1、1、測定原理、測定方法、注意事項。,1、蛋白質(zhì)的性質(zhì)和測定意義； 2、凱氏定氮法測定蛋白質(zhì)的原理和方法摘要； 3、熟悉凱氏定氮儀的工作原理和使用方法。,2.重點,1、凱氏定氮法中蛋白質(zhì)原理和關(guān)鍵環(huán)節(jié)。,3.難點,3.,1.基本知識點,實驗二 食品中總氮的測定,學習目標,實驗二 食品中總氮測定凱氏定氮法,一、概述 凱氏（Kjeldah）定氮法是目前普遍采用的測定有機N總量較為準確、方便的方法之一，適用于所有食品，所以國內(nèi)外應(yīng)用較為廣泛。是經(jīng)典的分析方法之一，也是GB/T 5009.5-2003食品中蛋白質(zhì)的測定第一法，由于該法是丹麥人道爾（J.Kjeldah）于1883年提出用于測定研究蛋白質(zhì)而

2、得名。 凱氏定氮法是將蛋白質(zhì)消化，測定其總N量，再換算成為蛋白質(zhì)含量。食品中的含N物質(zhì)，除蛋白質(zhì)中的氮以外，還包括氨基酸、酰胺、核酸等中的氮等少量的非蛋白質(zhì)含N物質(zhì)，所以該法測定的蛋白質(zhì)含量應(yīng)稱為粗蛋白質(zhì)。 對于不同的蛋白質(zhì)，它的組成和結(jié)構(gòu)不同，但從分析數(shù)據(jù)可以得到近似的pro的元素組成百分比。 一般來說，pro的平均含氮量為16%，即1份N素相當于6.25份蛋白質(zhì)，所以在用凱氏定氮法定量pro時，將測得的總氮%乘上pro的換稱參數(shù)K=6.25即為該物質(zhì)的pro含量。 蛋白質(zhì)含N量的倒數(shù)稱為蛋白質(zhì)換算系數(shù)。,實驗二 食品中總氮測定凱氏定氮法,一、概述 但是我們必須要知道，食品種類不同，蛋白質(zhì)的

3、組成也不一樣，其N量也不相同，蛋白質(zhì)換算系數(shù)差別很大，我們在測定pro時，應(yīng)該是不同的食品采用不同的換算等數(shù)。如：玉米、蕎麥為6.25， 花生：5.46；大米：5.95；大豆及其制品：5.71；面粉：5.70；乳制品：6.38； 凱氏定氮法（Kjeldahl determination）有常量法、微量法及改良法，其原理基本相同，只是所使用的樣品數(shù)量和儀器不同。而改良的常量法主要是催化劑的種類、硫酸和鹽類添量不同，一般采用硫酸銅、二氧化鈦或硒、汞等物質(zhì)代替硫酸銅。 有些樣品中含有難以分解的含N化合物，如：蛋白質(zhì)中含有色氨酸、賴氨酸、組氨酸、酪氨酸、脯氨酸等，單純以硫酸銅作催化劑，18小時或更長時

4、間也難經(jīng)分解，單獨用汞化合物， 在短時間內(nèi)即可，但它有毒性。 下面主要介紹微量凱氏定氮法。,實驗二 食品中總氮測定凱氏定氮法,二、原理 蛋白質(zhì)是含氮的有機化合物。食品與硫酸和硫酸銅、硫酸鉀一同加熱消化，使蛋白質(zhì)分解，分解的氨與硫酸結(jié)合生成硫酸銨。然后堿化蒸餾使氨游離，用硼酸吸收后以硫酸或鹽酸標準滴定溶液滴定，根據(jù)酸的消耗量乘以換算系數(shù)，即為蛋白質(zhì)的含量。 凱氏定氮法（化學）反機理如下： 1、2CH3CHCOOH+13H2SO4=（NH4）2SO4+6CO2+12SO2+16H2O NH2 2、（NH4）2SO4+2NaOH=2NH3+Na2SO4+2H2O 3、2NH3+2H3BO3=(NH4

5、)2B4O7+5H2O 4、(NH4)2B4O7+HCL+5H2O=2NH4CL+4H3BO3 反應(yīng)（1）、(2)在凱氏瓶內(nèi)完成，反應(yīng)（3）在凱氏蒸餾裝置中進行。 為了加速消化，可以加入CuSO4作催化劑，K2SO4以提高溶液的沸點。收集氨可用硼酸溶液，滴定則用強酸。,實驗二 食品中總氮測定凱氏定氮法,三、方法摘要 Kjeldahl determination測定蛋白質(zhì)含量主要分三個步驟： （一）消化 樣品中的有機物和含N有機化合物，經(jīng)濃H2SO4加熱消化，H2SO4使有機物脫水，炭化為碳；碳將H2SO4還原為SO2，而本身則變?yōu)镃O2；SO2使N還原為NH3，而本身則氧化為SO3，而消化過程

6、中所生成的新生態(tài)氫，又加速了氨的形成。在反應(yīng)中生成物CO2、H2O和SO2、SO3逸去，而NH3與H2SO4結(jié)合生成（NH4）2SO4留在消化液中。 蛋白質(zhì)+ H2SO4 C C+ H2SO4SO2+CO2 SO2+N NH3+SO3 NH3+ H2SO4（NH4）2SO4 2CH3CHCOOH+13H2SO4 =（NH4）2SO4+6CO2+12SO2+16H2O NH2,脫水,實驗二 食品中總氮測定凱氏定氮法,三、方法摘要 （二）堿化、蒸餾 （NH4）2SO4在堿性條件下，加熱蒸餾，釋放出氨。 （NH4）2SO4+2NaOH=2NH3+Na2SO4+2H2O （三）吸收、滴定 蒸餾過程中所

7、放出的NH3，可用一定量的標準硼酸溶液吸收，再用標準鹽酸溶液直接滴定。 2NH3+2H3BO3=(NH4)2B4O7+5H2O (NH4)2B4O7+HCL+5H2O=2NH4CL+4H3BO3 硼酸溶液僅呈極微弱的酸性，在此反應(yīng)中并不影響所加的指示劑的變色反應(yīng)，但具有吸收氨的作用，所以采用之作吸收劑。,實驗二 食品中總氮測定凱氏定氮法,四、儀器 1、凱氏燒瓶500mL或250mL 2、龍科A凱氏定氮儀 3、扭力天平 4、分析天平 5、5mL移液管 6、溫度可以控制的電爐 7、小漏斗 8、滴定管 9、250mL錐形瓶 10、玻璃珠,實驗二 食品中總氮測定凱氏定氮法,四、儀器,實驗二 食品中總氮

8、測定凱氏定氮法,四、儀器,實驗二 食品中總氮測定凱氏定氮法,五、試劑 1、硫酸銅 (CuSO45H2O)。 2、硫酸鉀。 3、濃硫酸 (密度為1.8419g/L)。 4、硼酸溶液 (20g/L)。 5、氫氧化鈉溶液 (350g/L)。 6、鹽酸標準滴定溶液c(HCl)=0.01mol/L 或 硫酸標準滴定溶液c(1/2H2SO4)=0.0500mol/L 。 7、混合指示液：1份甲基紅乙醇溶液 (1g/L) 與5份溴甲酚綠乙醇溶液(1g/L) 臨用時混合。 (也可用2份甲基紅乙醇溶液(1g/L)與1份次甲基藍乙醇溶液(1g/L)臨用時混合)。,實驗二 食品中總氮測定凱氏定氮法,六、分析步驟 （

9、一）試樣處理 1、稱樣 (約相當?shù)?0mg40mg) （1）固體試樣：稱取0.10g1.00g （2）半固體試樣：稱取1.00g5.00g （3）液體試樣：吸取10.00mL25.00mL 2、消化準備 將試樣移入洗凈、烘干、容積為100mL或500mL的凱氏燒瓶內(nèi) ，加入硫酸銅、硫酸鉀及8-10mL硫酸，加入2粒3粒玻璃珠，稍搖勻后于瓶口放一小漏斗，將瓶以45角斜支于有小孔的石棉網(wǎng)上。,實驗二 食品中總氮測定凱氏定氮法,六、分析步驟 （一）試樣處理 3、消化 將準備好的凱氏燒瓶以45斜放于溫控電爐上（先墊上石棉網(wǎng)），開始用微火小心加熱，（小心瓶內(nèi)泡沫沖出而影響結(jié)果?。?，待內(nèi)容物全部炭化,泡沫

10、完全停止，瓶內(nèi)有白煙冒出后，升至中溫，白煙散盡后升至高溫，加強火力,并保持瓶內(nèi)液體微沸,（為加快消化速度,可分數(shù)次加入10mL30%過氧化氫溶液，但必須將燒瓶冷卻數(shù)分鐘以后加入?。?經(jīng)常轉(zhuǎn)動燒瓶，觀察瓶內(nèi)溶液顏色的變化情況，當燒瓶內(nèi)容物的顏色逐漸轉(zhuǎn)化成藍綠色澄清透明后，再繼續(xù)加熱0.5h1h。然后取下并使之冷卻。,（若凱氏燒瓶壁粘有碳化粒時，進行搖動或待瓶中內(nèi)容物冷卻數(shù)分鐘后，用過氧化氫溶液沖下，繼續(xù)消化至透明為止）。 4、定容 將消化好并冷卻至室溫的樣品消化液加入20mL蒸餾水搖勻放冷，小心轉(zhuǎn)移到100mL容量瓶中，再用蒸餾水少量多次洗滌凱氏燒瓶，并將洗液一并轉(zhuǎn)入容量瓶中，直至燒瓶洗至中性，

11、表明銨鹽無損地移入容量瓶中，充分搖勻后，靜置至室溫，加水至刻度線定容，混勻備用。 同樣條件下做一試劑空白試驗。,實驗二 食品中總氮測定凱氏定氮法,六、分析步驟 （一）試樣處理,實驗二 食品中總氮測定凱氏定氮法,六、分析步驟,（二）蒸餾 1、水蒸汽發(fā)生器的準備：按要求安裝好定氮裝置，保證管路密閉不漏氣。于水蒸氣發(fā)生瓶內(nèi)裝水至2/3處，加甲基紅指示劑3滴及3mL5mL硫酸，以保持水呈酸性（防止水中含有N，加硫酸使成為（NH4）2SO4形式固定下來，蒸餾中不會被蒸發(fā)），開通電源加熱煮沸水蒸氣發(fā)生瓶內(nèi)的水。 2、清洗凱氏定氮儀：打開進氣口，關(guān)閉廢液出口，接通冷凝水，空蒸5 min10min，沖冼定N儀

12、、樣杯、堿杯和內(nèi)室。分別關(guān)閉進氣口（注意不要同時關(guān)閉所有進氣口?。?，使廢液自動倒吸于定氮儀外室，再由樣杯加入少量水，沖冼再次，當廢液全部吸入外室后，再放排液口，并使其敞開。 3、吸收液準備：在250mL錐形瓶中加入10mL(20g/L)硼酸溶液和1滴3滴混合指示劑，放置冷凝器的下端，并使冷凝管下端插入液面下。,實驗二 食品中總氮測定凱氏定氮法,六、分析步驟 ）,（二）蒸餾 4、蒸餾準備：準確吸取10mL試樣處理液，由樣杯（小漏斗）流入定氮儀內(nèi)室（反應(yīng)室），并用10mL水沖洗樣杯（小漏斗）使流入定氮儀內(nèi)室（反應(yīng)室內(nèi)）【但內(nèi)室中溶液總體積不超過內(nèi)室的2/3（約50mL）】，塞緊棒狀玻塞，加水至杯口

13、1cm2cm，以防漏氣，關(guān)閉排液口，迅速由堿杯緩緩加入10mL氫氧化鈉溶液(400g/L)，夾緊螺旋夾，通入蒸汽開始蒸餾。 5、蒸餾：關(guān)閉排液口，蒸汽進入反應(yīng)室（內(nèi)室），NH3通過冷凝管進入接收瓶被硼酸吸收，蒸餾5 min，移開接收瓶，使冷凝管下端離開液面，再蒸餾1min，然后，用少量水沖冼冷凝管下端外部，洗液一并聚集于硼酸溶液中。 6、收尾：關(guān)閉進氣口，停止送氣，廢液將自動倒吸入外室，待倒吸完全時，將樣杯中的蒸餾水分數(shù)次放入，沖冼內(nèi)室，待洗液全部吸入外室后，再打開排液口，放凈廢液。 按上述步驟，換下一試樣蒸餾。同時準確吸取10mL試劑空白消化液按以上操作作空白試驗。,實驗二 食品中總氮測定凱

14、氏定氮法,六、分析步驟 （三）滴定 取下接收瓶，以硫酸或鹽酸標準滴定溶液(0.05mol/L)滴定至灰色或藍紫色為終點。,實驗二 食品中總氮測定凱氏定氮法,六、結(jié)果計算 試樣中蛋白質(zhì)的含量按下式進行計算： 式中：X試樣中蛋白質(zhì)的含量，g/100g或g/100mL； V1試樣消耗硫酸或鹽酸標準滴定液的體積，mL； V2試劑空白消耗硫酸或鹽酸標準滴定液的體積，mL； c硫酸或鹽酸標準滴定溶液的濃度，mol/L； 0.01401.0mL硫酸 c(1/2H2SO4)=1.000mol/L或鹽酸c(HCl)=1.000mol/L標準滴定溶液相當?shù)牡馁|(zhì)量，g； m樣品的質(zhì)量或體積，g或mL； F氮換算為

15、蛋白質(zhì)的系數(shù)。 一般食物為6.25；乳制品為6.38；面粉為5.70；玉米、高粱為6.24；花生為5.46；米為5.95；大豆及其制品為5.71；肉與肉制品為6.25；大麥、小米、燕麥、裸麥為5.83；芝麻、向日葵為5.30。 計算結(jié)果保留三位有效數(shù)字。,實驗二 食品中總氮測定凱氏定氮法,七、說明 1、本法適用于食品中蛋白質(zhì)的測定。不適用于添加無機含氮物質(zhì)、有機非蛋白質(zhì)含氮物質(zhì)的食品測定。 2、所用試劑要用無氨蒸餾水配制。 3、樣品消化應(yīng)在毒櫥內(nèi)進行。消化過程中應(yīng)注意轉(zhuǎn)動凱氏燒瓶，利用冷凝的酸液將附在瓶壁上的炭粒沖下，以促進消化完全。 4、樣品消化時，如泡沫太多，可加少量辛醇或液體石醋去泡，防

16、止樣品溢出。 5、樣品消化液不易澄清透明時，可將凱氏燒瓶冷卻，加入過氧化氫2 mL3mL后再加熱。 6、為了加速氧化分解，常用催化劑是硫酸銅，有時也選用硒粉。硫酸銅也是蒸餾時樣品堿化的指示劑。 7、消化時硫酸與硫酸鉀作用生成硫酸氫鉀，可提高沸點（硫酸沸點為330，添加硫酸鉀后可達400），加快消化速度。 8、蒸餾裝置要嚴防氨逸出。蒸餾過程中不得中途間斷，以免樣品液從反應(yīng)室吸出。 9、操作過程中要嚴防酸、堿污染硼酸吸收液，否則會造成較大的測定誤差。 10、在重復性條件下獲得的兩次獨立測定結(jié)果的絕對差值不得超過算術(shù)平均值的10%。,實驗二 食品中總氮測定凱氏定氮法,八、樣品的分解條件 在消化過程中

17、為了加速分解過程，縮短消化時間，常加入下列物質(zhì)： （一）K2SO4或Na2SO4 1、作用 K2SO4 或Na2SO4是常用的增溫劑，提高消化液沸點。 在消化過程中溫度起著重要的作用，消化溫度一般控制在360410間。 低于360，消化不易完全，特別是雜環(huán)氮化物，不易分解，使結(jié)果偏低，高于410則容易引氮的損失。 H2SO4的沸點僅為330。K2SO4 沸點：400； 在消化過程中，隨著H2SO4的不斷分解，水分不斷蒸發(fā)，K2SO4濃度逐漸升高，則沸點升高，加速對有機物的分解作用。,實驗二 食品中總氮測定凱氏定氮法,八、樣品的分解條件 （一）K2SO4或Na2SO4 2、加入量 溫度高低取決于

18、加入的K2SO4多少，若少（小于0.3g/mLK2SO4）則消化時間長。 H2SO4：K2SO4=1：1時，則可大大縮短消化時間。 消化中若H2SO4消耗過多，則會影響鹽的濃度，一般在凱氏瓶口插一小漏斗，以減少H2SO4的損失。 K2SO4+ H2SO4=2KHSO4 2KHSO4=K2SO4+H2O+SO3 K2SO4 與H2SO4的用量比值不宜過大，當K2SO4超過0.8g/mL時，消化結(jié)束時，內(nèi)容物冷卻快，操作困難。同時溫度過高，還會使生成的(NH4)2SO4分解，放出NH3，使N損失。 (NH4)2SO4NH3+(NH4)HSO4 2(NH4)HSO42NH3+2SO3+H2O 因此K2SO4濃度應(yīng)控制在0.35g/mL0.43g/mL。 Na2SO4 與K2SO4作用相同，但效果不及之。,實驗二 食品中總氮測定凱氏定氮法,八、樣品的分解條件 （二）CU2SO4的作用 1、催化劑 3C+4Cu2SO4+2 H2SO42Cu2SO4+4SO2+3CO2+2H2O Cu2SO4+2H2SO42CuSO4+2H2O+SO2 2、指示劑 在消化完全后，應(yīng)呈清澈透明的蘭綠色或深綠色（鐵多），故它在消化中還起指示作用。同時應(yīng)注意，凱氏瓶剛清澈時并不表示所有的N均已轉(zhuǎn)化為氨，因此消化液仍要加熱一段時間。 3、Cu2SO4還可在堿蒸餾時作為堿