1、制劑分析方法的建立和驗證,王 玉,第一部分 制劑分析方法的建立 第二部分 制劑的雜質(zhì)研究 第三部分 分析方法驗證 第四部分 穩(wěn)定性研究關(guān)注點,第一部分 制劑分析方法的建立,一 性狀項 對性狀的描述很重要，既要嚴謹，又要實事求是、切合實際；即寬嚴適度。 片劑：本品為白色片或類白色片；本品為糖衣片，除去包衣后顯白色或類白色；本品為薄膜衣片，除去包衣后顯類白色至淡黃色,注射劑：本品為無色澄明液體；本品為無色至微黃色的澄明液體；本品為無色至淡黃色的澄明油狀液體。 本品為白色凍干粉末，在水或氯化鈉注射液中呈白色顆粒懸浮液，靜置后顆粒沉降于瓶底；本品為白色凍干塊狀物或粉末。 膠囊劑：本品內(nèi)容物為類白色至微

2、黃色粉末或顆粒；本品內(nèi)容物為淡黃色至淡棕黃色油狀液體；本品內(nèi)容物為白色球形小丸。,第一部分 制劑分析方法的建立,二 鑒別項 藥物的鑒別試驗(identification test)是用于鑒別藥物的真?zhèn)?，一般在藥品檢驗中作為首先項目。鑒別試驗主要用于證實鑒別對象是否為所標示的藥物，但常不用于鑒別未知物。,鑒別的主要項目,1、性狀：也可以列為鑒別項下，主要反映藥物特有的物理性質(zhì)，如外觀、臭、味、溶解度及其物理常數(shù)等。 其中溶解度、熔點等項目受被測物晶型、顆粒大小等因素影響，會使批間有差異。主要是對原料藥的影響，但也會影響制劑的質(zhì)量。在制劑鑒別試驗中雖較少但有時也要考慮。,鑒別的主要項目,2、一般鑒

3、別試驗(general identification test)是以藥物的化學結(jié)構(gòu)及其物理化學性質(zhì)為依據(jù)，通過化學反應(yīng)來鑒別藥物的真?zhèn)?。一般鑒別試驗可能只證實為某一類藥物，而不能證實是哪一種藥物，需進行專屬鑒別試驗，方可確認。,鑒別的主要項目,3、專屬鑒別試驗(specific identification test)是證實某一種藥物的依據(jù)，是根據(jù)藥物間化學結(jié)構(gòu)的差異及其物理化學特性的不同，選用某種藥物特有的靈敏定性反應(yīng)來鑒別藥物的真?zhèn)巍?鑒別的主要項目,IR和Raman是鑒別原輔料的首選方法，用于制劑鑒別有局限性，要考慮輔料干擾，復方制劑API相互間的干擾以及輔料的干擾更為復雜。 IR或Ra

4、man制劑鑒別應(yīng)用實例不多。前處理提純?nèi)コ蓴_是常用的方法；結(jié)合化學計量學、或采用微光譜（化學成像等）是進行制劑鑒別新方法。 其他光譜法如紫外法、理化反應(yīng)（顏色、沉淀）等在制劑鑒別中有一定的應(yīng)用，但專屬性不強，色譜法，特別是HPLC法的應(yīng)用實例越來越多。,第一部分 制劑分析方法的建立,三 檢查項 制劑檢查項較多，隨劑型不同而不同。重要的有： 固體制劑：重量差異、片重差異、含量均勻度，崩解、溶出度和釋放度和有關(guān)物質(zhì)（雜質(zhì)）等； 液體制劑：可見異物，溶液顏色，澄清度，無菌，熱原、細菌內(nèi)毒素檢查法和有關(guān)物質(zhì)（雜質(zhì)）等。以含量均勻度、溶出度、可見異物檢查法為例分別討論。,1、含量均勻度檢查法,含量均勻

5、度系指小劑量或單劑量的固體制劑、半固體制劑和非均相液體制劑的每片(個)含量符合標示量的程度。各國藥典先采用計數(shù)法，USP21版將計數(shù)法改為計數(shù)-計量混合型檢查法，ChP1990年版開始采用計量法，其他國家藥典也相繼采用計量法。美國等國外藥典的含量均勻度檢查法不斷改進。但是，ChP1990年版以后，該檢查法一直幾乎不變。,1. 1 USP32版檢查法,初試公式： 復試公式：當條件 , ，同時被滿足時，判定批產(chǎn)品合格；否則判為不合格。 的取值見表1。,1. 2 與中國藥典法比較,采用相同的抽樣方式，即二次抽樣法，且抽取的樣本數(shù)相同。兩種方案的接受值(Acceptance value，AV)或稱待判

6、值相同；判別式也基本相同，除USP第二階段的條件外，均可用 描述， 為接受常數(shù)，其值在兩國藥典中有明顯差異，見表2。,1. 2 與中國藥典法比較,USP32版的初、復試兩階段的接受常數(shù) 值均比ChP相應(yīng)值要大， 值越大，在接受值(AV)不變的前提下，含量均勻度離散的標準差 越小，表明USP32版對含量均勻度的控制要求更嚴格，其判別標準明顯高于ChP2010年版，但是，由于USP無復試的附加條件，使復試率較大。,2、溶出度檢查法,2010年版藥典第二增補版已增加可采用光纖在線檢測的相關(guān)內(nèi)容，并規(guī)定檢測結(jié)果不得用于仲裁。 以上三種測定法中，當采用原位光纖實時測定法測定時，賦形劑的干擾應(yīng)可以忽略，或

7、可以通過設(shè)定參比波長等方法消除；該方法特別適用于溶出曲線的測定。,3、可見異物檢查法,該檢查法在藥典整合中遇到了問題，主要是各部原訂的限度，整合在一起時就相互不對應(yīng)，正在協(xié)調(diào)統(tǒng)一之中。,第二部分 制劑的雜質(zhì)研究,雜質(zhì)研究涉及雜質(zhì)分析方法的建立與驗證、雜質(zhì)確認、雜質(zhì)限度的確定及雜質(zhì)控制等諸方面。,一 雜質(zhì)定義和種類,ICH將藥品中雜質(zhì)按其屬性分為無機雜質(zhì)、揮發(fā)性雜質(zhì)和有機雜質(zhì)三類。包括：,無機雜質(zhì),無機雜質(zhì)可能來源于生產(chǎn)過程，它們通常是已知和已鑒定的，包括試劑、配位體、催化劑，重金屬或其他殘留金屬，無機鹽，其他物質(zhì)（如過濾介質(zhì)、活性炭等）等。 在新藥的研制過程中應(yīng)對殘留催化劑進行評估，在標準中是

8、否收載相應(yīng)的檢查項目，應(yīng)進行分析討論。標準限度應(yīng)根據(jù)藥典標準或已知的安全性數(shù)據(jù)來制定。,無機雜質(zhì),采用 ICP-MS 分析各類陽離子，離子色譜分析陰離子的技術(shù)已相對成熟，但目前國內(nèi)對無機雜質(zhì)的控制要求仍相對簡單，將是一個重要的研究方向。 USP制訂藥品重金屬或限量元素總體控制解決新方案，增加三個新通則：元素雜質(zhì)-限度、元素雜質(zhì)-測定法、膳食補充劑中的污染元素。,無機雜質(zhì),新通則目的是規(guī)定藥物中元素雜質(zhì)含量的限度，這些元素以雜質(zhì)存在于原料藥和制劑（包括天然物和rDNA生物制品）、國家處方集的輔料、和美國藥典膳食補充劑綱要的膳食補充劑和營養(yǎng)成分中。 膳食補充劑在通則-膳食補充劑中元素雜質(zhì)（2232

9、）中另有規(guī)定。,無機雜質(zhì),中元素雜質(zhì)的每日允許暴露量（PDE）與ICHQ3D是一致的。在新通則中，著重描述了測定元素雜質(zhì)的兩種常用方法：ICP-AES(方法1)和ICP-MS(方法2)，并提出選擇方法的原則。,揮發(fā)性雜質(zhì),目前的焦點是殘留溶劑分析，參照ICH“Q3C雜質(zhì)：殘留溶劑的指導原則”，按照常用的69種有機溶劑對人體和環(huán)境的危害程度分為4類控制限度，是指在藥物合成中使用的（或用于制備溶液或混懸液的）有機或無機液體，由于它們一般具有已知毒性，故較易選擇控制方法。 根據(jù)各品種生產(chǎn)工藝確定控制對象；推薦采用頂空毛細管氣相色譜法進行分析檢測。,有機雜質(zhì),包括：起始物、副產(chǎn)物、中間體和降解產(chǎn)物等，

10、如何按照QbD (quality by design)的指導思想，建立有效的分析方法并保證分析方法的耐用性則是有機雜質(zhì)譜分析的關(guān)鍵。 對于藥物制劑，需要進行控制的雜質(zhì)還包括其活性組分的降解產(chǎn)物或活性組分與賦形劑和(或)內(nèi)包裝/密封系統(tǒng)的反應(yīng)產(chǎn)物。,有機雜質(zhì),藥物中的雜質(zhì)隨不同來源（不同生產(chǎn)廠或不同工藝過程）而異（見右圖）。,有機雜質(zhì),人用藥品注冊技術(shù)要求國際協(xié)調(diào)會(ICH)制定的雜質(zhì)控制指導原則及基本理念已經(jīng)逐步被國際社會接受。中國藥典從2005年版始在附錄中設(shè)有“藥物雜質(zhì)研究指導原則”，中國藥典2010年版可謂是國內(nèi)近10年來藥品雜質(zhì)研究成果的集中展示。,ICH要求（制劑中的雜質(zhì)）,一般情況

11、下，存在于原料藥中的雜質(zhì)在制劑中不需要監(jiān)控，除非它們也屬于降解產(chǎn)物。制劑中的降解產(chǎn)物是指制劑在生產(chǎn)和貯藏過程中，因如光照、溫度、pH、水或與賦形劑和/或包裝系統(tǒng)互相反應(yīng)而導致原料藥發(fā)生化學變化而產(chǎn)生的雜質(zhì)。,有機雜質(zhì),丁溴東莨菪堿含有酯鍵，在一定pH溶液中發(fā)生水解生成雜質(zhì)。在注射劑工藝中用鹽酸調(diào)節(jié)pH值。采用HPLC法測定不同pH條件下丁溴東莨菪堿降解產(chǎn)物托品酸濃度，根據(jù)數(shù)據(jù)擬合降解曲線（圖2），研究穩(wěn)定性，可為生產(chǎn)和貯存提供重要的參考依據(jù)。,制劑中的雜質(zhì),應(yīng)對制劑生產(chǎn)和/或穩(wěn)定性考察中發(fā)現(xiàn)的降解產(chǎn)物進行綜述。包括對可能降解途徑和因與賦形劑和/或包裝容器反應(yīng)所產(chǎn)生雜質(zhì)的科學評價。 應(yīng)對研究工作

12、進行總結(jié)，包括研發(fā)中生產(chǎn)的批次和擬上市生產(chǎn)批次的試驗結(jié)果。 應(yīng)對不屬于降解產(chǎn)物的雜質(zhì)進行說明。 應(yīng)對擬上市的有代表性批次中雜質(zhì)概況與用于研究的批次作比較，對差異進行討論。,制劑中的雜質(zhì),發(fā)現(xiàn)任何降解產(chǎn)物，如果大于鑒定閾值時應(yīng)予鑒定；若無法鑒定某一降解產(chǎn)物，則予以說明。 在制劑標準中應(yīng)包括以下降解產(chǎn)物檢查項：,制劑中的雜質(zhì),雜質(zhì)（或降解產(chǎn)物）的界定是獲得和評估一些數(shù)值的過程，這些數(shù)值用于建立安全閾值（水平），單個的或某些已明確的雜質(zhì)（或降解產(chǎn)物）含量在此閾值水平下是安全的。應(yīng)對設(shè)定的雜質(zhì)（降解產(chǎn)物）限度提供包括安全性在內(nèi)的依據(jù)。,二 制劑雜質(zhì)研究主要思路,制劑由至少一種API添加各種輔料（或不加

13、）按一定工藝制成，其雜質(zhì)包括原料藥帶入的雜質(zhì)，在制劑制備過程和貯藏期間產(chǎn)生的降解產(chǎn)物，以及藥物之間、藥物與輔料之間相互作用產(chǎn)生的降解產(chǎn)物。由于制劑比原料藥所含雜質(zhì)的來源具有多樣性，數(shù)目也可能要多，使制劑的雜質(zhì)研究較原料藥復雜，復方制劑又較單方制劑更復雜。,二 制劑雜質(zhì)研究主要思路,確定各雜質(zhì)的來源，對其定性和歸屬，限度確定必須以歸屬為基礎(chǔ)。如對于毒性雜質(zhì)，需明確歸屬才能嚴格控制，制定合理的限度。即使對于微量的未知雜質(zhì)，由于來源于不同主藥，其可接受的限量可能不同，一般也應(yīng)確定來源，除非雜質(zhì)的量小于制劑中含量最小藥物可接受的未知雜質(zhì)限量。 制劑雜質(zhì)的來源歸屬是雜質(zhì)研究首先要解決的問題之一。,二 制

14、劑雜質(zhì)研究主要思路,復方制劑有關(guān)物質(zhì)控制基本原則和單方一樣，可看作是在做兩個或者三個產(chǎn)品，不過是同時分析幾個物質(zhì)。相關(guān)的指導原則有ICH Q3A和Q3B和FDA相關(guān)的工業(yè)指南。 首先通過對原料藥化學結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)、穩(wěn)定性等分析，初步預測制劑中可能存在的降解產(chǎn)物（雜質(zhì)的分析預測），然后通過進一步的試驗，對雜質(zhì)來源進行歸屬。,三 雜質(zhì)研究方法與步驟 3. 1 文獻調(diào)研和資料收集, API生產(chǎn)廠的技術(shù)資料，一般有DMF的會提供可公開的部分，包括工藝流程，合成路徑和所有潛在雜質(zhì)的信息。 同品種在USP、EP中的情況，如雜質(zhì)種類和限量。 初步了解制劑中可能存在的潛在雜質(zhì)和降解產(chǎn)物。 了解原研單位的相關(guān)資

15、料和如何控制雜質(zhì)的，如仿制藥的進口注冊標準是非常重要的信息。,3.2 雜質(zhì)來源的分析預測,原料藥引入的雜質(zhì)不是制劑雜質(zhì)研究重點，主要關(guān)注降解產(chǎn)物。通過對各原料藥化學結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)、穩(wěn)定性等分析，初步預測可能存在的降解產(chǎn)物。如酯鍵、酰胺鍵易水解，通過分析可確定水解產(chǎn)生的雜質(zhì)。 原料藥及單方制劑穩(wěn)定性試驗對（復方）制劑中雜質(zhì)的預測具重要參考意義，原料藥及單方制劑貯藏中易出現(xiàn)的降解產(chǎn)物在（復方）制劑中一般也會存在。如對原料藥穩(wěn)定性及降解研究有助于確定不同制劑工藝（如是否接觸水分、是否經(jīng)高溫處理、是否避光等）可產(chǎn)生的雜質(zhì)；通過對各原料藥化學結(jié)構(gòu)分析，可初步判斷主藥間是否存在作用而產(chǎn)生雜質(zhì)。,3.3 建

16、立可靠的分析方法,分析方法是獲取雜質(zhì)信息的重要手段，因此，要選擇合適的分析方法。分析方法的建立是一個復雜工程，原則就是方法要簡便、準確、重現(xiàn)性好、專屬性強。 方法應(yīng)能有效分離各雜質(zhì)，靈敏度除應(yīng)符合一般要求外，還要關(guān)注對制劑中含量較小的藥物所產(chǎn)生雜質(zhì)的檢出能力。 方法必須具有穩(wěn)定性指示功能（stability indicating），含量測定和有關(guān)物質(zhì)都有穩(wěn)定性指示功能的要求，因此，含量和有關(guān)物質(zhì)測定一般采用相同的色譜條件。評價方法是否具有穩(wěn)定性指示功能的主要依據(jù)就是stress study(破壞實驗)。, 關(guān)注不同方法間的互補與驗證,HPLC-UV法被認為是一種理想的檢測手段，在雜質(zhì)研究中普遍

17、采用，但是，對于雜質(zhì)檢測來講，得到的色譜圖不一定能真實反映實際情況。 極性太強化合物可能被掩蓋(與溶劑峰重疊)，極性太小化合物保留在柱上難以被洗脫。 無紫外吸收不能被檢出，或在檢測波長處吸收相差較大的多種化合物不能被同時有效檢出。如圖A是某注射液穩(wěn)定性考察中286nm檢測有關(guān)物質(zhì)的色譜圖，圖B為改用230nm檢測的色譜圖。, 關(guān)注不同方法間的互補與驗證, 關(guān)注不同方法間的互補與驗證,檢測波長應(yīng)兼顧主藥和各雜質(zhì)的吸收情況來選擇，必要時在分別在特定波長下檢測特定雜質(zhì)。 對無紫外吸收的雜質(zhì)，可改用其他類型檢測器，如選擇蒸發(fā)光散射檢測器，其靈敏度高于示差折光檢測器。ECD檢測器對于無紫外吸收的雜質(zhì)檢測

18、在靈敏度方面更具優(yōu)勢，如USP30中阿奇霉素有關(guān)物質(zhì)檢測在原HPLC-UV方法基礎(chǔ)上增加HPLC-ECD方法，并作為檢測結(jié)果的仲裁方法。, 關(guān)注不同方法間的互補與驗證,HPLC-MS應(yīng)用已非常廣泛，但在標準中應(yīng)用實例還不多，要從必要性、實用性和經(jīng)濟性等方面考慮選擇。 應(yīng)注意不同原理的分析方法間的相互補充與驗證，如HPLC與TLC的互相補充，反相HPLC系統(tǒng)與正相HPLC系統(tǒng)的相互補充，HPLC不同檢測器的相互補充等。藥物雜質(zhì)多樣性決定了有時以現(xiàn)有技術(shù)難以使用一種檢測手段同時檢測所有雜質(zhì)，如采用TLC法檢測無紫外吸收且極性過大的雜質(zhì)，用HPLC法檢測其他雜質(zhì)。, 關(guān)注不同雜質(zhì)色譜行為的差異,雜質(zhì)

19、比較復雜且多是未知物，極性、油/水分配等特性有時相差較大，等度洗脫法難以在較短時間完全洗脫所有雜質(zhì)，梯度洗脫法可在較短時間內(nèi)有效分離極性相差懸殊的物質(zhì)。合適的梯度不僅可優(yōu)化各物質(zhì)保留時間，較短時間內(nèi)全部洗脫各種雜質(zhì)，同時還可改善峰形，提高檢測靈敏度。在國外雜質(zhì)研究中廣為應(yīng)用，呈現(xiàn)出逐步取代等。 但與等度法相比，梯度法操作復雜，可引起色譜基線漂移，影響結(jié)果精密度。如果等度法可有效檢出相關(guān)雜質(zhì)，應(yīng)作為首選，但方法學驗證中，梯度法在驗證等度法是否有效檢出所有相關(guān)雜質(zhì)時具有重要意義。, 采用新的雜質(zhì)檢測手段,國際上雜質(zhì)研究不斷吸納分析科學新成就，色譜儀器越來越專業(yè)化（凝膠色譜、離子色譜、逆流色譜等相繼

20、用于檢測），色譜與光譜聯(lián)用技術(shù)越來越成熟，如HPLC-UV、HPLC-MS、HPLC-NMR、GC-MS、GC-IR等已經(jīng)成為最重要的方法，但是，在雜質(zhì)結(jié)構(gòu)分析鑒定中，各種光譜技術(shù)（UV、IR、MS、NMR和X-射線衍射法等）仍然是不可或缺的方法。 各類數(shù)據(jù)庫越來越豐富，聯(lián)機智能化解析系統(tǒng)越來越普及，為雜質(zhì)研究提供了更為完善的利器。, 采用新的雜質(zhì)檢測手段,雜質(zhì)檢測逐步呈現(xiàn)出全面檢出（梯度洗脫，多檢測手段互補、明確靈敏度要求）、有效分離（規(guī)定最難分離物質(zhì)對色譜峰的分離度）、目標明確（特定雜質(zhì)、非特定雜質(zhì)）、準確定量（外標、校正因子、歸一法相結(jié)合）的趨勢。 反觀國內(nèi)雜質(zhì)研究情況則基本沿用十幾年一

21、貫制的反相HPLC-UV組合的檢測方法，色譜柱仍局限于C8、C18及-CN等常規(guī)填料，洗脫方式基本采用簡單的等度洗脫法，對雜質(zhì)定量也多為自身對照法，差距較為明顯。,4 雜質(zhì)譜分析與雜質(zhì)確認,以雜質(zhì)譜為主線，以安全性為核心，將雜質(zhì)研究與化學、生產(chǎn)與控制、藥理毒理及臨床安全性研究等環(huán)節(jié)密切聯(lián)系，通盤考量。 遺傳毒性雜質(zhì)對細胞DNA產(chǎn)生損傷，不能僅研究主成分、還應(yīng)包括雜質(zhì)的遺傳毒性。 雜質(zhì)譜含所有雜質(zhì)種類、含量、來源及結(jié)構(gòu)等信息。通過雜質(zhì)譜分析較為全面地掌握雜質(zhì)概貌（包括來源和結(jié)構(gòu))；應(yīng)確保雜質(zhì)有效檢出和確認；跟蹤雜質(zhì)譜對安全性或臨床試驗結(jié)果產(chǎn)生的影響，評估雜質(zhì)可接受水平；結(jié)合生產(chǎn)時雜質(zhì)譜的變化，評

22、估雜質(zhì)安全性風險，確立安全的雜質(zhì)控制水平。,4 雜質(zhì)譜分析與雜質(zhì)確認,從制備工藝和產(chǎn)品結(jié)構(gòu)分析入手，評估、預測可能存在的副產(chǎn)物、中間體、降解物以及試劑、催化劑等大體雜質(zhì)概況，考證建立的分析方法是否能夠?qū)⑺鼈冎鹨粰z出，并進行相應(yīng)的驗證工作，是雜質(zhì)研究的主動思維，而傳統(tǒng)的被動行為僅從建立的一種檢測方法所檢出的有關(guān)物質(zhì)歸屬其來源情況，容易出現(xiàn)雜質(zhì)漏檢的情況，難以全面掌握雜質(zhì)譜。雜質(zhì)譜分析對于合理確定雜質(zhì)限度、降低雜質(zhì)安全性風險具有重要意義。,4 雜質(zhì)譜分析與雜質(zhì)確認,雜質(zhì)控制理念變遷為三個主要階段： 純度控制：通過對純度控制間接實現(xiàn)雜質(zhì)控制。 雜質(zhì)限度控制：單純的“限度控制”理念存在缺陷。 雜質(zhì)譜：

23、諸雜質(zhì)的種類與含量被總稱為雜質(zhì)譜(impurity profiles)。理想的控制理念是針對藥品中每一個雜質(zhì)，依據(jù)藥理、毒理學試驗結(jié)果和生理活性逐一制定其質(zhì)控限度。 在標準中按“雜質(zhì)譜控制”的理念對藥品中雜質(zhì)進行控制是雜質(zhì)控制的最終目標，而對雜質(zhì)結(jié)構(gòu)的推斷則是雜質(zhì)研究/控制過程中最重要環(huán)節(jié)。,5 雜質(zhì)限度確定的基本思路,綜合藥學、藥理毒理及臨床研究結(jié)果綜合判定， 除用含雜質(zhì)的 樣品也可用該雜質(zhì)進行毒理試驗，為雜質(zhì)限度的確定提供依據(jù)。 某已知雜質(zhì)的毒性文獻記載，可作為雜質(zhì)限度確定的依據(jù)之一。 對雜質(zhì)的控制及其限度：還應(yīng)考慮 非臨床安全性和臨床研究用樣品的雜質(zhì)概況， 工藝穩(wěn)定的具有一定代表性批次大

24、生產(chǎn)產(chǎn)品的雜質(zhì)概況匯總和分析。,5 雜質(zhì)限度確定的基本思路,確定雜質(zhì)限度的基本原則是As Low As Reasonable Practicable (ALARP)，包括： 雜質(zhì)的活性或毒性，是評估雜質(zhì)可接受水平的核心要素，限度確定的首要依據(jù)。 工藝、生產(chǎn)中正常波動和制備工藝耐用性反映出的產(chǎn)品質(zhì)量批內(nèi)一致性和批間重復性。 分析方法能達到的檢測水平，可接受的誤差和精密度。 穩(wěn)定性，產(chǎn)品儲運過程中控制降解的方法和措施，以及擬定貯藏條件下能使產(chǎn)品保持其規(guī)定質(zhì)量指標的有效期。,6 異構(gòu)體雜質(zhì),藥物的異構(gòu)體也常是藥物的雜質(zhì)，應(yīng)在藥品標準中進行控制。 手性異構(gòu)體雜質(zhì)控制 手性藥物質(zhì)量研究的一個關(guān)鍵就是對藥

25、物光學純度的控制。分析手性藥物光學純度的常用方法有：比旋度法、圓二色光譜法和手性色譜法。比旋度法較為簡單，但影響比旋度數(shù)值的因素較多，必要時，可采用圓二色光譜法和手性色譜法，可以更為準確直觀地反映各立體異構(gòu)體雜質(zhì)的變化情況。,6 異構(gòu)體雜質(zhì), 互變異構(gòu)體分析 有機化合物結(jié)構(gòu)在兩種官能團異構(gòu)體間產(chǎn)生平衡互相轉(zhuǎn)換，相應(yīng)的異構(gòu)體稱為互變異構(gòu)體。大多數(shù)互變異構(gòu)都涉及氫原子或質(zhì)子的轉(zhuǎn)移，以及單鍵向雙鍵的轉(zhuǎn)變。互變異構(gòu)體在平衡中的分布與具體的因素有關(guān)，包括溫度、溶劑和pH值等。 常見的互變異構(gòu)包括：酮-烯醇，例如酮-烯醇互變異構(gòu)。酰胺-亞胺酸，例如腈水解反應(yīng)。內(nèi)酰胺-內(nèi)酰亞胺，雜環(huán)中的酰胺-亞胺酸互變異構(gòu)

26、，例如鳥嘌呤、胸腺嘧啶和胞嘧啶。烯胺-亞胺，烯胺-烯胺，例如磷酸吡哆醛催化的酶反應(yīng)。,6 異構(gòu)體雜質(zhì), 互變異構(gòu)體分析 研究互變異構(gòu)體的常用方法有NMR、拉曼和紫外等光譜方法。,6 異構(gòu)體雜質(zhì), 互變異構(gòu)體分析 平衡體系中互變異構(gòu)體組分的變化引起了熒光發(fā)射峰的位置發(fā)生大幅度位移。,6 異構(gòu)體雜質(zhì), 互變異構(gòu)體分析 在常溫下蘭索拉唑以I和II式兩種構(gòu)型同時存在于溶液中，兩種構(gòu)型間不斷翻轉(zhuǎn)互變，從而使部分BNR譜線變寬。溫度上升，兩種異構(gòu)體翻轉(zhuǎn)互變速度不斷加快，I式與II式構(gòu)型中某些信號化學位移逐步靠近，寬峰變窄，甚至合并成單峰；溫度的下降，兩種異構(gòu)體翻轉(zhuǎn)互變速度下降，在丙酮中溫度降到70C后，化

27、合物以一種穩(wěn)定構(gòu)型存在。,6 異構(gòu)體雜質(zhì), 互變異構(gòu)體分析,6 異構(gòu)體雜質(zhì), 互變異構(gòu)體分析 考察中性和質(zhì)子化可樂定分子構(gòu)型的構(gòu)象，比較處于優(yōu)勢構(gòu)象時互變異構(gòu)體的相對穩(wěn)定性，進一步尋找構(gòu)象異構(gòu)化和互變異構(gòu)化過渡態(tài)，探討質(zhì)子化和水溶劑化效應(yīng)對異構(gòu)化過程的幾何結(jié)構(gòu)和能量的影響等。, 穩(wěn)定性研究,穩(wěn)定性研究對于手性異構(gòu)體和互變異構(gòu)體藥物都是非常重要的。,四 雜質(zhì)歸屬研究的注意事項,1 分別測定各原料藥、原料藥按處方比例混合物、輔料、原輔料混合物、制劑樣品在確定的雜質(zhì)檢查色譜條件下的HPLC圖譜，對上述圖譜進行對比研究，以確定制劑色譜圖中輔料峰、由各原料藥引入的雜質(zhì)峰。另外，可通過比較各原料藥的HPL

28、C圖譜與原料藥混合物的HPLC圖譜初步確定原料藥之間是否有相互作用；通過比較原料藥混合物的HPLC圖譜、輔料的HPLC圖譜以及原輔料混合物的HPLC圖譜，可初步確定原輔料之間是否有相互作用；通過比較原輔料混合物的HPLC圖譜與制劑的HPLC圖譜，可初步確定制劑過程是否引起主藥的降解和雜質(zhì)的增加。,四 雜質(zhì)歸屬研究的注意事項,2 對各原料藥、原料藥按處方比例混合物、輔料、原輔料混合物、制劑分別進行光、熱、濕影響因素試驗，測定試驗前后樣品的HPLC圖譜并進行比較分析，可明確制劑中藥物在強光、高溫、高濕條件下的主要降解產(chǎn)物，對（復方）制劑中的降解產(chǎn)物進行歸屬，并可通過上述比較研究，基本確定藥物與藥物

29、之間、藥物與輔料之間在劇烈條件下是否存在相互作用，是否產(chǎn)生新的雜質(zhì)。,四 雜質(zhì)歸屬研究的注意事項,3 對各原料藥、原料藥混合物、輔料、原輔料混合物、制劑分別進行穩(wěn)定性加速試驗（試驗條件一般選擇40，相對濕度75），測定不同時間樣品的HPLC圖譜并進行比較分析，并與制劑長期留樣試驗樣品的測定結(jié)果進行比較。通過這些研究工作，可進一步明確（復方）制劑中各雜質(zhì)的歸屬，明確藥物在加速試驗條件下及一般貯藏條件下的主要降解產(chǎn)物，為確定貯藏條件及質(zhì)量控制重點建立基礎(chǔ)。,四 雜質(zhì)歸屬研究的注意事項,4 盡可能地采用雜質(zhì)對照品定位和測定，其次采用加校正因子定量法，再其次是主成分自身對照法，要逐一進行單個雜質(zhì)的測定

30、，一般不要以總雜質(zhì)作為雜質(zhì)指標。如果兩個成分響應(yīng)值相差很大，自身對照外標法也不可靠。選擇可行的方法。 要注意觀察樣品外觀性狀、主藥含量等變化，以與雜質(zhì)檢查結(jié)果相互印證。 國外標準常采用相對保留時間對雜質(zhì)進行歸屬，但是在國內(nèi)重現(xiàn)性非常差。如一個品種參照國外藥典制定質(zhì)量標準，把各個成分的降解產(chǎn)物分別計算，但是在復核時沒有重現(xiàn)性，最后才確定為總雜質(zhì)。,第三部分 分析方法驗證,藥品檢驗方法驗證的重要性 設(shè)計的檢驗方法應(yīng)能達到預期的效果，保證測定結(jié)果準確可靠，確保藥品的安全有效。CHP藥品質(zhì)量標準分析方法驗證指導原則，藥審中心-化學藥物質(zhì)量控制分析方法，USP通則1225藥典分析方法驗證、通則1226藥

31、典分析方法確認，均依照ICH Q2(R1)。 USP明確規(guī)定：分析方法驗證：建立方法要驗證，修訂方法要驗證；分析方法確認：應(yīng)用方法時要確認方法是否適用。,驗證的目的（CHP）,“是證明采用的方法適合于相應(yīng)檢測要求。在建立藥品質(zhì)量標準時，分析方法需經(jīng)驗證；在藥品生產(chǎn)工藝變更、制劑的組分變更、中藥處方變更、原分析方法進行修訂時，則質(zhì)量標準分析方法也需進行驗證。方法驗證理由、過程和結(jié)果均應(yīng)記載在藥品質(zhì)量標準起草說明或修訂說明中。 生物制品質(zhì)量控制中采用的方法包括理化分析方法和生物學測定方法，其中理化分析方法的驗證原則與化學藥品基本相同，所以可參照本指導原則進行，但在進行具體驗證時還需要結(jié)合生物制品的

32、特點考慮；生物學測定有更多的影響因素，一般要使用動物、細胞或生物分子，因此對于生物學測定的判斷標準另作說明。”,需驗證的項目和內(nèi)容（CHP）,分析項目：鑒別試驗、雜質(zhì)限度檢查或定量檢查、原料藥或制劑中有效成分含量測定，以及制劑中其他成分(如防腐劑等，中藥中如殘留物、添加劑等）的測定。藥品溶出度、釋放度等檢査中，其溶出量等的測試方法也應(yīng)進行必要驗證。 驗證內(nèi)容：準確度、精密度（包括重復性、中間精密度和重現(xiàn)性）、專屬性、檢測限、定量限、線性、范圍和耐用性。視具體方法擬訂驗證的內(nèi)容。 ICH需驗證的分析類型（項目）和驗證的分析特性(內(nèi)容)和中國藥典相似。,一 準確度 （1 含量測定方法的準確度）,原

33、料藥可用已知純度的對照品或供試品進行測定，或用本法所得結(jié)果與已知準確度的另一個方法測定的結(jié)果進行比較。 制劑可在處方量空白輔料中，加入已知量被測物（原文可用含已知量被測物的各組分混合物）進行測定。如不能得到制劑輔料的全部組分，可向待測制劑中加入已知量的被測物進行測定，或用本法所得結(jié)果與已知準確度的另一個方法測定結(jié)果進行比較。 如已測試并求出了精密度、線性和專屬性，在準確度也可推算出來的情況下，此項可豁免驗證。,一 準確度 （2 雜質(zhì)定量測定的準確度）,可向原料藥或制劑處方量空白輔料中加入已知量雜質(zhì)進行測定。如不能得到雜質(zhì)或降解產(chǎn)物對照品，可用本法測定結(jié)果與另一成熟的方法進行比較，如藥典標準方法

34、或經(jīng)過驗證的方法。在不能測得雜質(zhì)或降解產(chǎn)物的響應(yīng)因子或不能測得對主成分（原料藥）的相對響應(yīng)因子的情況下，可用主成分（原料藥）的響應(yīng)因子。應(yīng)明確表明單個雜質(zhì)和雜質(zhì)總量相當于主成分的重量比（%）或面積比（%）。,一 準確度 （3 中藥測定方法的準確度）,可用已知純度的對照品進行加樣回收率測定，即于已知被測成分含量的供試品中再精密加入一定量的已知純度的被測成分對照品，依法測定。用實測值與供試品中含有量之差，除以加入對照品量計算回收率。在加樣回收試驗中須注意對照品的加入量與供試品中被測成分含有量之和必須在標準曲線線性范圍之內(nèi)；加入的對照品的量要適當，過小則引起較大的相對誤差，過大則干擾成分相對減少，真

35、實性差。 回收率=（C-A）/B100% 式中A為供試品所含被測成分量；B為加入對照品量；C為實測值。,一 準確度 （4 校正因子的準確度）,待測定物質(zhì)與所選定的參照物質(zhì)的絕對校正因子之比，即為相對校正因子。用于化學藥有關(guān)物質(zhì)的測定、中藥材及其復方制劑中多指標成分的測定。校正因子的表示方法很多，本文氣GC法和HPLC法中相對重量校正因子。 可采用實測的相對校正因子與替代物（對照品）和被替代物（待測物）標準曲線斜率比值進行比較方法；采用紫外檢測器時，可將實測的相對校正因子與替代物（對照品）和被替代物（待測物）在指定的波長和溶劑條件下吸收系數(shù)比值進行比較。 準確度（）=A/B100% A為替代物（

36、對照品）標準曲線斜率（UV吸收系數(shù)）；B為被替代物（待測物）標準曲線斜率（UV吸收系數(shù)）。,一 準確度 （5 數(shù)據(jù)要求）,在規(guī)定范圍內(nèi)，取相當于100%濃度水平的供試品，用至少6次的結(jié)果進行評價；或設(shè)計3個不同濃度，每個濃度分別制備3份供試品溶液，用9個測定結(jié)果進行評價。 化學藥，一般中間濃度加入量與待測定成分量之比控制在1:1左右，高、中、低濃度對照品加入量在1.2:1，1:1，0.8:1左右，應(yīng)報告已知加入量的回收率（%），或測定結(jié)果平均值與真實值之差及其相對標準偏差或可信限； 對于中藥，一般中間濃度加入量與所取供試品中待測定成分量之比控制在1:1左右，高、中、低濃度對照品加入量與所取供試

37、品中待測定成分量之比在1.5:1，1:1，0.5:1左右，應(yīng)報告供試品取樣量、供試品中含有量、對照品加入量、測定結(jié)果和回收率（%）計算值，以及回收率（%）的相對標準偏差（RSD%）或可信限（置信度，又稱置信水平，設(shè)定值是95%。）。 對于校正因子，應(yīng)報告測定方法、測定結(jié)果和相對標準偏差（RSD%）。,一 準確度 （ 樣品中待測成分含量與回收率限度）,二 精密度,精密度一般用偏差、標準偏差或相對標準偏差表示。 在相同條件下，由同一個分析人員測定所得結(jié)果的精密度稱為重復性；在同一個實驗室，不同時間由不同分析人員用不同設(shè)備測定結(jié)果之間的精密度，稱為中間精密度；在不同實驗室由不同分析人員測定結(jié)果之間的

38、精密度，稱為重現(xiàn)性。 含量測定和雜質(zhì)的定量測定應(yīng)考慮方法的精密度。,二 精密度,1.重復性 在規(guī)定范圍內(nèi)，取同一濃度（相當于100%濃度水平）的供試品，用至少測定6次的結(jié)果進行評價；或設(shè)計3個不同濃度，每個濃度分別制備3份供試品溶液進行測定，用9個測定結(jié)果進行評價。 2.中間精密度 為考察隨機變動因素對精密度的影響，應(yīng)設(shè)計方案進行中間精密度試驗。變動因素為不同日期、不同分析人員、不同設(shè)備。,二 精密度,3.重現(xiàn)性 法定標準采用的分析方法，應(yīng)進行重現(xiàn)性試驗。例如，建立藥典分析方法時，通過協(xié)同檢驗獲得重現(xiàn)性結(jié)果。協(xié)同檢驗的目的、過程和重現(xiàn)性結(jié)果均應(yīng)記載在起草說明中。應(yīng)注意重現(xiàn)性試驗用樣品質(zhì)量的一致

39、性及貯存運輸中的環(huán)境對該一致性的影響（原文：應(yīng)注意重現(xiàn)性試驗用樣品本身質(zhì)量的均勻性和貯存運輸中的環(huán)境影響因素），以免影響重現(xiàn)性結(jié)果。 4.數(shù)據(jù)要求 均應(yīng)報告標準偏差、相對標準偏差和可信限。樣品中待測定成分含量和精密度RSD可接受范圍參考表2。,二 精密度,樣品中待測定成分含量和精密度RSD可接受范圍,三 專屬性,鑒別反應(yīng)、雜質(zhì)檢査和含量測定方法，均應(yīng)考察其專屬性。如方法專屬性不夠，應(yīng)采用多種不同原理的方法予以補充。 1.鑒別反應(yīng) 應(yīng)能與可能共存的物質(zhì)或結(jié)構(gòu)相似化合物區(qū)分。不含被測成分的供試品，以及結(jié)構(gòu)相似或組分中的有關(guān)化合物，應(yīng)均呈負反應(yīng)。 2.含量測定和雜質(zhì)測定 色譜法和其他分離方法，應(yīng)附代

40、表性圖譜，以說明方法的專屬性，并應(yīng)標明諸成分在圖中的位置，色譜法中的分離度應(yīng)符合要求。,三 專屬性,在雜質(zhì)對照品可獲得的情況下，對于含量測定，試樣中可加入雜質(zhì)或輔料，考察測定結(jié)果是否受干擾，并可與未加雜質(zhì)或輔料的試樣比較測定結(jié)果。對于雜質(zhì)檢查，也可向試樣中加入一定量的雜質(zhì)，考察雜質(zhì)之間能否得到分離。 在雜質(zhì)或降解產(chǎn)物不能獲得情況下，可將含有雜質(zhì)或降解產(chǎn)物的試樣進行測定，與另一個經(jīng)驗證了的方法或藥典方法比較結(jié)果。用強光照射、高溫、高濕、酸（堿）水解或氧化的方法進行加速破壞，以研究可能的降解產(chǎn)物和降解途徑。含量測定方法應(yīng)比對二法的結(jié)果，雜質(zhì)檢查應(yīng)比對檢出的雜質(zhì)個數(shù)，必要時可采用光二極管陣列檢測和質(zhì)

41、譜檢測，進行峰純度檢查。,四 檢測限,檢測限系指試樣中被測物能被檢測出的最低量。鑒別試驗和雜質(zhì)檢查法，均應(yīng)通過測試確定方法的檢測限。常用的方法如下。 1.直觀法（原文：非儀器分析目測法） 用已知濃度的被測物，試驗出能被可靠地檢測出的最低濃度或量。 2.信噪比法 用于能顯示基線噪聲的分析方法，即把已知低濃度試樣測出的信號與空白樣品測出的信號進行比較，算出能被可靠地檢測出的最低濃度或量。一般以信噪比為3:1或2:1時相應(yīng)濃度或注入儀器的量確定檢測限。,四 檢測限,3.基于響應(yīng)值標準偏差和標準曲線斜率法 DL=3.3/S （：響應(yīng)值的偏差；S：標準曲線的斜率） 可以通過一系列方法測得，如：（1）測定

42、空白值的標準偏差；（2）標準曲線的剩余標準偏差或是截距的標準偏差來代替 剩余標準偏差SE（即通過線性回歸法計算縱坐標預測值所產(chǎn)生的標準誤差），在Excel中的函數(shù)是STEYX。,四 檢測限,4.數(shù)據(jù)要求 上述計算方法獲得的檢測限數(shù)據(jù)需用實際樣品進行驗證。應(yīng)附測試圖譜，說明測試過程和檢測限結(jié)果。,五 定量限,指試樣中被測物能被定量測定的最低量，其測定結(jié)果應(yīng)具一定準確度和精密度。雜質(zhì)和降解產(chǎn)物用定量測定方法研究時，應(yīng)確定方法的定量限。常用的方法如下。 1.直觀法 用已知濃度的被測物，試驗出能被可靠地定量測定的最低濃度或量。 2.信噪比法 用于能顯示基線噪聲的分析方法，即把已知低濃度試樣測出的信號與

43、空白樣品測出的信號進行比較，算出能被可靠地定量的最低濃度或量。一般以信噪比為10:1時相應(yīng)濃度或注入儀器的量確定定量限。,五 定量限,3.基于響應(yīng)值標準偏差和標準曲線斜率法 QL=10/S （：響應(yīng)值的偏差；S：標準曲線的斜率） 可以通過一系列方法測得，如：（1）測定空白值的標準偏差；（2）標準曲線的剩余標準偏差或是截距的標準偏差來代替。 4.數(shù)據(jù)要求 上述計算方法獲得的定量限數(shù)據(jù)需用實際樣品進行驗證。應(yīng)附測試圖譜，說明測試過程和定量限結(jié)果。,六 線性,線性系指在設(shè)計的范圍內(nèi)，測試結(jié)果與試樣中被測物濃度直接呈正比關(guān)系的程度。 應(yīng)在規(guī)定的范圍內(nèi)測定線性關(guān)系。可用同一對照品（或工作對照品）貯備液經(jīng)

44、精密稀釋，或分別精密稱取同一對照品（或工作對照品），制備一系列對照品（或工作對照品）溶液的方法進行測定，至少制備5份測試樣品。以測得的響應(yīng)信號作為被測物濃度的函數(shù)作圖，觀察是否呈線性，再用最小二乘法進行線性回歸。必要時，響應(yīng)信號可經(jīng)數(shù)學轉(zhuǎn)換，再進行線性回歸計算。必要時，還可采用描述濃度-響應(yīng)關(guān)系的非線性模型。 數(shù)據(jù)要求：應(yīng)列出回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性圖（或其它數(shù)學模型）。,七 范圍,指能達到一定精密度、準確度和線性，測試方法適用的高低限濃度或量的區(qū)間。 范圍應(yīng)根據(jù)分析方法的具體應(yīng)用和線性、準確度、精密度結(jié)果和要求確定。原料藥和制劑含量測定，范圍一般為測試濃度的80%120%；制劑含量均勻度檢査

45、，范圍一般為測試濃度的70%130%, 特殊劑型，如氣霧劑和噴霧劑，范圍可適當放寬；溶出度或釋放度中的溶出量測定，范圍一般為限度的20%，如規(guī)定了限度范圍，則應(yīng)為下限的-20%至上限的+20%；雜質(zhì)測定，范圍應(yīng)根據(jù)初步實際測定數(shù)據(jù)，擬訂為規(guī)定限度的20%。如果含量測定與雜質(zhì)檢查同時進行，用百分歸一化法，則線性范圍應(yīng)為雜質(zhì)規(guī)定限度的-20%至含量限度（或上限）的+20%。,七 范圍,在中藥分析中，范圍應(yīng)根據(jù)分析方法的具體應(yīng)用和線性、準確度、精密度結(jié)果及要求確定。對于有毒的、具特殊功效或藥理作用的成分，其驗證范圍應(yīng)大于被限定含量的區(qū)間。溶出度或釋放度中的溶出量測定，范圍一般為限度的20%。 校正因

46、子測定時，范圍一般應(yīng)根據(jù)其應(yīng)用對象的測定范圍確定。,八 耐用性,耐用性系指在測定條件有小的變動時，測定結(jié)果不受影響的承受程度，為所建立的方法用于常規(guī)檢驗提供依據(jù)。開始研究分析方法時，就應(yīng)考慮其耐用性。如果測試條件要求苛刻，則應(yīng)在方法中寫明，并注明可以接受變動的范圍，可以先采用均勻設(shè)計確定主要影響因素，再通過單因素分析等確定變動范圍。典型的變動因素有：被測溶液的穩(wěn)定性、樣品的提取次數(shù)、時間等。液相色譜法中典型的變動因素有：流動相的組成和pH值、不同廠牌或不同批號的同類型色譜柱、柱溫、流速等。氣相色譜法變動因素有：不同廠牌或批號的色譜柱、固定相、不同類型的擔體、柱溫、進樣口和檢測器溫度等。 經(jīng)試驗

47、，應(yīng)說明小的變動能否通過設(shè)計的系統(tǒng)適用性試驗，以確保方法有效。,分析方法驗證表,已有重現(xiàn)性驗證，不需驗證中間精密度。 如一種方法不夠?qū)?，可用其他分析方法予以補充。 視具體情況予以驗證。 美國藥典：分析方法驗證是通過實驗室研究建立工作特性滿足目標分析要求的方法的過程。,第四部分 穩(wěn)定性研究的關(guān)注點,一、概述 穩(wěn)定性是指藥物保持物理、化學、生物學和微生物學特性的能力。研究基于對生產(chǎn)工藝的系統(tǒng)研究和理解，通過設(shè)計試驗獲得原料藥或制劑的質(zhì)量特性在各種環(huán)境因素（如溫度、濕度、光照等）的影響下隨時間變化的規(guī)律，并據(jù)此為處方、工藝、包裝、貯藏條件和復驗期/有效期的確定提供支持性信息。 穩(wěn)定性研究始于研發(fā)的

48、初期，并貫穿于研發(fā)的整個過程。 基于目前認知的考慮，其他方法如經(jīng)證明合理也可采用。,二、穩(wěn)定性研究的內(nèi)容及試驗設(shè)計 是通過設(shè)計一系列的試驗來揭示藥物穩(wěn)定性特征。 強制試驗了解對上述影響因素的敏感性，主要的降解途徑及降解產(chǎn)物，并驗證分析方法的可行性、確定加速試驗的放置條件及為選擇合適的包裝材料提供參考。 加速試驗是在高于長期貯藏溫度和濕度條件下的穩(wěn)定性，為處方工藝設(shè)計、偏離實際貯藏條件是否依舊保持質(zhì)量穩(wěn)定提供依據(jù)，根據(jù)結(jié)果確定是否需要進行中間條件下的穩(wěn)定性試驗及確定長期試驗的放置條件。 長期試驗是考察藥物在擬定貯藏條件下的穩(wěn)定性，為確認包裝、貯藏條件及復驗期/有效期提供數(shù)據(jù)支持。 光照試驗應(yīng)采用去除包裝的樣品進行；如結(jié)果顯示其過度降解，先要排除光照引起的環(huán)境溫度升高造成的降解，故可增加避光的平行樣品作對照，以消除光照之外其他因素對試驗結(jié)果的影響。另外，還應(yīng)采用內(nèi)包裝（必要時，甚至是內(nèi)包裝加外包裝）的樣品進行試驗，以考察包裝對光照的保護作用。,三、試驗樣品的要求及考察項目設(shè)置 樣品應(yīng)具有代表性。注冊應(yīng)采用至少中試批次（或驗證批次）的樣品，合成路線、處方及工藝應(yīng)與生產(chǎn)產(chǎn)品一致或與關(guān)鍵工藝步驟一致，樣品應(yīng)能代表生產(chǎn)產(chǎn)品的質(zhì)量；包裝容器也應(yīng)與商業(yè)化生產(chǎn)產(chǎn)品相同或相似。 強制條