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GB5413.20—2013

2013-11-29發(fā)布2014-06-01實施

食品安全國家標準

嬰幼兒食品和乳品中膽堿的測定

GB5413.20—2013

I

前言

本標準代替GB/T5413.20—1997《嬰幼兒配方食品和乳粉膽堿的測定》。

本標準與GB/T5413.20—1997相比，主要變化如下：

——修改了標準的名稱；

——修改了用于酶反應的顯色劑成分；

——增加了第二法雷氏鹽分光光度法。

GB5413.20—2013

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食品安全國家標準

嬰幼兒食品和乳品中膽堿的測定

1范圍

本標準規(guī)定了嬰幼兒食品和乳品中膽堿的測定方法。

本標準適用于嬰幼兒食品和乳品中膽堿的測定。

第一法酶比色法

2原理

試樣中的膽堿經(jīng)酸水解后變成游離態(tài)的膽堿，再經(jīng)酶氧化后與顯色劑反應生成有色物質(zhì)，其顏色

的深淺在一定濃度范圍內(nèi)與膽堿含量成正比。

3試劑和材料

注：除非另有說明，本方法所用試劑均為分析純，水為GB/T6682規(guī)定的三級水。

3.1試劑

3.1.1三羥甲基氨基甲烷[(CH2OH)3CNH2]。

3.1.2苯酚(C6H5OH)。

3.1.3濃鹽酸(HCl)。

3.1.4氫氧化鈉(NaOH)。

3.1.5膽堿氧化酶：置于-20℃保存。

3.1.6過氧化物酶：置于2℃~8℃保存。

3.1.74-氨基安替比林(C11H13N3O)。

3.1.8磷脂酶D：置于-20℃保存。

3.2試劑配制

3.2.1鹽酸(1mol/L)：量取85mL濃鹽酸加水稀釋至1000mL。

3.2.2鹽酸(3mol/L)：量取125mL濃鹽酸加水稀釋至500mL。

3.2.3Tris緩沖溶液（0.05mol/L）：pH=8.0±0.2。

稱取6.057g三羥甲基氨基甲烷溶入500mL蒸餾水中，用1mol/L鹽酸調(diào)pH至8.0±0.2，用蒸餾水定

容至1000mL。此溶液在4℃冰箱中可保存一個月。

3.2.4用于酶反應的顯色劑：取100~120活力單位的膽堿氧化酶、250~280活力單位的過氧化物酶、

75個~100個活力單位的磷脂酶D、15mg4-氨基安替比林，50mg苯酚置于100mL的容量瓶中，用0.05

mol/LTris緩沖溶液稀釋至刻度。臨用時配制。

3.2.5氫氧化鈉溶液(500g/L)：稱取500g氫氧化鈉，溶于水并稀釋至1000mL。

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3.3標準品

膽堿酒石酸氫鹽標準品（C9H19NO7）：純度≥99%。

3.4標準溶液配制

3.4.1膽堿氫氧化物標準貯備溶液（2.5mg/mL）：稱取在102℃±2℃烘至恒重的膽堿酒石酸氫鹽523

mg置于100mL容量瓶中，用蒸餾水稀釋至刻度。冷藏于4℃±2℃冰箱中，保存不超過1周。

3.4.2膽堿氫氧化物標準工作溶液（250μg/mL）：吸取10.0mL標準貯備溶液于100mL容量瓶中，

用水稀釋至刻度。臨用時配制。

4儀器和設備

4.1天平：感量為0.01g和0.1mg。

4.2恒溫水浴鍋：溫度可控制在70℃±2℃和37℃±2℃。

4.3pH計：精度0.01。

4.4分光光度計。

5分析步驟

5.1試樣制備

5.1.1固體試樣

稱取5g（精確到0.01g）混合均勻的試樣，于100mL的錐形瓶中，加入30mL鹽酸溶液（3.2.1）。

5.1.2液體試樣

稱取20g（精確到0.01g）混合均勻的試樣，于100mL的錐形瓶中，加入10mL鹽酸溶液（3.2.2）。

5.1.3水解

將裝有試樣的容器放在70℃水浴中，加塞混勻，水解3h（每隔30min振搖一次），冷卻。用氫

氧化鈉溶液調(diào)pH為3.5～4.0，轉(zhuǎn)入50mL容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度。

5.1.4過濾

過濾水解液（5.1.3）。濾液應是澄清的，否則，用0.45μm的濾膜再次過濾。濾液放在4℃的冰箱

中可以保存3d。

5.2測定

5.2.1標準曲線的制作

分別吸取2mL、4mL、6mL、8mL膽堿氫氧化物標準工作溶液于10mL的容量瓶中，用蒸餾水稀

釋至刻度。準備6支試管，一個試管用作試劑空白（A），另五支試管由1至5編號，分別用于標準溶液

和標準溶液的四個稀釋度。按表1加入試劑。

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表1制作標準曲線時的試劑添加量

單位為毫升

試劑管A管1管2管3管4管5

稀釋度1/（50μg/mL）—0.100————

稀釋度2/（100μg/mL）——0.100———

稀釋度3/（150μg/mL）———0.100——

稀釋度4/（200μg/mL）————0.100—

標準溶液/（250μg/mL）—————0.100

蒸餾水0.100—————

發(fā)色劑3.003.003.003.003.003.00

用密封保護膜蓋住試管，混勻，把試管置于37℃水浴中保溫反應15min。

5.2.2試樣的測定

將每個試樣準備2支試管（B，C），按表2加入試劑。

表2測定試樣時的試劑添加量

單位為毫升

試劑

試管B

濾液空白

試管C

試樣

待分析濾液0.1000.100

蒸餾水3.00—

發(fā)色劑—3.00

用密封保護膜蓋住試管，混勻。把試管置于37℃水浴中保溫反應15min。

5.2.3比色測定

將試樣及標準系列溶液從水浴中取出，冷卻至室溫。在波長505nm處，用蒸餾水作空白，測定

吸光值。以膽堿標準溶液的濃度為橫坐標，以標準溶液的吸光值減去試劑空白的吸光值為縱坐標，制

作標準曲線。

6分析結(jié)果的表述

6.1凈吸光值的計算

通常新鮮配制的試劑會產(chǎn)生輕微顏色，且由于水解作用濾液也不是無色的，為了除去這些干擾因素，

應該從總吸光值中減去各自的空白值（管A和管B）。

試樣凈吸光值計算如公式（1）所示：

exbltot

AAAA

…………………（1）

式中：

A——試樣凈吸光值；

Atot——總吸光值（管C）；

Abl——試劑吸光值（管A）；

Aex——濾液吸光值（管B）。

Abl和Aex不應大于總吸光值的20%，對于標準曲線，Aex=0。

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6.2膽堿含量的計算

在標準曲線上查出凈吸光值的位置，并記下相應的濃度c，以每100g試樣中膽堿氫氧化物的毫克

數(shù)表示膽堿的含量（X），單位為（mg/100g），試樣中的膽堿氫氧化物含量按公式（2）計算：

1000

100

m

Vc

X…………………（2）

式中：

X——試樣中的膽堿氫氧化物含量，單位為毫克每百克（mg/100g）；

c——自標準曲線上查得的膽堿氫氧化物的濃度，微克每毫升（μg/mL）；

V——水解液被稀釋的體積（通常為50mL），單位為毫升（mL）；

m——試樣的質(zhì)量，單位為克（g）；

1000——換算系數(shù)。

計算結(jié)果以重復性條件下獲得的兩次獨立測定結(jié)果的算術平均值表示，結(jié)果保留整數(shù)位。

7精密度

在重復性條件下獲得的兩次獨立測定結(jié)果的絕對差值不得超過算術平均值的8%。

8其他

方法檢出限為1mg/100g，定量限為3mg/100g。

第二法雷氏鹽分光光度法

9原理

試樣中的膽堿用氫氧化鋇-甲醇-三氯甲烷混合溶液水解抽提，經(jīng)弗羅里硅土層析凈化，與雷納克

銨鹽溶液形成粉紅色的膽堿雷納克銨鹽，用丙酮溶解洗脫，于526nm測定吸收值。在一定濃度范圍

內(nèi)，膽堿雷納克銨鹽顏色的深淺與其含量成正比。

10試劑和材料

注：除非另有說明，本方法所用試劑均為分析純，水為GB/T6682規(guī)定的三級水。

10.1試劑

10.1.1弗羅里硅土：100目～200目，650℃活化。

10.1.2甲醇（CH3OH）。

10.1.3三氯甲烷（CHCl3）。

10.1.4氫氧化鋇[Ba（OH）2·8H2O]。

10.1.5冰乙酸（CH3COOH）。

10.1.6乙酸甲酯（C3H6O2）。

10.1.7丙酮(CH3COCH3)。

10.1.8雷納克銨鹽(C4H10CrN7S4)。

10.2試劑配制

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10.2.1飽和氫氧化鋇-甲醇-三氯甲烷溶液：稱取6g氫氧化鋇溶于100mL甲醇中，放入超聲波中

溶解后，加入10mL三氯甲烷，混勻。

10.2.2冰乙酸-甲醇溶液(1+10)：1體積冰乙酸與10體積甲醇混合。

10.2.3雷納克銨鹽溶液：稱取0.25g雷納克銨鹽，加入10mL水中，放入超聲波中溶解后過濾，臨

用時配制。

10.3標準品

膽堿酒石酸氫鹽(C9H19NO7)：純度≥99%。

10.4標準溶液配制

膽堿酒石酸氫鹽標準溶液(1g/L)：準確稱取在102℃±2℃烘至恒重的膽堿酒石酸氫鹽0.1000g，

用蒸餾水定容至100mL容量瓶中。冷藏于4℃±2℃冰箱中，保存不超過一周。

11儀器和設備

11.1天平：感量為0.01g和0.1mg。

11.2回流裝置：250mL磨口錐形瓶及回流裝置。

11.3恒溫水浴鍋：溫度可控制在79℃±2℃。

11.4層析柱：長約10cm、內(nèi)徑1cm的帶50mL杯口的玻璃柱。

11.5分光光度計。

12分析步驟

12.1試樣制備

稱取固體試樣10g(精確到0.01g)，稱取液體試樣20g(精確到0.01g)于磨口錐形瓶中，加入50mL

氫氧化鋇-甲醇-三氯甲烷提取液?；旌暇鶆蚝蠼尤牖亓餮b置，于79±2℃的水浴鍋內(nèi)水解抽提4h。每

隔1h震蕩一次，以避免試樣結(jié)塊。水解抽提結(jié)束后，取出錐形瓶冷卻至室溫，過濾。濾渣用冰乙酸-

甲醇混合液洗滌3次～4次，洗液一并收集于100mL容量瓶中。用甲醇定容至刻度，混勻。

12.2標準曲線的繪制

12.2.1層析柱制備

用乳膠管連接層析柱與滴頭，用少量脫脂棉堵住層析柱底部，倒入約5cm左右高的弗羅里硅土，

用甲醇浸濕，備用。

12.2.2層析

分別吸取膽堿標準溶液0mL、1.0mL、2.0mL、3.0mL、4.0mL、5.0mL注入層析柱中，當溶液

完全進入柱床后，依次用5mL和10mL甲醇，20mL乙酸甲酯洗滌層析柱。再加入5mL雷納克銨鹽

溶液，用適量的冰乙酸洗去過量的雷納克銨鹽，直至層析柱上無雷納克銨鹽附著處呈現(xiàn)硅土原有的白

色。用丙酮洗脫粉紅色的膽堿雷納克銨鹽，收集于10mL的容量瓶中，用丙酮定容（如果洗脫液混濁

需過0.45μm的濾膜）。在波長526nm處測定溶液的吸光值，以膽堿酒石酸氫鹽含量為橫坐標（mx），

吸光值為縱坐標繪制標準曲線。

12.3試樣的測定

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吸取10mL試樣水解液（12.1）于層析柱中，其余操作按照12.2.2進行。自標準曲線上查得10mL

試樣水解液中膽堿酒石酸氫鹽的含量。

13分析結(jié)果的表述

試樣中的膽堿以膽堿氫氧化物計，以毫克每百克（mg/100g）表示，按公式（3）計算：

474

.0

100

100

V

m

m

X

x

…………………（3）

式中：

X——試樣中膽堿氫氧化物的含量，單位為