖體的大、小亞基。,tRNA,4.4 轉錄后加工及其機制,tRNA前體被

9、tRNA剪切酶切 成一定大小的tRNA分子； 成熟tRNA分子中的稀有堿基 是通過修飾形成的； 3-末端加上CCA。,4.4 轉錄后加工及其機制,mRNA,真核mRNA被合成達到20-40bp時就開始進入加工階段。,4.4 轉錄后加工及其機制,5-端加帽 3-端加尾 甲基化 剪接,4.4 轉錄后加工及其機制,5-端加帽,是翻譯起始所必要的，為核糖體 識別mRNA提供了信號； 協(xié)助核糖體與mRNA結合使翻譯 從AUG開始； 增加mRNA穩(wěn)定性，免遭5外切 核酸酶的降解。,RNA三磷酸酶 mRNA鳥苷酰轉移酶 mRNA（鳥嘌呤-7）甲基轉移酶 mRNA（核苷-2）甲基轉移酶,4.4 轉錄后加工及其

10、機制,帽子0：7-甲基鳥苷以5-5三磷酸鍵與RNA的5-端相連形成m7GpppN。,帽子1：RNA的第1位核苷酸的2-O位也甲基化，形成m7GpppNm。,帽子2：RNA的第1、2位核苷酸的2-O位均甲基化，形成m7GpppNmNm。,4.4 轉錄后加工及其機制,3-端加尾,3端AAUAA、YGUGUGYY（Y為嘧啶）序列作為mRNA 3-端加polyA尾的信號。,RNaseIII在加尾信號下游11-30bp處切斷磷酸二酯鍵。,polyA聚合酶催化在3-OH上逐一引入100-250個A。,防止核酸外切酶降解mRNA信息序列，可能與mRNA的運輸有關。,4.4 轉錄后加工及其機制,甲基化,真核m

11、RNA往往有甲基化位點，主要是在N6-甲基腺嘌呤（m6A）。這種甲基化修飾對翻譯沒有必要，可能在mRNA前體加工中起識別作用。,4.4 轉錄后加工及其機制,剪接,內(nèi)含子的切除 外顯子的拼接,成熟mRNA 單順反子,4.4 轉錄后加工及其機制,GU-AG規(guī)律：所有內(nèi)含子都是以GU開始，以AG告終的保守序列。,mRNA前體的內(nèi)含子末端序列剪接位點突變引起剪切錯誤，剪切位點突變導致地中海貧血癥。,4.4 轉錄后加工及其機制,U系列snRNA與蛋白質結合形成核糖核蛋白顆粒（RNP）。U-snRNA參與hnRNA的剪接過程，U1、U2、U4、U5、U6可能都與hnRNA的加工有關。,snRNP和其他輔助

12、蛋白共同組成一個剪接體，對內(nèi)含子3和5剪接位點和分支點進行識別和剪接作用。,4.4 轉錄后加工及其機制,mRNA前體在snRNP等參與下，內(nèi)含子中分支點部位的腺苷酸殘基的2-OH自動攻擊內(nèi)含子5端與外顯子1連接的磷酸二酯鍵，切下外顯子1。,腺苷酸原來的3,5-磷酸二酯鍵依然存在，加上此2,5-磷酸二酯鍵連接后，在腺苷酸處出現(xiàn)了一個套索。,已被切下的外顯子1的3-OH攻擊內(nèi)含子3-端與外顯子2間的3,5-磷酸二酯鍵使其斷裂，內(nèi)含子以套索的形式被切下。外顯子1和2相互連接。,rRNA,4.4 轉錄后加工及其機制,真核生物rRNA基因有幾十至幾千個拷貝數(shù)串聯(lián)重復。其中18S rRNA、28S rRN

13、A和5.8S rRNA基因成簇排列組成一個轉錄單位，彼此被間隔區(qū)分開，由RNA聚合酶I轉錄成一個rRNA前體。,4.4 轉錄后加工及其機制,5S rRNA基因也成簇排列，存在于另一個轉錄單位，間隔區(qū)不被轉錄，由RNA 聚合酶III轉錄（內(nèi)部啟動子）。,4.4 轉錄后加工及其機制,甲基的存在是初級轉錄物轉變成熟的rRNA的標志。,4.4 轉錄后加工及其機制,人類的45S rRNA與小鼠的45S rRNA加工方式不同。,酵母rRNA加工途徑,tRNA,4.4 轉錄后加工及其機制,tRNA基因成簇排列，被間隔區(qū)分開，由RNA聚合酶III轉錄。 真核生物轉錄生成的tRNA前體需進行加工修飾才有生物活性

14、。,tRNA的剪接需要獨立的核酸酶和連接酶活性。由內(nèi)切酶保證內(nèi)含子識別的專一性，在內(nèi)含子兩個末端進行tRNA的剪接。,4.4 轉錄后加工及其機制,核酸內(nèi)切酶切斷內(nèi)含子- 外顯子邊界，產(chǎn)生2-3- 環(huán)形磷酸和5-OH； 環(huán)形磷酸打開產(chǎn)生2-磷 酸和3-OH，5-OH末端 磷酸化； 內(nèi)含子釋放， tRNA半 分子折疊成一個含5-磷 酸及一個3-OH 裂口的 類tRNA結構； 連接酶縫合裂口，磷酸 酶除去2-磷酸； 堿基修飾； 3-OH連接CCA結構。,ACC,4.4 轉錄后加工及其機制,主要存在于核中，化學本質是RNA； 大小從十幾個bp到數(shù)百個bp； 底物多為RNA（也有DNA、糖類、氨基酸酯等）； 催化效率較酶（蛋白質）低得多； 必需有Mg2+存在； 具有催化作用的專一性； 作用方式有剪切型和剪接型兩大類型，稱為自我剪切 和自我剪接。,核酶的特性,4.4 轉錄后加工及其機制,相當于核酸內(nèi)切酶和連接酶兩種酶的聯(lián)合作用，催化自身RNA進行剪切和連接。,剪接型核酶,催化反應需Mg2+和鳥苷或5鳥苷酸參與，鳥苷必須有游離的3-OH，剪下來的內(nèi)含子生成環(huán)狀中間產(chǎn)物。,成熟rRNA,4.4 轉錄后加工及其機制,4.4 轉錄后加工及其機制,相當于核酸內(nèi)切酶，可催化自身RNA或異體RNA切除一段特異的核苷酸序列。,剪切型核酶,RNase P由蛋白質和miRNA組成； miR