1、是植物離體培養(yǎng)中的營養(yǎng)和能量來源，也是人們調(diào)節(jié)和控制培養(yǎng)物生長發(fā)育的重要因子。 是離體培養(yǎng)組織或細(xì)胞賴以生存的營養(yǎng)基質(zhì)，是為離體培養(yǎng)材料提供的近似生物體內(nèi)生存的營養(yǎng)環(huán)境。,第三節(jié)培養(yǎng)基及其配制,這些必需元素在生物體內(nèi)的生理作用重要有四方面： 組成各種化合物，參與有機(jī)體的構(gòu)造，成為結(jié)構(gòu)物質(zhì)； 構(gòu)成一些特殊的生理活性物質(zhì)，參與活躍的生理代謝； 元素間的相互協(xié)調(diào)，維持離子濃度平衡、膠體穩(wěn)定、電荷平衡等電化學(xué)方面的作用； 調(diào)節(jié)形態(tài)發(fā)生和組織器官的建成。,在離體培養(yǎng)條件下，不同種植物的組織對營養(yǎng)有不同的要求，甚至同一種植物不同部位的組織對營養(yǎng)的要求也不相同，只有滿足了它們各自的特殊要求，它們才能很好地生

2、長。,因此，沒有一種培養(yǎng)基能夠適合一切類型的植物組織或器官，在建立一項新的培養(yǎng)系統(tǒng)時，首先必須找到一合適的培養(yǎng)基，培養(yǎng)才有可能成功。,第三節(jié) 培養(yǎng)基及其配制,一、培養(yǎng)基成分 二、培養(yǎng)基種類 三、培養(yǎng)基的配制方法,一、培養(yǎng)基成分,1. 無機(jī)元素（大量元素、微量元素） 2. 有機(jī)元素（氨基酸、維生素、糖類） 3. 植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì) 4. 瓊脂 5. 水,1. 無機(jī)元素,無機(jī)營養(yǎng)對植物的生長發(fā)育十分重要。一旦無機(jī)元素供應(yīng)不足，組織培養(yǎng)材料就會出現(xiàn)一定的缺素癥狀，如植株失綠、細(xì)胞分裂停止、細(xì)胞分化受阻等；但營養(yǎng)過多，也會造成植物細(xì)胞代謝障礙，生長抑制等毒害現(xiàn)象。,大量元素,培養(yǎng)基中無機(jī)元素用量差異較大

3、，可分為大量元素類和微量元素類。 指使用濃度大于0.5mmolL的元素，有碳、氫、氧、氮、鉀、磷、鎂、硫、鈣等。,無機(jī)元素的作用,N：是各種氨基酸、維生素、蛋白質(zhì)、和核酸的重要組成成分，在制備培養(yǎng)基時以NO3和NH4兩種形式供應(yīng)。 P：是磷脂的主要成分。常用的物質(zhì)有KH2P04或NaH2P04。 K：對碳水化合物合成、轉(zhuǎn)移、以及氮素代謝等有密切關(guān)系。制備培養(yǎng)基時，常以KCI、KN03等鹽類提供。,Mg、S和Ca： Mg是葉綠素的組成成分，又是激酶的活化劑；S是含S氨基酸和蛋白質(zhì)的組成成分。它們常以MgSO47H20 提供。Ca是構(gòu)成細(xì)胞壁的一種成分，Ca對細(xì)胞分裂、保護(hù)質(zhì)膜不受破壞有顯著作用，

4、常以CaCl22H2O提供。,2.微量元素：指使用濃度小于0.5mmolL的元素 主要有Fe，B，Mn，Cu，Mo，Co等。,鐵是一些氧化酶、細(xì)胞色素氧化酶、過氧化氫酶等的組成成分。同時，它又是葉綠素形成的必要條件。培養(yǎng)基中的鐵對胚的形成、芽的分化和幼苗轉(zhuǎn)綠有促進(jìn)作用。在制做培養(yǎng)基時不用硫酸鐵，和FeCl3(因其在pH值52以上，易形成Fe(OH)3的不溶性沉淀)，而用FeSO47H20和Na2EDTA結(jié)合成螯合物使用。,B，Mn，Zn，Cu，Mo，Co等，也是植物組織培養(yǎng)中不可缺少的元素，缺少這些物質(zhì)會導(dǎo)致生長、發(fā)育異?，F(xiàn)象。,2. 有機(jī)元素（氨基酸、維生素、糖類,氨基酸類 維生素類 糖類

5、天然有機(jī)添加物,是很好的有機(jī)氮源，可直接被細(xì)胞吸收利用。培養(yǎng)基中最常用的氨基酸是甘氨酸，其他的如精氨酸、谷氨酸，谷酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺、丙氨酸等也常用。,氨基酸類,維生素類,這類化合物主要是以各種輔酶的形式參與多種代謝活動，對生長、分化等有很好的促進(jìn)作用。 VB1對愈傷組織的產(chǎn)生和生活力有重要作用，VB6能促進(jìn)根的生長，Vpp與植物代謝和胚的發(fā)育有一定關(guān)系。Vc有防止組織變褐的作用。,主要有VBl(鹽酸硫胺素)、VB6(鹽酸吡哆醇)、Vpp(煙酸)、Vc（抗壞血酸）、有時還使用生物素、葉酸、VB12等。一般用量為0.11.0mgL。,糖類,是培養(yǎng)基的主要碳源，為細(xì)胞提供合成新化合物所需的碳

6、骨架，并為細(xì)胞呼吸代謝提供底物與能源，維持一定的滲透壓。,最常用的碳源是蔗糖，葡萄糖和果糖也是較好的碳源，可支持許多組織很好的生長。蔗糖使用濃度在2%3%，常用3%高壓滅菌時，一部分糖會發(fā)生分解，制定配方時要給予考慮。在大規(guī)模生產(chǎn)時，可用食用的綿白糖代替。,肌醇又叫環(huán)己六醇,在糖類的相互轉(zhuǎn)化中起重要作用，是培養(yǎng)基 中不可缺少的有機(jī)營養(yǎng)。它可以形成果膠物質(zhì)，是細(xì)胞壁的構(gòu)建物質(zhì)；還可以與6分子磷酸殘基結(jié)合形成植酸。植酸與鈣、鎂等陽離子結(jié)合成植酸鈣鎂；植酸也可以形成磷脂，參與到細(xì)胞膜的組分中。,使用濃度一般為l00mgL，適當(dāng)使用肌醇，能促進(jìn)愈傷組織的生長以及胚狀體和芽的形成。對組織和細(xì)胞的繁殖、分

7、化有促進(jìn)作用，對細(xì)胞壁的形成也有作用。,天然有機(jī)添加物,是化學(xué)成分不明的復(fù)雜的營養(yǎng)混合物。盡管它們對細(xì)胞和組織的生長和分化有明顯的促進(jìn)作用，但因成分不定，質(zhì)和量受多種因素的影響，實驗的可重復(fù)性差，應(yīng)盡量避免使用。常用的有機(jī)附加物有: 椰乳： 香蕉： 水解酪蛋白：,3. 植物生長調(diào)節(jié)物,植物激素是植物新陳代謝中產(chǎn)生的天然化合物，它能以極微小的量影響到植物的細(xì)胞分化、分裂、發(fā)育，影響到植物的形態(tài)建成、開花、結(jié)實、成熟、脫落、衰老和休眠以及萌發(fā)等許許多多的生理生化活動，在培養(yǎng)基的各成分中，植物生長調(diào)節(jié)物是培養(yǎng)基的關(guān)鍵物質(zhì)，對植物組織培養(yǎng)起著決定性作用。,3. 植物生長調(diào)節(jié)物,生長素類 細(xì)胞分裂素類

8、赤霉素類 脫落酸 乙烯,在組織培養(yǎng)中，生長素主要被用于誘導(dǎo)愈傷組織形成，誘導(dǎo)根的分化和促進(jìn)細(xì)胞分裂、伸長生長。在促進(jìn)生長方面，根對生長素最敏感，在極低的濃度下，就可促進(jìn)根生長，其次是莖和芽。天然的生長素?zé)岱€(wěn)定性差，高溫高壓或受光條件易被破壞。在植物體內(nèi)也易受到體內(nèi)酶的分解。一般生長素濃度的使用為0.055mgL。,生長素類,IAA(吲哚乙酸)是天然存在的生長素，亦可人工合成，其活力較低，是生長素中活力最弱的激素，對器官形成的副作用小，高溫高壓易被破壞，也易被細(xì)胞中的IAA分解酶降解，受光也易分解。,NAA(萘乙酸)在組織培養(yǎng)中的起動能力要比IAA高出3-4倍，且由于可大批量人工合成，耐高溫高壓

9、，不易被分解破壞，所以應(yīng)用較普遍。NAA和IBA廣泛用于生根，并與細(xì)胞分裂素互作促進(jìn)芽的增殖和生長。,IBA(吲哚丁酸)是促進(jìn)發(fā)根能力較強(qiáng)的生長調(diào)節(jié)物質(zhì)。 2，4D(2，4二氯苯氧乙酸)起動能力比IAA高10倍，特別在促進(jìn)愈傷組織的形成上活力最高，但它強(qiáng)烈抑制芽的形成，影響器官的發(fā)育。適宜的用量范圍較狹窄，過量常有毒效應(yīng)。,細(xì)胞分裂素類,細(xì)胞分裂素多用于誘導(dǎo)不定芽的分化和莖、苗的增殖，而在生根培養(yǎng)時使用較少或用量較低。這類激素是腺嘌吟的衍生物，包括6BA(6芐基氨基嘌呤)、Kt (kinetin 激動素)、Zt (zeatin 玉米素)等，細(xì)胞分裂素0.0510mgL。 其中Zt活性最強(qiáng)，但非

10、常昂貴，常用的是6BA。,在培養(yǎng)基中添加細(xì)胞分裂素有三個作用： 誘導(dǎo)芽的分化促進(jìn)側(cè)芽萌發(fā)生長。 促進(jìn)細(xì)胞分裂與擴(kuò)大。 抑制根的分化。,生長素與細(xì)胞分裂素：它們的比例決定著發(fā)育的方向，是愈傷組織、長根還是長芽。如為了促進(jìn)芽器官的分化，應(yīng)除去或降低生長素的濃度，或者調(diào)整培養(yǎng)基中生長素與細(xì)胞分裂素的比例。,激素調(diào)控模式,生長素/細(xì)胞分裂素比例,高：有利于根的形成和愈傷組織的形成； 適中：有利于根芽的分化 低：有利于芽的形成,有20多種，培養(yǎng)基中添加的是GA3，主要用于促進(jìn)幼苗莖的伸長生長，促進(jìn)不定胚發(fā)育成小植株。此外，赤霉素還用于打破休眠，促進(jìn)種子、塊莖、鱗莖等提前萌發(fā)。一般在器官形成后，添加赤霉素

11、可促進(jìn)器官或胚狀體的生長。但赤霉素不耐熱，水溶后不穩(wěn)定，故應(yīng)采用過濾除菌，并用酒精溶解。,赤霉素類,脫落酸,脫落酸 抑制蛋白質(zhì)合成，抵消和抑制生長素、細(xì)胞分裂素和GA發(fā)揮作用。ABA誘導(dǎo)休眠，促進(jìn)衰老和脫落。ABA不能高溫高壓滅菌，故應(yīng)采用過濾除菌。,乙烯,乙烯具有促進(jìn)果實成熟，促進(jìn)脫落和衰老等作用，在組織培養(yǎng)中很少使用。,4. 瓊脂,培養(yǎng)基有固體和液體兩種。固體培養(yǎng)基最好的固化劑是瓊脂，它是從海藻中提取的一種高分子多糖類物質(zhì)，不提供任何營養(yǎng)成分。瓊脂能溶解在熱水中，成為溶膠，冷卻至40即凝固為固體狀凝膠。通常所說的“煮化”培養(yǎng)基，就是使瓊脂溶解于90以上的熱水。,4. 瓊脂,瓊脂的用量在61

12、0g/l之間，若濃度太高，培養(yǎng)基就會變得很硬，營養(yǎng)物質(zhì)難以擴(kuò)散到培養(yǎng)的組織中去。若濃度過低，凝固性不好，新買來的瓊脂最好先試一下它的凝固力。一般瓊脂以顏色淺、透明度好、潔凈的為上品。瓊脂的凝固能力除與原料、廠家的加工方式有關(guān)外，還與高壓滅菌時的溫度、時間、pH值等因素有關(guān)，長時間的高溫會使凝固能力下降，過酸過堿加之高溫會使瓊脂發(fā)生水解，喪失凝固能力。時間過久，瓊脂變褐，也會逐漸喪失凝固能力。,瓊脂,加入瓊脂的固體培養(yǎng)基與液體培養(yǎng)基相比優(yōu)點(diǎn)在于操作簡便，通氣問題易于解決，便于經(jīng)常觀察研究等，但它也有不少缺點(diǎn)，如培養(yǎng)物與培養(yǎng)基的接觸（即吸收）面積小，各種養(yǎng)分在瓊脂中擴(kuò)散較慢，影響?zhàn)B分的充分利用，同

13、時培養(yǎng)物排出的一些代謝廢物，聚集在吸收表面，對組織產(chǎn)生毒害作用。,其它,有玻璃纖維、濾紙橋、海綿等，總的要求是排出的有害物質(zhì)對培養(yǎng)材料沒有影響或影響較小。,5. 水,水是植物原生質(zhì)體的組成成分，也是一切代謝過程的介質(zhì)和溶媒。它是生命活動過程中不可缺少的物質(zhì)。配制培養(yǎng)基時盡量用蒸餾水或去離子水，以防成分變化。但大規(guī)模生產(chǎn)時可用自來水。,培養(yǎng)基的構(gòu)成除了上述5種成分以外，有時還加入一些其他物質(zhì)，如吸附用的活性炭、防止酚類污染的物質(zhì)、抗生素等。另外培養(yǎng)的植物材料大多要求弱酸性環(huán)境，所以培養(yǎng)基在滅菌前需將PH調(diào)至5.65.8。當(dāng)PH高于6時，培養(yǎng)基變硬，不利于培養(yǎng)物的生長；而PH低于5時，瓊脂不能很好

14、地凝固。,抗生物質(zhì) 抗生物質(zhì)有青霉素、鏈霉素、慶大霉素等，用量在520mg/L之間。添加抗生物質(zhì)可防止菌類污染，減少培養(yǎng)中材料的損失。對于剛感染的組織材料，可向培養(yǎng)基中注入5%10%的抗菌素。,活性炭,活性炭結(jié)構(gòu)疏松，孔隙大，吸水力強(qiáng)，有很強(qiáng)的吸附作用通常使用濃度為0.5l0gL。它可以吸附非極性物質(zhì)和色素等大分子物質(zhì)。,活性炭的應(yīng)用： 莖尖初代培養(yǎng)，可以吸附外植體產(chǎn)生的致死性褐化物，一般為0.1%0.2%，不能超過0.2%。 活性炭在生根時有明顯的促進(jìn)作用，可能是通過減弱光 照保護(hù)IAA。 降低玻璃苗的產(chǎn)生頻率，對防止產(chǎn)生玻璃苗有良好作用，一般濃度為0.3%。,研究表示，每毫克的活性炭能吸附

15、l00ng左右的生長調(diào)節(jié)物質(zhì)，這說明只需要極少量的活性炭就可以完全吸附培養(yǎng)基中的調(diào)節(jié)物質(zhì)。大量的活性炭加入會削弱瓊脂的凝固能力，因此要多加一些瓊脂。很細(xì)的活性炭也易沉淀，通常在瓊脂凝固之前，要輕輕搖動培養(yǎng)瓶。,活性炭的副作用,二、 培養(yǎng)基種類,根據(jù)培養(yǎng)基中無機(jī)鹽的含量可分為4類，分別如下： 高無機(jī)鹽含量培養(yǎng)基 較高硝酸鉀含量培養(yǎng)基 中等無機(jī)鹽含量培養(yǎng)基 低無機(jī)鹽含量培養(yǎng)基,培養(yǎng)基種類,根據(jù)功能可分為以下幾種： 誘導(dǎo)培養(yǎng)基 分化培養(yǎng)基 增殖培養(yǎng)基 生根培養(yǎng)基,培養(yǎng)基的名稱，一直根據(jù)沿用的習(xí)慣。多數(shù)以發(fā)明人的名字來命名， 如hite培養(yǎng)基，urashige和koog培養(yǎng)基（簡稱 培養(yǎng)基），也有對某

16、些成分進(jìn)行改良稱作改良培養(yǎng)基。,而我們在做培養(yǎng)基時常說的基本培養(yǎng)基均是培養(yǎng)基的名稱，如MS、B5、N6等。,MS基本培養(yǎng)基配方,在培養(yǎng)基配制時，為了使用方便和用量準(zhǔn)確，并減少工作量，常將培養(yǎng)基成分首先配制成比需要濃度大若干倍的母液，然后在配制培養(yǎng)基時，再根據(jù)所需濃度按比例稀釋。 因此培養(yǎng)基的配制包括母液的配制和培養(yǎng)基的配制。,三、培養(yǎng)基的配制,1. 培養(yǎng)基母液的配制 2. 培養(yǎng)基的配制,1. 培養(yǎng)基母液的配制,母液配制的目的 方便配置其他培養(yǎng)基； 保證各物質(zhì)成分的準(zhǔn)確性及配制時的快速移取,培養(yǎng)基母液的配制,母液配制時可分別配成大量元素、微量元素、鐵鹽、有機(jī)物和激素類等。配制時注意一些離子之間易

17、發(fā)生沉淀，如a2和42，a2 、g2和43-一起溶解后，會產(chǎn)生沉淀，一定要充分溶解再放入母液中。配制母液時要用蒸餾水或重蒸餾水。藥品應(yīng)選取等級較高的化學(xué)純或分析純。藥品的稱量及定容都要準(zhǔn)確。各種藥品先以少量水讓其充分溶解，然后依次混合。,母液配制的藥品與器材,藥品：配制MS培養(yǎng)基所需的藥品、生長調(diào)節(jié)物質(zhì)、蒸餾水、0.1mol/L的NaOH，0.1mol/L的HCL,器材：各類天平、燒杯、容量瓶、量筒、 母液瓶、標(biāo)簽、冰箱等。,(1).無機(jī)大量母液(擴(kuò)大10倍配1L ),成 分,硝酸鉀硝酸銨 硫酸鎂磷酸二氫鉀 氯化鈣,稱量工具,注意：無機(jī)大量母液中的各種物質(zhì)在混合過程中有些離子易產(chǎn)生沉淀，應(yīng)使每

18、種物質(zhì)先充分溶解，再進(jìn)行混合，而且鈣鹽最后緩慢加入進(jìn)去。,MS培養(yǎng)基配方,插入,硼酸，硫酸銅， 硫酸錳，硫酸鋅， 氯化鈷，鉬酸鈉， 碘化鉀,用分析天平按表準(zhǔn)確稱取藥品后，分別溶解，混合后加水定容至1000ml。,(2).無機(jī)微量母液（擴(kuò)大100倍配1000ml）,稱量工具,成分,鐵鹽母液（200）: 鐵鹽必須單獨(dú)配制，若同其他無機(jī)元素混合配成母液，易造成沉淀。配法是將5.57g FeSO4.7H2O水溶液緩慢加入到7.45gNa2EDTA微沸水溶液中，并不斷攪拌，最后定容到1000ml，用時每配1000ml培養(yǎng)基取5ml。,(3)、鐵鹽（擴(kuò)大100倍1000ml）,鐵鹽,硫酸亞鐵， Na2-E

19、DTA,注意：鐵鹽采用托盤天平稱取。鐵鹽選用硫酸亞鐵而不用硫酸鐵，是因為它溶解后易產(chǎn)生紅色的氫氧化鐵沉淀。,(4)、有機(jī)物（擴(kuò)大50倍1000ml）,有機(jī)物,甘氨酸 VB1 VB6 煙酸 肌醇,注意：有機(jī)物中的物質(zhì)均采用托盤天平和電子天平 稱取。,有機(jī)元素,(5)、激素母液（常用的）,生長素,NAA，IBA， 2,4-D，IAA,細(xì)胞分裂素,6-BA，KT， GA，ZT,注意：這些激素配制時，一般配成1mg/ml，,I AA、IBA、GA先溶于少量的的酒精中再加水定容到一定濃度。 NAA可溶于熱水或少量的酒精中，再加水定容到一定濃度。 2,4-D可用少量溶解后，再加水定容到濃度。 Kt和BA先

20、溶于少量1mol的NaOH中再加水定容。 玉米素先溶于少量的酒精中，再加熱水到一定濃度。,配制好的母液瓶上應(yīng)分別貼標(biāo)簽，注明母液名稱、配制倍數(shù)、日期及配一升培養(yǎng)基時應(yīng)取的量。 母液的標(biāo)法： 10；100或1000 5ml/L, 10ml/L 1mg/ml,母液的保存,(1) 裝瓶: 將配制好的母液分別倒入瓶中，貼好標(biāo)簽，在標(biāo)簽上注明母液名稱，配制倍數(shù)，與配制日期。 （2）儲藏： 母液配好后放人冰箱內(nèi)4低溫保存，用時再按比例稀釋。,2. 培養(yǎng)基的配制,用具器材：粗天平、塑料量杯、燒杯、量筒、移液管、三角瓶、玻璃棒、藥勺、PH試紙（5.4-9.0）、橡皮吸球、吸水紙。,藥品試劑：蒸餾水、蔗糖、瓊脂

21、、1mol/L NaOH、 1mol/L HCL、各種培養(yǎng)基母液,實驗用品,培養(yǎng)基配制（以1L百合繼代培養(yǎng)基為例）,培養(yǎng)基配方：,MS+6-BA1.5mg/L+NAA0.2mg/L+3%蔗糖+0.8%瓊脂,配方成分計算：,配制步驟,混合,溶化瓊脂（600-700ml）,母液的量取,加蔗糖,溶解 液,定容（1L）,調(diào)PH（5.8）,分裝,1.量取前先檢查母液并搖動 2.量母液前,移液管和量筒應(yīng)潤洗,培養(yǎng)基的分裝與滅菌,培養(yǎng)基合成后，要趁熱分裝，100ml的容器約裝入30-40ml培養(yǎng)基，即1升培養(yǎng)基約裝35瓶左右。太多則浪費(fèi)培養(yǎng)基，太少不易接種和影響生長。但要根據(jù)培養(yǎng)對象來決定。如果培養(yǎng)時間較長

22、時，應(yīng)適當(dāng)多裝培養(yǎng)基；生根等短期培養(yǎng)時，可適當(dāng)少加培養(yǎng)基。分裝時不要把培養(yǎng)基弄到管壁上，以免日后容易污染。裝后用封口材料包上瓶口，扎口后，寫上培養(yǎng)基種類，準(zhǔn)備滅菌。注意不能放置時間過長，以免產(chǎn)生污染 。,滅菌 由于培養(yǎng)基內(nèi)有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，極利細(xì)菌和真菌繁殖，造成污染，影響組培的成功，一般有高溫高壓消毒和過濾消毒兩種方法。,動物培養(yǎng)基及其配制,動物細(xì)胞的營養(yǎng)要求比植物細(xì)胞要復(fù)雜。目前，還必須在培養(yǎng)基中添加血清等成分不明的天然成分，在成分完全明確的培養(yǎng)基中，細(xì)胞還不能生長繁殖。 動物細(xì)胞培養(yǎng)基通常是液態(tài)的。 根據(jù)其是否促進(jìn)細(xì)胞生長，可分為： 生長培養(yǎng)基 維持培養(yǎng)基,生長培養(yǎng)基：是使培養(yǎng)細(xì)胞快速生長增殖的培養(yǎng)基。 維持培養(yǎng)基：只是維持培養(yǎng)細(xì)胞存活，不能促使細(xì)胞生長和增殖的培養(yǎng)基。培養(yǎng)細(xì)胞處