1、第十七章 色譜分析法概論 chromatography,色譜法是最重要的分離技術(shù)，篇幅約占書(shū)的三分之一,色譜法概述 色譜過(guò)程和術(shù)語(yǔ) 色譜法基本理論 基本類型色譜的分離機(jī)制,第一節(jié) 色譜法概述,一、色譜法（chromatograph）的起源和發(fā)展 11906年由俄國(guó)植物學(xué)家Tsweet創(chuàng)立 植物色素分離見(jiàn)圖示 2、1931年胡蘿卜素異構(gòu)體的分離 3、3040年代TLC、PC平板色譜法的出現(xiàn) 4、40年代瑞典科學(xué)家Tiselius等在分配液相色譜、 吸附色譜和電泳領(lǐng)域取得了成果 5、50年代英國(guó)Martin和Synge建立GC色譜 6、60年代GC-MS聯(lián)用 7、70年代HPLC崛起,圖示,固定相

2、CaCO3顆粒 流動(dòng)相石油醚,植物色素混合物,2現(xiàn)在：一種重要的分離、分析技術(shù) 分離混合物各組分并加以分析 固定相除了固體，還可以是液體 流動(dòng)相液體或氣體 色譜柱各種材質(zhì)和尺寸 被分離組分不再僅局限于有色物質(zhì),色譜學(xué)的重要作用,應(yīng)用的科學(xué)領(lǐng)域：生命科學(xué)、材料科學(xué)、環(huán)境科學(xué)等 藥學(xué)： 1、教材內(nèi)容多，約占全書(shū)的三分之一。 2、藥學(xué)各個(gè)專業(yè)都會(huì)用到色譜分析法 藥典 2005年版 2000年版 部 藥品 1967種 1699種 HPLC分析 848種 567種 3、考研 大綜合包括分析、有機(jī)、生理、生化 其中分析75分約近一半是色譜內(nèi)容,二、色譜法定義、分離基礎(chǔ)和目的,定義：利用各組分物理化學(xué)性質(zhì)的

3、不同，在流動(dòng)相流 經(jīng)固定相時(shí)，由于各組分在兩相間的吸附、分 配或其它親和力的差異而產(chǎn)生不同速度的移 動(dòng)，最終達(dá)到分離的目的。圖例 分離基礎(chǔ)：差速遷移 (例:賽跑) 目的：多組分分離，實(shí)現(xiàn)定性定量分析,圖示,分離機(jī)制： 各組分與流動(dòng)相分子爭(zhēng)奪吸附劑表面活性中心 利用吸附劑對(duì)不同組分的吸附能力差異而實(shí)現(xiàn)分離,吸附解吸再吸附再解吸無(wú)數(shù)次洗脫分開(kāi),碳酸鈣 吸附劑,石油醚 流動(dòng)相,色素,氣相色譜：流動(dòng)相為氣體（稱為載氣） GC 按固定相不同分為：氣固色譜 (GSC) 氣液色譜 (GLC),三、色譜法分類： 1按兩相分子的聚集狀態(tài)分：,液相色譜：流動(dòng)相為液體（也稱為淋洗液） LC 按固定相的不同分為：液固

4、色譜 (LSC) 液液色譜 (LLC)。,2按固定相的固定方式分：,續(xù)前,3按分離機(jī)制分：,分配色譜：利用分配系數(shù)的不同（固定相液體） （ partition chromatography） 吸附色譜：利用物理吸附性能的差異（固定相固體） （ absorption chromatography） 離子交換色譜：利用離子交換原理（固定相離子交換樹(shù)脂） （ion exchange chromatography ） 空間排阻色譜：利用排阻作用力的不同（固定相凝膠） （size exclusion chromatography）,色譜法簡(jiǎn)單分類,四、色譜法的特點(diǎn),優(yōu)點(diǎn)：“三高”、“一快”、“一廣”,缺

5、點(diǎn)：,第二節(jié) 色譜過(guò)程與術(shù)語(yǔ),一、色譜過(guò)程 二、基本術(shù)語(yǔ),1、流出曲線和色譜峰 2、基線、噪音和漂移 3、峰寬柱效參數(shù) 4、峰高和峰面積定量參數(shù) 5、保留值定性參數(shù) 6、分配系數(shù)和容量因子相平衡參數(shù) 7、等溫線 8、分離因子和分離度分離參數(shù),一、色譜過(guò)程,色譜過(guò)程：指物質(zhì)分子（被分離組分）在相對(duì)運(yùn)動(dòng)的 兩相（流動(dòng)相和固定相）中的“分配”平衡過(guò)程,以吸附色譜為例見(jiàn)圖示 色譜過(guò)程： 吸附 解吸再吸附 再解吸 反復(fù)多次洗脫被測(cè)組分分配系數(shù)不同 差速遷移 分離,圖示,吸附能力弱的組分先流出 吸附能力強(qiáng)的組分后流出,組分的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)微小差異 與固定相作用差異 隨流動(dòng)相移動(dòng)的速度不等 差速遷移 色譜分離。

6、,二、基本術(shù)語(yǔ),1流出曲線和色譜峰,流出曲線（色譜圖 chromagtogram）：電信號(hào)強(qiáng) 度隨時(shí)間變化曲線 色譜峰(peak)：流出曲線上突起部分,2基線、噪音和漂移 base line, noise and drift,基線：僅有流動(dòng)相通過(guò)檢測(cè)器時(shí)產(chǎn)生 的信號(hào)曲線。反映檢測(cè)器噪音 隨時(shí)間變化的曲線 （穩(wěn)定平直直線） 噪音：儀器本身所固有的，以噪音 帶表示（儀器越好，噪音越?。?漂移：基線向某個(gè)方向穩(wěn)定移動(dòng) （儀器未穩(wěn)定造成）,3峰寬 peak width：色譜柱效參數(shù),峰寬W：色譜峰兩側(cè)拐點(diǎn)切線與基線相交的截距,標(biāo)準(zhǔn)差： 為正態(tài)分布曲線兩拐點(diǎn)間距離的一半。 對(duì)應(yīng)0.607h處峰寬的一半

7、注：小，峰窄，柱效高 半峰寬W1/2：峰高一半處所對(duì)應(yīng)的峰寬,注：除了用于衡量柱效，還可以計(jì)算峰面積,圖示,峰高(peak height；h)：組分在柱后出現(xiàn)濃度極大時(shí)的檢測(cè)信號(hào)，即色譜峰頂至基線的距離。 峰面積(peak area；A)：色譜曲線與基線間包圍的面積。,4峰高和峰面積：色譜定量參數(shù),5保留值：色譜定性參數(shù),保留時(shí)間 retention time, tR：從進(jìn)樣開(kāi)始到組分出現(xiàn)濃度極大點(diǎn)時(shí)所需時(shí)間，即組分通過(guò)色譜柱所需要的時(shí)間 死時(shí)間dead time, t0：不被固定相滯留組分的保留時(shí)間，相當(dāng)于流動(dòng)相到達(dá)檢測(cè)器所需要的時(shí)間,調(diào)整保留時(shí)間tR：組分由于和固定相作用，比不作用的組分在

8、柱種多停留的時(shí)間，即組分在固定相中滯留的時(shí)間。等于組分的保留時(shí)間與死時(shí)間之差值,表示組分在色譜固定相內(nèi)滯留狀態(tài)的參數(shù),（1）時(shí)間表示的保留值,圖示,續(xù)前,保留體積VR：從進(jìn)樣開(kāi)始到組分出現(xiàn)濃度極大點(diǎn)時(shí)所需要的 流動(dòng)相的體積。 VR與tR和Fc（流動(dòng)相流速mL/min）的關(guān)系,死體積V0：由進(jìn)樣器至檢測(cè)器的流路中未被固定相占有的空間 體積。包括從進(jìn)樣器到色譜柱導(dǎo)管的體積、固定相的孔隙及顆 粒間隙、 柱出口導(dǎo)管及檢測(cè)器內(nèi)腔體積的總和。,（2）用體積表示的保留值,續(xù)前,調(diào)整保留體積VR：保留體積與死體積之差，即組分 停留在固定相時(shí)所消耗流動(dòng)相的體積,V0 和 Vm、t0 和 tm 的區(qū)別,V0 ：由

9、進(jìn)樣器至檢測(cè)器的流路中未被固定相占有的空 間體積 ； 流定相充滿死體積所需的時(shí)間為t0 。 Vm ：平衡時(shí)流動(dòng)相在色譜柱中占有的體積，流動(dòng)相經(jīng) 過(guò)色譜柱所需時(shí)間用tm 表示。 Vm V0，tm t0 的物理意義有區(qū)別。 在多數(shù)情況下，可忽略導(dǎo)管和檢測(cè)器內(nèi)腔的容積， Vm 和 V0視為近似相等。,圖例,下一張,返回,6分配系數(shù)和容量因子：相平衡參數(shù),分配系數(shù)K（partition coefficient , 平衡常數(shù)）：指在一定溫度和壓力下，組分在色譜柱中達(dá)分配平衡后，在固定相與流動(dòng)相中的濃度比,注：K為熱力學(xué)常數(shù) 與組分性質(zhì)、固定相性質(zhì)、流動(dòng)相性質(zhì)及溫度有關(guān) 實(shí)驗(yàn)條件固定，K僅與組分性質(zhì)有關(guān)

10、不同分離機(jī)理的色譜中，K名稱雖有所不同，但物理意義都 一樣，表示平衡狀態(tài)下兩相中濃度之比,tR與K的關(guān)系：,續(xù)前,討論： 色譜條件一定時(shí)，tR主要取決K的大小 （色譜法基本的定性參數(shù) ）,分配系數(shù)K不容易獲得，不常用,續(xù)前,容量因子（capacity factor, 容量比，分配比）k： 在平衡狀態(tài)下，組分在固定相與流動(dòng)相中的質(zhì)量比,結(jié)論：色譜分離前提各組分分配系數(shù)不等,注：應(yīng)選擇合適分離條件使得難分離的組分K不等,2）色譜條件（s，m，T）一定時(shí)，K一定 tR一定,7、等溫線：(P442),定義：指一定溫度下，組分在兩相中分配達(dá)平衡時(shí)，在兩相 中的濃度關(guān)系曲線，即cs對(duì)cm的關(guān)系曲線 圖示,

11、(1) 線性等溫線（理想）對(duì)稱峰 (2)非線性等溫線 凸形拖尾峰（常見(jiàn)） 凹形前沿峰,固定相表面活性吸附中心未達(dá)飽和，K一定，與溶質(zhì)濃度無(wú)關(guān),固定相表面吸附中心活性不均，溶質(zhì)分子先占據(jù)強(qiáng)吸附中心再 占據(jù)弱吸附中心，K隨著溶質(zhì)濃度的增加而減小,溶質(zhì)與固定相作用，改變其表面性質(zhì)，K隨著溶質(zhì)濃度的增加 而增加,斜率=K,線性：對(duì)稱峰,凹形：前沿峰,凸形：拖尾峰,對(duì)稱因子：（拖尾因子）,fs在0.951.05之間,fs小于0.95,fs大于1.05,對(duì)稱因子(symmetry factor) 衡量色譜峰對(duì)稱性,8.分離因子和分離度：分離參數(shù) 描述相鄰組分分離狀態(tài)的指標(biāo),（1）分離因子（分配系數(shù)比或選擇

12、性系數(shù)） 定義：兩種物質(zhì)調(diào)整保留值之比,分離因子1是色譜分離的必需條件,（2）分離度（resolution, R）： 衡量色譜分離條件優(yōu)劣的參數(shù) 定義：相臨兩組分間峰頂間距離是峰底寬平均值的幾倍,討論,設(shè)色譜峰為正常峰，W1W2= 4,第二節(jié) 色譜過(guò)程與術(shù)語(yǔ),一、色譜過(guò)程 二、基本術(shù)語(yǔ),1、流出曲線和色譜峰 2、基線、噪音和漂移 3、峰寬柱效參數(shù) 4、峰高和峰面積定量參數(shù) 5、保留值定性參數(shù) 6、分配系數(shù)和容量因子相平衡參數(shù) 7、等溫線 8、分離因子和分離度分離參數(shù),第三節(jié) 色譜法基本理論,要使R大，必須： 1、tR大- k大-熱力學(xué) 2、W小-峰展寬小-動(dòng)力學(xué),分離度：,色譜理論包括兩方面:

13、 熱力學(xué)理論：研究分配(分離)過(guò)程，塔板理論（plate theory）。 動(dòng)力學(xué)理論：研究各種動(dòng)力學(xué)因素對(duì)峰展寬的影響，速率理論（rate theory）。,一、塔板理論 plate theory,始于馬?。∕artin）和辛格（Synge）提出的塔板模型。 分餾塔：在塔板上多次氣液平衡，按沸點(diǎn)不同而分離。,色譜柱每個(gè)H高度內(nèi)有一塊塔板，共有若干塊塔板。組分在每塊塔板兩相間分配達(dá)平衡，K小的先出柱。多次分配平衡，K有微小差異組分仍可獲較好分離,假想：,（一）塔板理論的四個(gè)基本假設(shè),1柱的組成為多個(gè)連續(xù)、等距塔板，每塔板內(nèi)組分分配瞬間達(dá) 平衡（H理論塔板高度） 2流動(dòng)相間歇式進(jìn)入色譜柱，每次進(jìn)

14、一個(gè)塔板體積 3樣品和載氣均加在第1號(hào)塔板上，沿柱方向縱向擴(kuò)散忽略 4分配系數(shù)在各塔板上是常數(shù),結(jié)果：當(dāng)塔板數(shù)很大時(shí)，組分色譜流出曲線為趨 于正態(tài)分布,（二）理論板數(shù)和理論塔板高度的計(jì)算,L ：柱長(zhǎng),色譜柱效參數(shù),續(xù)前,有效理論板數(shù)和有效理論塔板高度的計(jì)算,塔板理論的貢獻(xiàn)：從熱力學(xué)角度,解釋了色譜流出曲線的形狀和濃度極大點(diǎn)的位置 提出了評(píng)價(jià)柱效高低的n和H的計(jì)算式,須在給定條件，指定組分測(cè)定時(shí)才有意義 缺點(diǎn)：,1.柱效不能表示被分離組分的實(shí)際分離效果。 2.塔板理論無(wú)法解釋同一色譜柱在不同流動(dòng)相流速下柱效不同的 結(jié)果，無(wú)法指出影響柱效的因素及提高柱效的途徑。,練習(xí),例： GC法，柱長(zhǎng)為2m，固

15、定相5%的OV-17、柱溫為1250C，記錄紙速度為2.0cm/min的色譜條件下，測(cè)定萘的保留時(shí)間為2.35min，半峰寬為0.20cm，求理論塔板數(shù)和板高。若用甲烷測(cè)得死時(shí)間為0.20min，求有效理論塔板數(shù)和板高。（見(jiàn)書(shū)上P444例）,解：,二、速率理論 rate theory,塔板理論成功處： 解釋了色譜流出曲線的形狀和濃度極大值對(duì)應(yīng)的tR 評(píng)價(jià)柱效（n，）,塔板理論存在問(wèn)題: 1）做出了四個(gè)與實(shí)際不相符的假設(shè) 忽略了組分在兩相中傳質(zhì)和擴(kuò)散的動(dòng)力學(xué)過(guò)程 2）只定性給出塔板高度的概念，卻無(wú)法解釋板高的 影響因素 3）排除了一個(gè)重要參數(shù)流動(dòng)相的線速度u， 因而無(wú)法解釋柱效與流速關(guān)系 更無(wú)法

16、提出降低板高的途徑,速率理論影響柱效因素,1956年，荷蘭學(xué)者范第姆特(Van Deemter)提出了色譜過(guò)程動(dòng)力學(xué)理論速率理論。,塔板高度,渦流擴(kuò)散項(xiàng),縱向擴(kuò)散項(xiàng),傳質(zhì)阻抗項(xiàng),H = A + B/u + Cu,吸收了塔板理論的有效成果H， 并從動(dòng)力學(xué)角度較好地解釋了影響柱效的因素,u載氣線速度，cm/s,流速與柱效的關(guān)系,H = A + B/u + Cu,1. 渦流擴(kuò)散項(xiàng)（多徑擴(kuò)散項(xiàng)）：A,產(chǎn)生原因：載氣攜樣品進(jìn)柱，遇到來(lái)自固定相顆粒 的阻力路徑不同渦流擴(kuò)散 next,注：顆粒太小，柱壓過(guò)高且不易填充均勻 空心毛細(xì)管柱（0.10.5mm），A=0，n理較高,：填充不規(guī)則因子，填充技術(shù)和填料顆

17、粒形狀決定。 dp：填料 (固定相) 顆粒的平均直徑， dp小，A?。坏玠p太小，和柱阻大。,圖示,back,柱填充不均勻,2. 縱向擴(kuò)散項(xiàng)（分子擴(kuò)散項(xiàng)）：B/u,產(chǎn)生原因： 峰在固定相中被流動(dòng)相推動(dòng)向前、展開(kāi) 兩邊濃度差,續(xù)前,注：為降低縱向擴(kuò)散，宜控制較高線速度，選用分子 量較大的載氣和較低的柱溫,選擇載氣原則：兼顧分析時(shí)間和減小縱向擴(kuò)散 u 較小時(shí)，選M較大的N2氣（粘度大） u 較大時(shí)，選M較小的H2氣，He氣（粘度?。?B的影響因素：,B/u的影響：,3. 傳質(zhì)阻抗項(xiàng)：Cu,產(chǎn)生原因：樣品在氣液兩相分配，樣品未及溶解就 被帶走，從而造成峰擴(kuò)張,影響因素：,傳質(zhì)：溶解、擴(kuò)散、轉(zhuǎn)移的過(guò)程

18、。 傳質(zhì)阻抗：影響傳質(zhì)過(guò)程的阻力。,續(xù)前,討論：,注：固定液應(yīng)完全覆蓋載體表面，不可以太薄， 否則柱子壽命短，k太小； T不可以超過(guò)固定液最佳使用溫度,小結(jié)：范氏方程說(shuō)明了在色譜分離條件的選擇中，填充 均勻程度、填充物的粒度、流動(dòng)相的種類及流速、 固定相的液膜厚度等對(duì)柱效和峰展寬的影響,三 影響分離度的因素,1分離度定義式 2分離度計(jì)算式,前提定義式基礎(chǔ)上，相鄰兩組分的n一致（假設(shè)）,柱效項(xiàng),柱選擇項(xiàng),柱容量項(xiàng),a柱效項(xiàng)及其影響因素：,影響色譜峰的寬窄 主要取決于色譜柱性能及載氣流速,注：柱長(zhǎng)過(guò)長(zhǎng)，柱阻增大,練習(xí),例：兩組分在1 m長(zhǎng)柱子上的分離度為0.75，問(wèn)使用 多長(zhǎng)柱子可以使它們完全分離

19、？,解：,續(xù)前,討論：,增加柱效是提高分離度的一個(gè)直接有效手段 提高柱效、改善分離的途徑：增加柱長(zhǎng)；降低板高 根據(jù)速率理論，降低板高、提高柱效的方法是： 1）采用粒度較小、均勻填充的固定相（A項(xiàng) ） 2）分配色譜應(yīng)控制固定液液膜厚度（C項(xiàng) ） 3）適宜的操作條件： 流動(dòng)相的性質(zhì)和流速，柱溫等等（B項(xiàng) ） 選用分子量較大、線速度較小的載氣N2氣， 控制較低的柱溫,b柱選擇項(xiàng)及其影響因素：,影響峰的間距 主要受固定相性質(zhì)，以及柱溫影響,c柱容量項(xiàng)及其影響因素：,影響峰位 主要受固定相用量、柱溫和載氣流速的影響,圖示,k 影響峰位,n 影響峰寬窄,影響兩峰間距,練習(xí),如何根據(jù)具體情況改進(jìn)分離度？,太

20、小，兩組分未分開(kāi) 應(yīng)改變固定相極性，降低柱溫,k 太小，n 也太小， 應(yīng)增大固定液用量，降低柱溫,n 太小，許多組分未分開(kāi) 應(yīng)設(shè)法降低板高，提高柱效,第四節(jié) 基本類型色譜法的分離機(jī)制,（一）吸附色譜法 （二）分配色譜法 （三）離子交換色譜法 （四）空間排阻色譜法,對(duì)于不同的分離機(jī)理，K的含義不同。 吸附色譜 吸附系數(shù) 分配色譜 分配系數(shù) 離子交換色譜 離子交換系數(shù) 統(tǒng)稱K 分子排阻色譜 分子排阻系數(shù),（一）吸附色譜法,要求： 固定相吸附劑（硅膠或AL2O3） 具表面活性吸附中心 分離機(jī)制：見(jiàn)圖示,吸附系數(shù),注：Ka與組分的性質(zhì)、吸附劑的活性、流動(dòng)相的性質(zhì) 及溫度有關(guān) next,吸附平衡 Xm + nYaXa + nYm,圖示,分離機(jī)制： 各組分與流動(dòng)相分子爭(zhēng)奪吸附劑表面活性中心 利用吸附劑對(duì)不同組分的吸附能力差異而實(shí)現(xiàn)分離,吸附解吸再吸附再解吸無(wú)數(shù)次洗脫分開(kāi) back,（二）分配色譜法,要求： 固定相機(jī)械吸附在惰性載體上的液體 流動(dòng)相必須與固定相不為互