1、人類生殖技術(shù)Human reproductive technology,中南大學(xué)生殖與干細(xì)胞工程研究所 中信湘雅生殖與遺傳?？漆t(yī)院 范立青,人類正常的生殖過程,methods used to interfere in reproduction by artificial or partially artificial means.,人類生殖技術(shù)：所有現(xiàn)在和未來干預(yù)人類生殖過程的技術(shù)，包括輔助生殖技術(shù)、避孕技術(shù)和其他技術(shù)。 人類輔助生殖技術(shù)：主要用于輔助不孕夫婦解決生育的困境，包括生育的藥物治療（激素治療）、人工授精、體外受精、單精子卵胞漿內(nèi)注射、配子與胚胎的冷凍保存、胚胎移植、植入前胚胎遺傳學(xué)

2、診斷、卵胞漿置換和克隆等技術(shù)。 避孕技術(shù)：控制生育的技術(shù)，包括阻止受精、胚胎著床和導(dǎo)致流產(chǎn)的技術(shù)。 其他技術(shù)：人造子宮、配子選擇與配子工程技術(shù)、體外單性生殖技術(shù)和生殖遺傳學(xué)技術(shù)。,人工生殖方式：個(gè)體以非自然的方式創(chuàng)造新的生命的生殖方式，例如：人工授精、體外受精、克隆和胚胎分割等生殖方式。 體外單性生殖技術(shù)：即孤雌生殖技術(shù)，采用人工誘導(dǎo)的方法，在體外刺激卵母細(xì)胞活化和發(fā)育（魚、兩棲類：半克隆、全克?。?。 人造子宮：人造胎盤：營養(yǎng)與氧的提供和廢物的排放；人造羊膜囊。 配子選擇技術(shù)和配子工程技術(shù)：允許父母改變后代遺傳組成的技術(shù)，包括PGD、PGS、X-Y精子分選、轉(zhuǎn)基因和人工染色體等。 生殖遺傳學(xué)技

3、術(shù)(reprogenetics/eugenics)：在未來技術(shù)的基礎(chǔ)上，以改善人類基因庫為目的的后代遺傳性狀挑選。,同性生殖(same-sex procreation )技術(shù)：指通過創(chuàng)造出女性精子或男性卵子來實(shí)現(xiàn)同性別生育的技術(shù)。,IVF Pioneer Wins Nobel Prize in Medicine STOCKHOLM (Oct. 4) - Robert Edwards of Britain won the 2010 Nobel Prize in medicine on Monday for developing in-vitro fertilization, a controve

4、rsial breakthrough that ignited sharp criticism from religious leaders but helped millions of infertile couples in the last three decades,1980年生殖工程研究小組,1986年人類生殖工程研究室,1988年湖南-中國遺傳醫(yī)學(xué)中心和國家人類精子庫技術(shù)指導(dǎo)中心,2002年建立中信-湘雅生殖與遺傳?？漆t(yī)院,2001年建立湖南省干細(xì)胞工程技術(shù)研究中心,2002年建立中南大學(xué)生殖與干細(xì)胞工程研究所,2004年被批準(zhǔn)建立人類干細(xì)胞 國家工程研究中心,發(fā)展歷程,衛(wèi)生部生殖

5、與干細(xì)胞工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,人類輔助生殖技術(shù)Assisted reproductive technology（ART）,不孕不育 遺傳疾病 性傳播疾病,不孕癥：育齡夫婦婚后同居，未避孕，性生活正常，一年以上女方未受過孕者。 不育癥：指育齡夫婦結(jié)婚同居后女方曾妊娠，但均因自然流產(chǎn)、早產(chǎn)或死產(chǎn)而未能獲得活嬰者。,不孕不育和輔助生殖技術(shù)基礎(chǔ),不孕不育是指未采用避孕措施,正常夫婦生活后一年仍不能獲得妊娠。這一定義依據(jù)的是累積妊娠概率。,不孕不育是一類常見疾病，占據(jù)了育齡夫婦的10-15%。 發(fā)病率增加、生育高峰期的到來，越來越多的人的生育需求，助使輔助生殖技術(shù)的加速發(fā)展。,可治性不孕：可通過藥物或手術(shù)治療

6、而獲得自然妊娠，如促低促性腺激素型的性腺功能減退癥。 可助孕性不孕：為ART治療的適應(yīng)癥，如梗阻性無精子癥的患者等。 絕對(duì)不孕：指無法獲得活的配子細(xì)胞，如唯支持細(xì)胞綜合征。,不孕不育的常見原因,不孕不育的原因,不孕不育和輔助生殖技術(shù)基礎(chǔ),人類輔助生殖技術(shù)：指用于治療不孕不育的生殖技術(shù)。在我國，ART屬限制性使用技術(shù)，目前可應(yīng)用于臨床的生殖技術(shù)包括人工授精（Artificial Insemination，AI）、體外受精-胚胎移植（In Vitro Fertilization and Embryo Transfer，IVF-ET）及其衍生技術(shù)和精子庫技術(shù)。,國內(nèi)首家所有ART技術(shù)項(xiàng)目均獲得批準(zhǔn)的

7、醫(yī)療機(jī)構(gòu)。,人工授精技術(shù),是指采用非性交的方式將精子遞送到女性生殖道來治療不孕的技術(shù)。 其精子可來自于丈夫（伴侶） （Artificial Insemination with husband semen，AIH） ，對(duì)于丈夫無精子者則可采用精子庫的供者精液（Artificial Insemination with donor semen，AID） 。,人工授精技術(shù)的適應(yīng)證與禁忌癥：,AIH：適應(yīng)癥 男性因少精、弱精、液化異常、性功能障礙、生殖器畸形等不育； 宮頸因素不育； 生殖道畸形及心理因素導(dǎo)致 性交不能等不育； 免疫性不育； 原因不明不育。 禁忌癥 男女一方患有生殖泌尿系統(tǒng)急性感染或性傳播

8、疾??； 一方患有嚴(yán)重的遺傳、軀體疾病或精神心理疾患； 一方接觸致畸量的射線、毒物、藥品并處于作用期； 一方有吸毒等嚴(yán)重不良嗜好。,人工授精技術(shù)的基本流程：,術(shù)前檢查：明確適應(yīng)癥，排除禁忌癥。 排卵監(jiān)測(cè)或誘導(dǎo)排卵。 精子體外處理。 授精及術(shù)后處理。,ICI,IUI,IFI,IPI,IntraCervix Insemination IntraUterine Insemination IntraFallopian Insemination IntraPeritoneal Insemination,人工授精治療中可能出現(xiàn)的并發(fā)癥與處理：,1、宮內(nèi)感染與腹痛； 2、卵巢超刺激反應(yīng)； 3、多胎； 4、出血

9、和損傷。,精子庫是收集和儲(chǔ)存人類精子及相關(guān)信息的中心。精子可以來自丈夫或供者精子，通過ART技術(shù)來獲得妊娠。世界上最早建成的兩個(gè)精子庫是 Iowa City, Iowa, USA 和 Tokyo, Japan （ 1965）。 精子庫的主要任務(wù)： 1、治療不育癥； 2、預(yù)防遺傳病； 3、提供生殖保險(xiǎn)。,精子庫技術(shù),上世紀(jì)80年代中期，AIDS的肆虐推動(dòng)供者冷凍精液的廣泛應(yīng)用。 優(yōu)點(diǎn)：能排除AIDS等感染樣本 利于治療周期安排、規(guī)模化 受者夫婦的選擇,臨床應(yīng)用階段(取代新鮮精液AID),我國首例冷凍精液人工授精嬰兒（1983）。,快速冷凍損傷 （細(xì)胞內(nèi)冰晶形成）,慢速冷凍損傷 （細(xì)胞過度皺縮和高

10、電解質(zhì)濃度）,細(xì)胞冷凍過程中遭遇的損傷-冷凍保護(hù)劑,冷凍技術(shù),供精者篩選：,面談,簽知情同意書,精液化驗(yàn),體格檢查,實(shí)驗(yàn)室化驗(yàn),精液采集：,禁欲37天,精液凍存：,無菌取精液,液化后鏡檢,資料 歸檔、 數(shù)據(jù)庫 管理,精液凍存,程序冷凍,定點(diǎn)凍存并記錄,6個(gè)月后復(fù)檢HIV,精液運(yùn)輸、臨床應(yīng)用及隨訪：,臨床申請(qǐng),精液運(yùn)輸,精液解凍,凍后鏡檢,臨床應(yīng)用并記錄,使用后隨訪,加冷凍保護(hù)劑,分裝并編號(hào),精子庫運(yùn)行流程圖,數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)、查詢與供受者咨詢,登記與遺傳咨詢,精子體外處理的任務(wù),1、人工去除所有精液、不活動(dòng)或死精子。 2、盡可能濃縮形態(tài)和大小都正常的前向運(yùn)動(dòng)精子。 3、去除去獲能因子，同時(shí)，添加有利于

11、誘導(dǎo)獲能的其他因子。,今后精子處理技術(shù)的發(fā)展方向：通過處理來選擇優(yōu)質(zhì)精子。,常用精子體外處理的方法,1、精子洗滌。 2、精子遷移：從精液中上游。 洗滌后精子上游。 3、黏附方法：玻璃毛過濾。 4、密度梯度：蛋白梯度。 PERCOLL梯度。,體外受精-胚胎移植及其衍生技術(shù),常規(guī)體外受精-胚胎移植技術(shù)/胚胎冷凍技術(shù)（IVF） 單精子卵胞漿內(nèi)注射技術(shù)（ICSI） 植入前胚胎遺傳學(xué)診斷技術(shù)（PGD）,體外受精-胚胎移植及其衍生技術(shù),即所謂的“試管嬰兒”（ Louise Brown, 1978）。,IVF-ET的基本流程,IVF-ET的適應(yīng)證和禁忌癥,女方各種因素導(dǎo)致的配子運(yùn)輸障礙； 排卵障礙； 子宮內(nèi)

12、膜異位癥； 男方少、弱精子癥； 不明原因的不育； 免疫性不孕。,IVF-ET的適應(yīng)證和禁忌癥,有如下情況之一者，不得實(shí)施體外受精一胚胎移植及其衍生技術(shù)： 男女任何一方患有嚴(yán)重的精神疾患、泌尿生殖系統(tǒng)急性感染、性傳播疾病； 患有母嬰保健法規(guī)定的不宜生育的、目前無法進(jìn)行胚胎植入前遺傳學(xué)診斷的遺傳性疾病； 任何一方具有吸毒等嚴(yán)重不良嗜好； 任何一方接觸致畸量的射線、毒物、藥品并處于作用期。 女方子宮不具備妊娠功能或嚴(yán)重軀體疾病不能承受妊娠。,激素控制性超排卵,藥物： 人類絕經(jīng)期促性腺激素（ Human menopausal gonadotropin；HMG） 提取于絕經(jīng)期婦女的尿液 具有卵泡刺激素（

13、Follicle stimulating hormone ；FSH)和黃體生成素（luteinizing hormone；LH) 活性 Recombinant FSH Recombinant LH,基本方案： FSH或hMG在月經(jīng)周期的第3-5天開始用，直到至少有二個(gè)優(yōu)勢(shì)卵泡直徑超過18mm，注射hCG5000-10000IU，在36小時(shí)后取卵。,激素控制性超排卵：長(zhǎng)方案,垂體抑制：自上周期第22天開始 使用Gn 9-11 天 陰道內(nèi)超聲監(jiān)測(cè)卵泡發(fā)育 當(dāng)優(yōu)勢(shì)卵泡發(fā)育到16 -18 mm時(shí)注射10,000 IU hCG,作用機(jī)制：利用GnRHa 7-10天后出現(xiàn)的垂體降調(diào)節(jié)作用，使卵巢內(nèi)卵泡處于

14、抑制狀態(tài)。外源性Gn可啟動(dòng)多個(gè)卵泡同步發(fā)育，并可抑制排卵前LH峰，避免卵泡過早黃體化，保證卵泡質(zhì)量。適合一般的IVF患者，尤其是PCOS患者。,利：可獲得盡可能多的、質(zhì)量好的卵子供后期選擇，并可保證卵泡發(fā)育的同步性。 弊：促排卵時(shí)間長(zhǎng)，Gn用量多，易致OHSS、卵巢囊腫。,其他常用的藥物誘導(dǎo)性超排卵方案： 短方案：GnRH-a在月經(jīng)周期的第一天開始用，同時(shí)給予FSH或hMG，直到hCG注射日停用。(利：可用于反應(yīng)不良患者，加強(qiáng)卵泡募集。弊：獲卵數(shù)較長(zhǎng)方案少，卵泡發(fā)育時(shí)間短，影響受精率和妊娠率。) 超短方案：GnRH-a僅用短短幾天（4天），月經(jīng)周期14天，第二天同時(shí)加用FSH或HMG，直到HC

15、G注射日止。(利：可用于反應(yīng)不良患者，加強(qiáng)卵泡募集，減少GN用量。弊：獲卵數(shù)較長(zhǎng)方案少，卵泡發(fā)育時(shí)間短，影響受精率和妊娠率；易出現(xiàn)內(nèi)源性LH峰致周期取消。) 超長(zhǎng)方案：長(zhǎng)效GnRH-a于治療前兩周期黃體相開始用。(利：有利于嚴(yán)重子宮內(nèi)膜異位癥的患者，可以減少其復(fù)發(fā)。 弊：促排卵時(shí)間長(zhǎng)，Gn用量多，卵泡生長(zhǎng)較多，易致OHSS。),取卵,卵子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)：,圖7-5 未成熟卵母細(xì)胞,圖7-6 中間型卵母細(xì)胞,圖7-7 成熟卵母細(xì)胞,Lucinda分類標(biāo)準(zhǔn)： 1.未成熟的卵母細(xì)胞:第一次減數(shù)分裂前期:（1）有一個(gè)完整的GV，含有單個(gè)有折光的核仁,未排出極體；（2）規(guī)則或不規(guī)則的胞質(zhì)，中心稍許變黑并呈

16、顆粒狀；（3）一層致密的細(xì)胞附著于透明帶（未擴(kuò)散的丘細(xì)胞，緊密的“放射冠”細(xì)胞；（4）無丘細(xì)胞粘液塊；（5）其所處的卵泡膜顆粒細(xì)胞細(xì)小，致密塊狀。(需24小時(shí)成熟) 2.中間型卵母細(xì)胞：第一次減數(shù)分裂中期：（1）未見GV，也未排出第一極體；（2）胞質(zhì)圓形，淺色，有時(shí)有小顆粒。（3）放射冠輕度擴(kuò)散；（4）丘細(xì)胞塊可擴(kuò)散或密集；（5）卵泡膜顆粒細(xì)胞密集成片狀。(需612小時(shí)成熟) 3.成熟卵母細(xì)胞：第二次減數(shù)分裂中期： （1）排出第一極體；（2）卵母細(xì)胞質(zhì)勻稱，淺色；（3）顆粒均勻擴(kuò)展開呈放射狀; （4）丘細(xì)胞分散在稀薄、透明的酸性粘多糖粘液塊中，肉眼可見；（5）卵泡膜顆粒細(xì)胞較大，呈松散集聚的薄

17、片狀，或云霧狀。(26小時(shí)內(nèi)授精),精子處理流程：,密度梯度法,上游法,授精,卵子常規(guī)以10萬個(gè)活動(dòng)精子/ml進(jìn)行授精,圖7-10 受精卵細(xì)胞,圖7-11 一個(gè)原核卵,授精后15-18小時(shí)后觀察原核,胚胎發(fā)育：,評(píng)價(jià)胚胎質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)：,胚胎卵裂的速度與時(shí)間關(guān)系： 受精后每1214小時(shí)發(fā)生一次胚胎分裂。授精后3942小時(shí)，16.7%為2-細(xì)胞期、55.6% 34細(xì)胞期、27.6%為68細(xì)胞期。,按胚胎形態(tài)學(xué)分為四級(jí)： 一級(jí)：卵裂球等大、均質(zhì)透明、無碎片； 二級(jí)：卵裂球不等大、均質(zhì)、無碎片； 三級(jí)：卵裂球等大、有少許碎片、均質(zhì)； 四級(jí)：卵裂球不等大、變黑、顆粒不均勻。,胚胎移植：,最多可移植三枚胚胎

18、,卵子、精子和胚胎的冷凍保存,IVF-ET的主要并發(fā)癥：,1、卵巢超刺激綜合征(Ovarian hyperstimulation syndrome; OHSS) 2、多胎(Multiple pregnancy),胸膜積液,腹水,巨大卵巢,最嚴(yán)重,IVF-ET的主要并發(fā)癥：,2、多胎(Multiple pregnancy)-最常見,多胎的風(fēng)險(xiǎn)：早產(chǎn)； 低體重兒 先兆子癇 產(chǎn)時(shí)大出血,衛(wèi)生部規(guī)定：最多只能移植3枚胚胎；35歲以下，第一周期接受ART治療時(shí)只能移植2枚胚胎。對(duì)于多胎妊娠必須實(shí)施減胎術(shù)，避免雙胎，嚴(yán)禁三胎和三胎以上的妊娠分娩。,Intracytoplasmic sperm inject

19、ion：ICSI,卵胞漿內(nèi)精子注射技術(shù),ICSI Equipment,卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射適應(yīng)癥 嚴(yán)重的少、弱、畸精子癥； 不可逆的梗阻性無精子癥； 生精功能障礙(排除遺傳缺陷疾病所致)； 免疫性不育； 體外受精失??； 精子頂體異常； 需行植入前胚胎遺傳學(xué)檢查的。,獲得ICSI精子的方法： 排出精液 輸精管取精（PVSA） 附睪取精（PESA/MESA） 睪丸取精（TESA/MTESA）,優(yōu)點(diǎn)：損傷輕微、操作簡(jiǎn)單、并發(fā)癥少、可重復(fù)穿刺。,Outcome of repeated micro-surgical testicular sperm extraction in patients with non-obstructive azoospermia Halit Talas1, Onder Yaman1, Kaan Aydos2 1Department of Urology, School of Medicine, University of Ankara, Ankara 06550, Turkey 2Research Center on Infertility, School of Medi