中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)

GB5009.259—2016

食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)

食品中生物素的測(cè)定

2016-08-31發(fā)布2016-09-20實(shí)施

中華人民共和國

國家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)

發(fā)布

GB5009.259—2016

Ⅰ

前言

本標(biāo)準(zhǔn)代替GB5413.19—2010《嬰幼兒食品和乳品中游離生物素的測(cè)定》。

本標(biāo)準(zhǔn)與GB5413.

19—2010相比,主要變化如下:

———標(biāo)準(zhǔn)名稱修改為“食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中生物素的測(cè)定”;

———修改了標(biāo)準(zhǔn)曲線管和待測(cè)液管制備的表述方式;

———修改了測(cè)定步驟表達(dá)方式;

———增加了谷薯類、肉類、新鮮果蔬、藻類試樣、蛋類、豆類、堅(jiān)果類、內(nèi)臟、強(qiáng)化生物素的食品處理

過程;

———?jiǎng)h除了儀器和設(shè)備中通用玻璃器皿的描述。

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1

食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)

食品中生物素的測(cè)定

1范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了食品中生物素的測(cè)定方法。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于食品中生物素的測(cè)定。

2原理

生物素是植物乳桿菌(

Lactobacillusplantarum)生長所必需的營養(yǎng)素。在生物素測(cè)定培養(yǎng)基中,

植物乳桿菌的生長與待測(cè)試樣中生物素含量呈線性關(guān)系,根據(jù)透光率與標(biāo)準(zhǔn)工作曲線進(jìn)行比較,即可計(jì)

算出試樣中待測(cè)物質(zhì)的含量。

3試劑和材料

除非另有說明,本方法所用試劑均為分析純,水為GB/T6682規(guī)定的二級(jí)水。

3.1試劑

3.1.1無水乙醇(C2H6O)。

3.1.2氫氧化鈉(NaOH)。

3.1.3鹽酸(HCl)。

3.1.4檸檬酸鹽。

3.1.5α-淀粉酶:≥1.5U/

mg

。

3.1.6木瓜蛋白酶:≥5U/

mg

。

3.1.7硫酸(H2SO4)。

3.2試劑配制

3.2.1乙醇溶液(50%):量取500mL無水乙醇與500mL水混勻。

3.2.2氫氧化鈉溶液(0.5mol

/L):稱取20g氫氧化鈉,溶于1000mL水中,混勻。

3.2.3氯化鈉溶液(0.85%):稱取8.5g氯化鈉,加水溶解并稀釋至1000mL,混勻。

3.2.4鹽酸溶液(1mol

/L):吸取83mL鹽酸,用水稀釋至1000mL,混勻。

3.2.5檸檬酸鹽緩沖液(pH4.5):稱取1.5g檸檬酸至一個(gè)100mL帶磁力攪拌器的燒杯中,加入約

50mL蒸餾水至溶解,再加入12mL的NaOH(1mol

/L),調(diào)節(jié)

pH

至4.

5(用0.1mol

/LHCl),將溶液

轉(zhuǎn)入100mL容量瓶中,并用蒸餾水定容。該緩沖液可在2℃~8℃儲(chǔ)存3d。

3.2.6蛋白酶-淀粉酶液:分別稱取200mg木瓜蛋白酶和α-淀粉酶,加入20mL水研磨至勻漿,

3000r/min離心5min~10min?，F(xiàn)用現(xiàn)配。

3.2.7硫酸溶液(3%):量取30mL硫酸加入到1000mL水混勻。

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2

3.3標(biāo)準(zhǔn)品

生物素(

d-Biotin或VitaminH)標(biāo)準(zhǔn)品(C10H16N2O3S):純度≥99%。

3.4標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

3.4.1生物素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(100μg/mL):精確稱取100mg生物素標(biāo)準(zhǔn)品,用乙醇溶液(50%)溶解并轉(zhuǎn)

移至1000mL容量瓶中,定容至刻度。儲(chǔ)存于棕色瓶中,于2℃~4℃冰箱保存12個(gè)月。

3.4.2生物素標(biāo)準(zhǔn)中間液(1.0μg/mL):準(zhǔn)確吸取1.00mL生物素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液置于100mL棕色容量瓶

中,用乙醇溶液(

50%)稀釋并定容至刻度,混勻后儲(chǔ)存于瓶中2℃~4℃冰箱保存6個(gè)月。

3.4.3生物素標(biāo)準(zhǔn)工作液(10ng/mL):準(zhǔn)確吸取1.00mL生物素標(biāo)準(zhǔn)中間液置于100mL容量瓶中,

用水稀釋定容至刻度,混勻。臨用前現(xiàn)配。

3.4.4標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液(10ng/mL):分兩個(gè)濃度,高濃度溶液的濃度為0.2ng/mL;低濃度溶液的濃度

為0.

1ng

/mL。從工作液中吸取兩次各5mL,用水分別定容到250mL和500mL。

3.5培養(yǎng)基

3.5.1乳酸桿菌瓊脂培養(yǎng)基:可按附錄A配制。

3.5.2乳酸桿菌肉湯培養(yǎng)基:可按附錄A配制。

3.5.3生物素測(cè)定用培養(yǎng)基:可按附錄A配制。

注:一些商品化合成培養(yǎng)基效果良好,商品化合成培養(yǎng)基按標(biāo)簽說明進(jìn)行配制。

4儀器和設(shè)備

4.1天平:感量0.1mg。

4.2恒溫培養(yǎng)箱:37℃±1℃。

4.3壓力蒸汽消毒器:121℃(0.10mPa~0.12mPa)。

4.4漩渦振蕩器。

4.5離心機(jī):轉(zhuǎn)速≥2000r/min。

4.6分液器:0mL~10mL。

4.7可調(diào)式電爐。

4.8pH計(jì):精度±0.01。

4.9分光光度計(jì)。

4.10超凈工作臺(tái)。

注:玻璃儀器使用前,用活性劑(月桂磺酸鈉或家用洗滌劑加入到洗滌用水中即可)對(duì)硬玻璃測(cè)定管及其他必要的

玻璃器皿進(jìn)行清洗,清洗之后200℃干熱2h。

5菌種的制備與保存

5.1菌種

植物乳桿菌Lactobacillusplantarum(ATCC8014)。

5.2儲(chǔ)備菌種的制備

5.2.1將菌種植物乳桿菌Lactobacillusplantarum(ATCC8014)轉(zhuǎn)接至乳酸桿菌瓊脂培養(yǎng)基中,在

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37℃±1℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20h~24h,取出后放入2℃~4℃冰箱中保存。每月至少傳種一次,作

為儲(chǔ)備菌株保存。

5.2.2將儲(chǔ)備菌株接種至乳酸桿菌瓊脂培養(yǎng)基中,在37℃±1℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20h~24h以活化

菌株,用于接種液的制備。保存數(shù)周以上的儲(chǔ)備菌種,不能立即用作接種液制備,試驗(yàn)前應(yīng)連續(xù)傳種

2代~3代以保證細(xì)菌活力。

5.3接種液的制備

用接種環(huán)將活化的菌株轉(zhuǎn)種至已滅菌的乳酸桿菌肉湯中,于37℃±1℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16h~

20h。取出后將菌懸液離心棄去上清液,再用氯化鈉溶液(0.85%)振勻并離心棄去上清液,如此三次。

最后用氯化鈉溶液(

0.85%)稀釋至透光率80%。

6分析步驟

6.1試樣制備

谷薯類、豆類、乳粉等試樣需粉碎、研磨、過篩(篩板孔徑0.

3mm~0.5mm);肉、蛋、魚、堅(jiān)果等用打

碎機(jī)制成食糜;果蔬、半固體食品等試樣需勻漿混勻;液體試樣用前振搖混合。4℃冰箱保存,

1周內(nèi)

測(cè)定。

6.2試樣提取

6.2.1薯類、肉類、乳類、新鮮果蔬、藻類試樣、蛋類、豆類、堅(jiān)果類、動(dòng)物內(nèi)臟等天然食品。準(zhǔn)確稱取適

量均質(zhì)樣品(

m)(約含0.2μg~0.5μg生物素),精確至0.001g,至一個(gè)50mL錐形瓶中,加入30mL檸

檬酸緩沖液振搖后于121℃高壓水解15min。樣品取出后迅速冷卻至室溫,加入1mL蛋白酶-淀粉酶

溶液置于36℃±1℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)溫育酶解16h~20h,

95℃水浴中加熱30min,然后迅速冷卻至室

溫,轉(zhuǎn)至100mL容量瓶中,用水定容至刻度(

V1)。

6.2.2嬰幼兒配方食品、谷物類等制品(包括原生和添加的生物素):準(zhǔn)確稱取適量樣品(m)(約含

0.2μg~0.5μg生物素),精確至0.001g,至一個(gè)250mL錐形瓶中加入硫酸溶液100mL,121℃水解

30min,冷卻后用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)

pH

至4.

5±0.2,轉(zhuǎn)到250mL容量瓶中,用水定容,充分混合。用

濾紙過濾,棄去最初的幾毫升。吸取濾液5mL,加入約20mL水,用氫氧化鈉溶液調(diào)

pH

為6.

8±0.2,

轉(zhuǎn)至100mL容量瓶中,用水定容至刻度(

V1)。

6.2.3強(qiáng)化生物素的飲料或維生素預(yù)混料等樣品:液體飲料加5mL~10mL樣品至100mL錐形瓶

中,加50mL水,混勻,轉(zhuǎn)入100mL容量瓶中,用水定容至刻度(

V1);維生素預(yù)混料:準(zhǔn)確稱取適量樣

品(

m),精確至0.001g,到500mL錐形瓶中,加入約300mL水,混勻。調(diào)整

pH

到8.

0±0.2,轉(zhuǎn)入

1000mL容量瓶中,用水定容至刻度(V1)。

6.3稀釋

根據(jù)試樣中生物素含量用水對(duì)試樣提取液進(jìn)行適當(dāng)稀釋,使稀釋后試樣提取液中生物素含量在

0.01ng/mL~0.1ng/mL范圍內(nèi)。

6.4測(cè)定系列管制備

6.4.1試樣系列管

取4支試管,分別加入1.

0mL、2.0mL、3.0mL、4.0mL試樣提取液,補(bǔ)水至5.0mL,加入5.0mL

生物素測(cè)定用培養(yǎng)液,混勻。每個(gè)梯度做3個(gè)平行。

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6.4.2標(biāo)準(zhǔn)系列管

取試管分別加入標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液低濃度0.

0mL(未接種空白)、0.0mL(接種空白)、1.0mL、

2.0mL、3.0mL、4.0mL、5.00mL、和高濃度3.0mL、4.0mL、5.0mL,補(bǔ)水至5.00mL,相當(dāng)于標(biāo)準(zhǔn)系列

管中生物素含量為0.

00ng、0.00ng、

0.1ng、0.2ng、0.3ng、0.4ng、0.5ng、0.6ng、0.8ng、1.00ng。加

5.0mL生物素測(cè)定用培養(yǎng)液,混勻。每個(gè)梯度做3個(gè)平行,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí),以每點(diǎn)均值計(jì)算。

6.5培養(yǎng)

6.5.1滅菌:所有的試管蓋上試管帽,放入滅菌釜內(nèi),121℃(0.10mPa~0.12mPa)滅菌5min。

6.5.2接種和培養(yǎng):試管快速冷卻至室溫,在無菌操作條件下,將接種液轉(zhuǎn)入無菌針管,向每支測(cè)定管

接種一滴(約50μL)其中標(biāo)準(zhǔn)曲線管中未接種空白和樣品空白除外。置于37℃±1℃恒溫培養(yǎng)箱中培

養(yǎng)19h~20h,直至獲得最大混濁度,即再培養(yǎng)2h透光率無明顯變化。

6.6測(cè)定

將培養(yǎng)好的測(cè)定管用漩渦混勻器混勻。用厚度為1cm比色杯,于550nm處,以接種空白管調(diào)節(jié)

透光率為100%,然后依次測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)系列管、試樣系列管吸光值。如果未接種空白對(duì)照管有明顯的細(xì)菌

增長,說明可能有雜菌混入,需重做試驗(yàn)。

注:試樣提取液也可采用預(yù)先包埋了菌種的微生物法生物素試劑盒測(cè)定,效果相當(dāng)。

6.7分析結(jié)果表述

6.7.1標(biāo)準(zhǔn)曲線:以標(biāo)準(zhǔn)系列管生物素含量為橫坐標(biāo),吸光值為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

6.7.2結(jié)果計(jì)算:從標(biāo)準(zhǔn)曲線查得樣液相應(yīng)含量(cx),如果每個(gè)試樣的3個(gè)測(cè)試管中有2個(gè)值落在

0.01ng~0.10ng范圍內(nèi),且每個(gè)測(cè)試管之間吸光值偏差小于10%,則按下式進(jìn)行結(jié)果計(jì)算。

測(cè)定液濃度按式(

1)計(jì)算:

c=c

x

Vx

…………(1)

式中:

c———樣液生物素濃度,單位為納克每毫升(

ng

/mL);

cx———從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得待測(cè)樣液生物素含量,單位為納克(

ng

);

Vx———制備系列管時(shí)吸取的試樣提取液體積,單位為毫升(mL)。

樣品中生物素含量按式(

2)計(jì)算:

X=

c×f

m

×

100

1000

…………(2)

式中:

X

———樣品中生物素含量,單位為微克每百克或毫升(

μg

/100g或mL);

c

———有效測(cè)試管試樣中生物素濃度平均值,單位為納克每毫升(

ng

/mL);

f

———樣液稀釋倍數(shù);

m

———樣品質(zhì)量,單位為克(g);

100

———換算系數(shù);

1000———換算系數(shù)。

計(jì)算結(jié)果以重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的算術(shù)平均值表示,結(jié)果保留三位有效數(shù)字。

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7精密度

在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的絕對(duì)差值不得超過算術(shù)平均值的10%。

8其他

本方法線性范圍為0.

01μg/mL~0.1μg/mL,檢出限為2.0μg/100g,定量限為4.0μg/100g。

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附錄A

培養(yǎng)基和試劑

A.1乳酸桿菌瓊脂培養(yǎng)基

A.1.1成分

胨化乳15.

0g,酵母浸膏5.

0g,葡萄糖10.

0g,番茄汁100mL,磷酸二氫鉀2.

0g,聚山梨糖單油酸

酯1.

0g,加水至1000mL,調(diào)節(jié)

pH

至6.

8±0.2(25℃±5℃)。

A.1.2制法

在A.

1.1中加入10.0g瓊脂,加熱