1、蛋白質結晶學和X光衍射基礎,分子酶學工程教育部重點實驗室 鄭柏松 講師,生物物理學生物大分子結構解析,授課內容,歷史的回顧 X光衍射原理 蛋白質表達、純化 蛋白質結晶 X光衍射及數據收集 結構解析,授課目的,了解生物物理學發(fā)展歷史與前沿； 掌握蛋白質結晶學和X光衍射基礎知識； 開闊視野貼近國際一流結構生物學實驗室； 培養(yǎng)興趣增強對科研工作的感性和理性認識。,蛋白質三維結構測定方法,X-射線晶體學 電子顯微學 (低溫電子顯微技術與三維象重構） 核磁共振波譜學,1895年德國物理學家倫琴發(fā)現X射線并因此獲得1901年首屆諾貝爾物理學獎，X射線歷經110年跨越3個世紀，由于眾多學者在探索X射線性質、

2、應用、儀器等方面的創(chuàng)新性研究，先后有29位物理學家、晶體學家、化學家、分子生物學家等分別獲得了物理（7項）、化學（9項）、生理學或醫(yī)學（3項）總計19項諾貝爾獎。,歷史的回顧,1912年勞厄獲得了X射線通過晶體后產生的衍射斑點圖像（勞厄衍射圖），證明了X射線的波動性及其波長范圍。隨后提出了表示原子排列周期與X射線波長間關系的著名的衍射方程（勞厄方程），并成功地解釋了晶體衍射的實驗結果。 英國物理學家布拉格父子、達爾文等人發(fā)展了X射線衍射理論，類比光學反射原理提出了表示晶體結構（晶面間距d）、X射線波長（）與衍射方位（）間的關系的布拉格方程，提出了嵌鑲晶體、完整晶體和包含有原子熱運動諸因素的衍射

3、強度公式，闡明了X射線通過晶體產生衍射的付里葉變換本質，獲得了X射線的連續(xù)光譜與取決于陰極材料的特征光譜。,歷史的回顧,最終X射線衍射成為有機分子（特別是生物活性分子）立體結構測定的有力工具，為研究生理活性物質（藥物分子）的立體結構、結構改造、結構預測、結構功能關系為目標的有機晶體學科奠定了基礎。 對于生物大分子的研究，始于30年代中期，貝納爾和藿奇金開始用X射線衍射方法研究胃蛋白酶的晶體結構，但直到布拉格主持凱文迪實驗室后，才使得這一工作取得突破，為創(chuàng)建分子生物學科奠定了基礎。 1953年沃森和克里克根據X衍射實驗數據建立了脫氧核糖核酸(DNA)的雙螺旋結構，并因此獲得1962年的諾貝爾生理

4、學和醫(yī)學獎。,歷史的回顧,肯德魯和佩盧茨從30年代開始，應用X衍射方法研究肌紅蛋白與血紅蛋白的晶體結構，歷經20多年的艱苦努力，在眾多科學家的共同參與下，終于在1960年獲得了這兩個蛋白質的三維結構，并因此榮獲1962年的諾貝爾化學獎。 在1957至1967年的10年中，相繼用X衍射方法測定了溶菌酶、胰島素、胰凝乳蛋白酶A、核糖核酸酶、核糖核酸酶S和羧肽酶的高分辨晶體結構。 戴森豪菲爾和胡貝爾、米海爾因測定紫色細菌光合作用中心的三維結構而獲得1988年的諾貝爾化學獎，形成了新的蛋白質晶體學科與結構分子生物學科。,歷史的回顧,X-射線,X 射線和可見光一樣屬于電磁輻射，但其波長比可見光短得多，介

5、于紫外線與 射線之間，約為102 到102 埃的范圍。,X光衍射原理,X-射線,X光衍射原理,X 射線和其它電磁波一樣，能產生反射、折射、散射、干涉、衍射、偏振和吸收等現象。但是，在通常實驗條件下，很難觀察到X 射線的反射。不可能像可見光那樣用透鏡成像。對于所有的介質，X 射線的折射率n都很接近于1（但小于1），所以幾乎不能被偏折到任一有實際用途的程度。 在物質的微觀結構中，原子和分子的距離（1 10 埃左右）正好落在X 射線的波長范圍內，所以物質（特別是晶體）對X 射線的散射和衍射能夠傳遞極為豐富的微觀結構信息。X 射線衍射方法是當今研究物質微觀結構的主要方法。 X 射線穿透物質時都會被部分

6、吸收,其強度將被衰減變弱；吸收的程度與物質的組成、密度和厚度有關。在此過程中X 射線與物質的相互作用是很復雜的，會引起多種效應。例如，可以使氣體電離；使一些物質發(fā)出可見的熒光；能破壞物質的化學鍵，引起化學分解，也能促使新鍵的形成，促進物質的合成；作用于生物細胞組織，還會導致生理效應，使新陳代謝發(fā)生變化甚至造成輻射損傷。 X 射線散射的過程又可分為兩種，一種是只引起X 射線方向的改變， 不引起能量變化的散射，稱為相干散射，這是X 射線衍射的物理基礎；另一種是既引起X 射線光子方向改變，也引起其能量的改變的散射，稱為不相干散射或康普頓散射（或康普頓效應），此過程同時產生反沖電子（光電子）。,衍射的

7、幾何方程,布拉格方程,勞埃（Laue）方程,X 射線照射到晶體上發(fā)生散射，其中衍射現象是X 射線被晶體散射的一種特殊表現。晶體的基本特征是其微觀結構（原子、分子或離子的排列）具有周期性，當X 射線被散射時，散射波中與入射波波長相同的相干散射波，會互相干涉，在一些特定的方向上互相加強，產生衍射線。 晶體可能產生衍射的方向決定于晶體微觀結構的類型（晶胞類型）及其基本尺寸（晶面間距，晶胞參數等）；而衍射強度決定于晶體中各組成原子的元素種類及其分布排列的坐標。,X光衍射原理,X光衍射原理,勞埃（Laue）方程和布拉格（Bragg）方程確定了衍射方向與晶體結構基本周期的關系，通過對衍射方向的測量，理論上

8、我們可以確定晶體結構的對稱類型和晶胞參數。而X射線對于晶體的衍射強度則決定于晶體中原子的元素種類及其排列分布的位置。,X光衍射原理,What we can do？,挑戰(zhàn)和機遇 ？,克隆、表達、純化 結晶 數據收集及處理 相角的測定 相角的改進（優(yōu)化） 電子密度圖的解釋 修正 結構的描述和與功能關系的研究,Structural Biology Processes,Recombinant protein over-expression and purification,Expression systems: Bacteria system Yeast Insect cells Mammalian

9、cells Cell-free system,蛋白質表達、純化,Some Vectors for E.coli Expression System,蛋白質表達、純化,Protein Expression in Yeast,Cloning of target gene to vector,Transform to yeast Pichia pastoris,Selection of recombinant yeast strain,Yeast cell culture for protein production,蛋白質表達、純化,Protein Expression in Insect Cel

10、ls,After recombination,Cloning of target gene to pFastBac,Transform to bacteria with Bacmid,Bacmid transfected to insect cells,Virus assembly in insect cells,Viruses infect Insect Cells for protein production,Strains for expression: Sf9, Sf21, Hi5,蛋白質表達、純化,Transient Expression In Mammalian Cells,293

11、E cell can be cultured in suspension medium,Recombinant plasmid with target gene,Transfect to 293E cells with PEI,Harvest cells for protein purification,蛋白質表達、純化,293EBNA1 Cells With GFP Expressing Vector,A,B,Whole cells on plate; Cells in the same plate to A viewed by GFP florescence,蛋白質表達、純化,Recomb

12、inant Proteins Expression In 293EBNA1 Cells,Lanes: 1. Protein standard; 2. Control whole 293E cells; 3. GFP expressed 293E cells; 4. HCF-1N380 expressed 293E cells; 5. HCF-1N16-363 expressed 293E cells.,Recombinant protein 1 (lane 4),1 2 3 4 5,14,20,31,45,67,94,Recombinant protein 2 (lane 5),GFP (la

13、ne3),蛋白質表達、純化,Cell-free System for Protein Production,Sometimes it can produce soluble protein which can not be expressed as soluble form with cellular system.,Roche: Rapid Translation System (RTS),Rapid protein expression,Toxic protein expression,蛋白質表達、純化,ProteinProtein Complex Expression and Purif

14、ication: a. Proteins express separately; b. Proteins co-express in one cell. 2. Protein-Nucleic Acid： a. Protein-DNA Complex； b. Protein-RNA Complex.,Producing Protein Complexes for Crystallization,蛋白質表達、純化,Methods for production of recombinant protein complexes by in vivo reconstitution in E. coli

15、1. Use compatible vectors, such as pMR101(p15A ori) and pET15B(pBR322 ori); 2. Use one vector with more than one expression cassettes-polycistronic； Benefits of in vivo reconstitution (coexpression) efficiency one round of expression one round of purification quality coexpression and cofolding of po

16、lypeptides in the presence of cellular chaperones may increase yield of functional complex,ProteinProtein Complex Expression and Purification,蛋白質表達、純化,ProteinDNA Complex,Protein solubility: higher in high salt buffer usually; Protein-DNA complex stability: more stable than protein alone; DNA length

17、and sequence used for crystallization: a. additional base pairs; b. sticky ends; 4. Purification of DNA oligos: HPLC with hydrophobic interaction, C4 etc; 5. Trapping reaction intermediate: disulfide bridge; protein point mutation, etc; 6. Preparation of protein-DNA complexes: mix with extra molar D

18、NA; Crystallization: PEG or MPD in low slat buffer; Example: over 6000 trial for protein-DNA complex.,蛋白質表達、純化,Protein-RNA Complex,Difficulties: avoid of RNase! 1. Phosphate groups interfere crystal packing; 2. Elongated RNAs pack loosely; RNA engineering: blunt or sticky ends; deletion, replacement

19、, etc; RNA preparation: 1. Synthesis; 2. In vitro transcription;,蛋白質表達、純化,Protein Modification for Crystallization,Protein inhibitor, partner and monoclonal antibody; Protein post-translational modification; 3. Protein mutagenesis: truncation, mutation, deletion,蛋白質表達、純化,Purification,Fundamental Pur

20、ification Techniques Affinity: by tags or antibodies; Ion exchange; Size exclusion; Hydrophobic interaction; Aim: Obtain high purity and homogenous protein sample,蛋白質表達、純化,蛋白質表達、純化,Purity Some chemical factors: pH, precipitant, ion strength, specific ions, etc; Some physical factors: temperature, cr

21、ystallization method, time, etc.,Homogeity: purity is very important; Solubility: dissolve protein to high concentration; Stability: maintain protein as stable as possible; Supersaturation: alter the properties of solution for supersaturation; Association: try to promote ordered association; Nucleat

22、ion: try to promote the formation of nuclei; Variety: try as many methods as possible; Liquid impurities: avoid impurities in the mother liquid; Preservation: protect plate and crystal from shock and disruption;,Conclusions: some important principles,Screening,Robotic,Manual,Cheap Readily available

23、Allows for creativity,Multitude of conditions Highly reproducible Easy to document and track data Lower consumption of protein,結 晶,蛋白質的結晶,CrystalMation,蛋白質的結晶,X光光源及探測器,收集X光衍射數據的主要硬件設備： X光光源 單色器 X光探測器,X光光源,密封X-射線管（sealed x-ray tubes） 旋轉陽極管（rotating anode tubes） 同步輻射 ( Synchrotron Radiation),X光光源密封X-射

24、線管,在密封X-射線管中，陰極發(fā)射電子，因為管子處于真空狀態(tài)，相對于金屬陽極，陰極有很高的負電勢，電子被加速并以很高的速度到達陽極。陽極通常是銅板。 電子能量的大部份轉變成熱量。一小部分能量以兩種不同的X射線的形式發(fā)出來。,密封X-射線管X射線產生原理,銅陽極靶的X-射線管的光譜。,平滑的連續(xù)區(qū)域是減速（或加速）的帶電粒子發(fā)出的電磁輻射造成的。 銳鋒則是由于電子在陽極物質的原子的內部軌道中發(fā)生躍遷時產生的高能電子轟擊陽極原子，原子的低能級電子被轟擊出來，而高能級電子占據空軌道，在這一過程中便釋放出特定波長的X射線。 由于L層的精細結構，K分裂為K1和K2兩條譜線。M層的能級很靠近，因此K只是一

25、個單峰。 為了得到光譜中特定波長的譜線，需要一個最小激發(fā)電壓 。 加大電壓或者增大管電流可以增加衍射的強度。 局限性：在聚焦點處電子束對陽極所產生的致熱作用限制了X射線管的最大功率。功率太大將毀壞射線管。,X光光源旋轉陽極管,與密封X-射線管類似，只是用可旋轉的柱體代替固定的金屬片。 比密封管的優(yōu)點是它較高的輻射強度，伴隨的缺點是必須連續(xù)的抽氣以保持其所需的真空度。,X光光源同步輻射,藝術家畫的座落于格勒諾布爾法國東南部城市Grenoble的歐洲同步輻射裝置。 周長是844.39米。 同步輻射器是一個龐大而且昂貴的裝置。環(huán)的直徑有10到幾百米的大小。,X光光源同步輻射（原理）,同步輻射儀是以同

26、步加速器為基礎構建而成。 同步加速器是使帶電粒子（負電子或正電子）以近光速回轉的裝置。粒子從線性加速器或輔助同步輻射裝置直接注入儲存環(huán)。 粒子在電場和磁場共同作用下運動。其的軌跡由它們的能量及使帶電粒子改變方向的磁場決定。 當粒子束改變方向時，負電子或正電子便向環(huán)中心方向加速，釋放出電磁輻射，進而釋放能量。能量的損失由每次循環(huán)的射頻輸入來補償。 由于自由運動的電子(和正電子) 是無法量子化的，依賴帶電粒子的能量和磁場強度的不同，所產生的輻射的范圍很廣。,同步輻射的特性,高強度(intensity) 僅用彎曲磁場它就能產生比普通X射線發(fā)生器高兩個數量級的輻射，而用多極搖擺磁場或波紋磁場能產生更高

27、數量級的輻射。非常適用于衍射能力弱的樣品的數據收集。另一個優(yōu)點是射線的低發(fā)散度，這導致清晰的衍射點。 可調性(tunability) 同步輻射在可調性上也與X光發(fā)生管不同用單色器可以選取光譜范圍內任何合適的波長。 偏振（polarization） 來源于X光管的X射線是非偏振的，同步輻射則是高度偏振的。射線的偏振對原子的反常X射線散射有影響。,X光探測器-獲得最終數據,四圓衍射儀,DIP X射線面探測儀,CCD X射線檢測儀,ACTOR: Automated Crystal Transfer, Orientation and Retrieval,蛋白質的結晶,Ultimate HomeLab,

28、蛋白質的結晶,HighFlux HomeLab,蛋白質的結晶,Compact HomeLab,蛋白質的結晶,衍射圖片,電子密度,三維結構,H K L F Phi?,phi,相角求解,實空間,倒易空間,X射線衍射實驗和結構計算過程Fourier變換與Fourier反變換,公式二 根據電子密度計算結構因子,公式一 根據結構因子計算電子密度,公式三 根據原子坐標計算結構因子,結構解析的數學原理,常用的蛋白質晶體學軟件分類介紹,相位確定中的軟件應用,結構可視化的軟件應用,結構描述中的軟件應用,Agenda,數據處理中的軟件應用,總結,常用的蛋白質晶體學軟件分類介紹,Phasing and refine

29、ment,Visualization,Structure Description,Data Processing,Automar, DPS, HKL, Mosflm, novel_R, Strategy, XDS, d*TREK,AMoRe, ARP/wARP, CCP4, cctbx, CNS, CONVROT, EPMR, FFFEAR, MADSYS, MAID, MAPUTILS, MOLREP, OASIS2004, SHELX, SnB, SOLVE/RESOLVE, USF, X-plor,O, COOT, QUANTA, XtalView,Conscript, DINO, GR

30、ASP, LIGPLOT, MOLMOL, Molscript/Bobscript, MSMS, PROMOTIF, PyMOL, Provay, RASMOL, Raster3d, Ribbons, Setor, SPOCK, TkRaster3d, TOPS, VMD,數據處理中的軟件應用, 晶 體 學 計 算 中 的 “ 第 一 步 ”,數 據 處 理 的 基 本 步 驟,數 據 處 理 的 常 用 軟 件,目前實驗室現在比較常用的處理軟件：HKL2000/HKL HKL2000/HKL ： 是目前使用最為廣泛的一種數據處理軟件包； 在PDB庫中有超過80的結構的數據是用HKL2000/

31、HKL處理的； 操作界面清晰，使用方便； 在處理大部分數據的時，Index和Integration較其他軟件更有優(yōu)勢。,HKL2000使用范例,數 據 處 理 小 結,對數據的評價標準： 1. Rmerge : 越低數據質量越好，最高殼層的Rmerge最好在50%以下； 2. 完整度(Completeness) : 越大表明數據的完整性越好，最好各殼層的完整度都控制在90%以上（有冰環(huán)的情況除外）； 3. 冗余度(Redundancy) : 越大則對密度圖的細節(jié)貢獻越明顯，因此數據收集衍射圖的張數越多越好； 4. 信躁比 (I/sigma(I) : 表明了衍射點的信號強度，越大數據質量越好，最

32、高殼層不應低于23； 5. 對于MAD數據，還要觀察Scale Factor隨時間得變化，以確認波長是否發(fā)生變化； 對空間群的判斷： 由于某些空間群的系統(tǒng)消光完全相同，或者兩個不同空間群處理出晶胞參數的某個值相差很小，都會造成判斷上的失誤，因此應注意及時調整空間群。,相位確定中的軟件應用,確定相位的常用基本方法,Phasing,MAD/SAD,MIR/SIR,MR,1. 分子置換法,2.重原子法,3. 直接法,多(單)對同晶置換法（MIR/SIR),多(單)波長反常散射法 (MAD/SAD),MAD/SAD方法中的軟件應用,MAD/SAD方法的軟件包,Heavy atom search Hea

33、vy atom position refinement Phasing Phase improvement: Density modification NCS averaging Phase extend,SHELX SOLVE/RESOLVE CNS/X-plor SnB OASIS2004 CCP4(Mlphare ) ,MAD/SAD主要流程,MAD/SAD 常 用 的 方 法 及 軟 件,SHELX (Heavy atom search),SOLVE (Heavy atom position refinement),SOLVE (Phasing),RESOLVE (DM, NCS av

34、eraging, High resolution native ),CNS (DM, NCS averaging, High resolution native ),HKL2MAP, SHELXC/D, SOLVE/RESOVE, CNS,Electron Density Map/ Model building,示 例,MAD/SAD 小 結,幾乎每種軟件都包含了從Heavy atom search到Phase improvement的所有程序；但是各有側重。 對MIR/SIR的數據處理方法與MAD/SAD方法類似。 對于一般的數據，可以首先選用SOLVE/RESOLVE進行初步計算。 經驗總

35、結： 1. SHELX長于Heavy atom search； 2. SOLVE/RESOLVE簡單、集成功能較多，方便使用，但DM的效果不是很好； 3. CNS長于Phase improvement，其density modification, averaging的效果明顯優(yōu)于其他軟件； 綜合使用，取得最佳結果。,MR 方法中的軟件應用,MR方法的軟件包,Cross_rotation search Translation search,CNS/X-plor Molrep Amore Epmr Phaser ,MR主要流程,MR 常 用 的 方 法 及 軟 件,常用的軟件包 ： CNS和Amo

36、re Amore的特點是界面操作，可建立模型庫，計算速度較快，使用方便； CNS的特點是結果較為準確，可調整的參數多，但是速度較慢。,CNS 示 例,數據準備 需要準備的文件包括： 數據文件 ：data.sca 模型的坐標文件 ：model.pdb 數據轉換 將數據轉換成為CNS可用的格式： a. %to_cns data.sca data.hkl 將數據文件轉化成為cns可用的hkl數據文件； b. %cns_solve generate_easy.inp 將模型坐標文件轉換為cns可用的mtf和pdb文件。,CNS 示 例,3. 計算交叉旋轉函數 修改輸入文件 cross_rotation

37、.inp : = molecular structure = * structure file * = structure_infile=model_cns.mtf; * coordinate file * = coordinate_infile=model_cns.pdb; = crystallographic data = * space group * * use International Table conventions with subscripts substituted by parenthesis * = sg=I422; * unit cell parameters in

38、 Angstroms and degrees * + table: rows=1 cell cols=6 a b c alpha beta gamma + = a=182.151; = b=182.151; = c=156.690; = alpha=90; = beta=90; = gamma=90; * reflection file * = reflection_infile=“data.hkl; = output files = = rf_list_outfile=cross_rotation.list;,% cns_solve cross_rotation.inp,CNS 示 例,4.

39、 檢查交叉旋轉函數的結果 ! index, theta1, theta2, theta3, RF-function (EPSIlon= .25) 1 346.447 76.154 326.139 .0684 3 346.137 76.154 280.830 .0628 7 285.790 71.862 253.498 .0383 8 282.100 69.231 273.189 .0369 9 343.569 74.838 345.761 .0361 10 344.661 73.523 298.346 .0359 12 343.124 91.316 279.068 .0347 13 167.3

40、19 95.262 94.874 .0338 14 285.696 71.862 207.237 .0335 15 281.550 69.231 228.806 .0331 18 160.300 74.838 81.550 .0326 19 108.554 74.838 101.689 .0321 20 300.003 76.154 261.868 .0319,選取與其他解差距最大的解,CNS 示 例,5. 計算平移函數 修改輸入文件 translation.inp : = molecular structure = * structure file * = structure_infile=

41、model_cns.mtf; * coordinate file * = coordinate_infile=model_cns.pdb; = crystallographic data = * space group * * use International Table conventions with subscripts substituted by parenthesis * = sg=I422; * unit cell parameters in Angstroms and degrees * + table: rows=1 cell cols=6 a b c alpha beta

42、 gamma + = a=182.151; = b=182.151; = c=156.690; = alpha=90; = beta=90; = gamma=90; * reflection file * = reflection_infile=“data.hkl; * rotation function list file * = rf_list_infile=cross_rotation.list; = output files = = output_root=translation;,% cns_solve translation.inp,CNS 示 例,6. 檢查平移函數的結果 theta1 theta2 theta3 transX transY transZ monitor packing R# 1 287.27 .01 72.73 .00 .00 -.01 .619 .3942 R# 2 141.32 .15 353.68 53.81 .06 -.06 .610 .3945 R# 3 262.18 1.94 341.76 74.61 81.54 10.62 .136 .2881 R# 4 29.24 .68 80.23 -17.12 63.25 14.13 .147 .2670 R#