1、食品加工用水的微生物檢測方法介紹,姜英輝,與水質(zhì)相關(guān)的各類標(biāo)準(zhǔn)和檢驗方法,GB5749-2006， 生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn) 代替 （GB5749-85） GB/T 5750-2006 生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)檢驗方法 GB/T 5750.1 總則 GB/T 5750.2 水樣的采集和保存 GB/T 5750.3 水質(zhì)分析質(zhì)量控制 GB/T 5750.4 感官性狀和物理指標(biāo) GB/T 5750.5 無機非金屬指標(biāo) GB/T 5750.6 金屬指標(biāo) GB/T 5750.7 有機物綜合指標(biāo) GB/T 5750.8 有機物指標(biāo) GB/T 5750.9 農(nóng)藥指標(biāo) GB/T 5750.10 消毒副產(chǎn)物指標(biāo) GB/T

2、 5750.11 消毒劑指標(biāo) GB/T 5750.12 微生物指標(biāo) GB/T 5750.13 放射性指標(biāo),以上標(biāo)準(zhǔn)于2007年7月1日正式實施，代替1985年的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn),與水質(zhì)相關(guān)的各類標(biāo)準(zhǔn)和檢驗方法,GB85371995，飲用天然礦泉水 GB85381995，飲用天然礦泉水檢驗方法 GB173231998，瓶裝飲用純凈水 GB173241998，瓶裝飲用純凈水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn) GB192982003，瓶（桶）裝飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn) GB129971991， 水質(zhì) 采樣方案設(shè)計技術(shù)規(guī)定 GB129981991， 水質(zhì) 采樣技術(shù)指導(dǎo) GB129991991， 水質(zhì)采樣，樣品的保存和管理技術(shù)規(guī)定,各類水質(zhì)的細菌

3、學(xué)指標(biāo)要求,各類水質(zhì)的細菌學(xué)指標(biāo)要求(續(xù)),水樣的采集和保存方法 GB/T 5750.2,1 水樣的采集方法 范圍：適用于生活飲用水和及其水源水樣的采集和保存 采樣容器：玻璃材質(zhì)，不透明非活性玻璃容器。 容器及塞子、蓋子應(yīng)經(jīng)滅菌溫度并且在此溫度下不釋放或產(chǎn)生出任何能抑制生物活性、滅活或促進生物生長的化學(xué)物質(zhì)。 采樣容器的洗滌和滅菌： 1 容器洗滌：將容器用自來水和洗滌劑洗滌，并且用自來水徹底沖洗后用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10的鹽酸溶液浸泡過夜，然后依次用自來水，蒸餾水洗凈。 2 容器滅菌：熱力滅菌。干熱滅菌要求160，2h；高壓蒸汽滅菌121，15min。高壓蒸汽滅菌后的容器如不立即使用，應(yīng)于60將瓶內(nèi)冷

4、凝水烘干，滅菌后的容器應(yīng)在2周內(nèi)使用。,水樣的采集和保存方法 GB5750.2,1 水樣的采集方法 同一水源，同一時間采集幾類檢測指標(biāo)的水樣時，應(yīng)先采集供微生物學(xué)指標(biāo)檢測的水樣，采樣時應(yīng)直接采集，不得用水樣涮洗已滅菌的采樣瓶，并避免手指和其他物品對瓶口的污染。 在取自來水樣時，先用酒精燈將水龍頭燒灼消毒，然后把水龍頭完全打開，放水幾分鐘后，再取水樣。 采取含有余氯的水樣時，應(yīng)在水樣瓶未消毒前按每125ml水樣加入0.1mg硫代硫酸鈉除去殘余余氯。,取樣體積：0.5L,水樣的采集和保存方法,2 水樣保存 各種水質(zhì)的水樣，從采集到分析這段時間里，由于物理的、化學(xué)的、生物的作用會發(fā)生不同程度的變化，

5、這些變化使得進行分析時的樣品已不再是采樣時的樣品，為了使這種變化降低到最小的程度，必須在采樣時對樣品加以保護。 微生物：04避光保存，每125ml水樣加入0.1mg硫代硫酸鈉除去殘余余氯，保存時間4h。,水樣的采集和保存方法,水樣的采集和保存方法,2.3 水樣的過濾和離心 需要進行微生物檢測的樣品 不能進行過濾和離心,水樣的采集和保存方法,3 水樣的管理 3.1 水樣的標(biāo)簽設(shè)計 水樣采集后，往往根據(jù)不同的分析要求，分裝成數(shù)份，并分別加入保存劑。對每一份樣品都應(yīng)附一張完整的水樣標(biāo)簽。水樣標(biāo)簽的設(shè)計可以根據(jù)實際情況，一般包括:采樣目的，監(jiān)測點數(shù)目、位置，監(jiān)測日期，時間，采樣人員等。標(biāo)簽應(yīng)用不退色的

6、墨水填寫，并牢固地貼于盛裝水樣的容器外壁上。,水樣的采集和保存方法,3.2 水樣的運送 裝有水樣的容器必須加以妥善的保護和密封，并裝在包裝箱內(nèi)固定，以防在運輸途中破損，包括材料和運輸水樣的條件都應(yīng)嚴(yán)格要求。除了防震、避免日光照射和低溫運輸外，還要防止新的污染物進入容器和沾污瓶口使水樣變質(zhì)。 3.3 實驗室對水樣的接收 水樣送至實驗室時，首先要核對水樣，驗明標(biāo)簽，確切無誤時簽字驗收。 如果不能立即進行分析時，則應(yīng)盡快采取保存措施，并防止水樣被污染。,水樣中細菌學(xué)項目檢測方法 GB/T 5750.12,1 菌落總數(shù) 1 平皿計數(shù)法 2 總大腸菌群 1 多管發(fā)酵法 2 濾膜法 3 酶底物法 3 耐熱

7、大腸菌群 1 多管發(fā)酵法 2 濾膜法 4大腸埃希氏菌 1 多管發(fā)酵法 2 濾膜法 3 酶底物法,菌落總數(shù)的檢驗,方法：平皿計數(shù)法 范圍 此方法規(guī)定了生活飲用水及其水源水中細菌總數(shù)的測定方法 此方法適用于測定生活飲用水及其水源水中的細菌總數(shù),細菌總數(shù)的檢驗,檢驗步驟： 1 生活飲用水 1.1 以無菌操作方法用滅菌吸管吸取1ml充分混勻的水樣，注入滅菌平皿中，傾注約15ml已融化并冷卻到45左右的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，并立即旋搖平皿，使水樣與培養(yǎng)基充分混勻。每次檢驗對應(yīng)做一平行接種，同時另用一個平皿只傾注營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基作為空白對照。 1.2 待冷卻凝固后，旋轉(zhuǎn)平皿，使底面向上，置于37恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)48h

8、，進行菌落計數(shù)，即為水樣1ml中的細菌總數(shù)。,細菌總數(shù)的檢驗,2 水源水 2.1 以無菌操作方法用滅菌吸管吸取1ml充分混勻的水樣，注入盛有9ml滅菌水的試管中，混勻成1：10稀釋液。 2.2 吸取1：10稀釋液1ml注入盛有9ml滅菌水的試管中，混勻成1：100稀釋液。按同法依次稀釋成1：1000、1：10000稀釋液等備用。吸取不同濃度的稀釋液時必須更換吸管。 2.3 用滅菌吸管吸取23個適宜濃度的稀釋液1ml，分別注入滅菌平皿內(nèi)。以下操作同生活飲用水的檢驗步驟。,細菌總數(shù)的檢驗,不同稀釋度的選擇及報告方法,總大腸菌群的檢驗,方法：多管發(fā)酵法 總大腸菌群： 指一群在37培養(yǎng)24h能發(fā)酵乳糖

9、、產(chǎn)酸產(chǎn)氣、需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽胞桿菌。 該菌群主要來源于人畜糞便，具有指示菌的一般特征，故以此作為糞便污染指標(biāo)，評價飲水的衛(wèi)生質(zhì)量,總大腸菌群的檢驗,檢驗步驟 乳糖發(fā)酵試驗 1 檢驗生活飲用水時，取10mL水樣接種到10mL雙料乳糖蛋白胨培養(yǎng)液中，取1mL水樣，接種到10mL單料乳糖蛋白胨培養(yǎng)液中，另取1mL水樣注入到9mL滅菌生理鹽水中，混勻后吸取1mL(即0.1mL水樣)。注入到10mL單料乳糖蛋白胨培養(yǎng)液中，每一稀釋度共接種5管。 對已處理過的出廠自來水，需經(jīng)常檢驗或每天檢驗一次的，可直接種5份10mL雙料培養(yǎng)基，每份接種10mL水樣。,總大腸菌群的檢驗,檢驗步驟 乳糖發(fā)酵試

10、驗 2 檢驗水源水時，如污染較嚴(yán)重，應(yīng)加大稀釋度，可接種1，0.1，0.01mL甚至0.1，0.01，0.001mL，每個稀釋度接種5管，每個水樣接種15管，接種1mL以下水樣時，必須作10倍遞增稀釋后，取1mL接種。每遞增稀釋一次，換用1支1mL滅菌分度吸管。,總大腸菌群的檢驗,3 將接種管置361培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng)242h，如所有乳糖蛋白胨培養(yǎng)管都不產(chǎn)氣、產(chǎn)酸，則可報告為總大腸菌群陰性。如有產(chǎn)酸產(chǎn)氣者，則按下列步驟進行。 4 分離培養(yǎng) 將產(chǎn)酸、產(chǎn)氣的發(fā)酵管，分別轉(zhuǎn)種在伊紅美藍瓊脂平板上，于361培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng)1824h，觀察菌落形態(tài)，挑取符合下列特征的菌落： 深紫黑色，具有金屬光澤的菌落 紫黑

11、色，不帶或略帶金屬光澤的菌落 淡紫紅色，中心較深的菌落 做革蘭氏染色，鏡檢和證實試驗。,總大腸菌群的檢驗,證實試驗： 經(jīng)革蘭氏染色為陰性無芽孢桿菌，同時接種乳糖蛋白胨培養(yǎng)液，361培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h2h，有產(chǎn)酸產(chǎn)氣者，證實有總大腸菌群存在。 結(jié)果報告： 根據(jù)證實為總大腸菌群的管數(shù)，查MPN檢索表。,總大腸菌群的檢驗,方法：濾膜法 總大腸菌群濾膜法： 是指用孔徑為0.45m的微孔濾膜過濾水樣，將濾膜貼在添加乳糖的選擇性培養(yǎng)基上37培養(yǎng)24h，能形成特征菌落的需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽孢桿菌以檢測水中總大腸菌群的方法。,準(zhǔn)備工作： 1 濾膜滅菌：將濾膜放入燒杯中，加入蒸餾水，置于沸水浴中煮沸滅

12、菌3次，每次15min，前兩次煮沸后需更換水洗滌23次，以除去殘留溶劑。 2 濾器滅菌：用點燃的酒精棉球滅菌，也可用蒸汽滅菌，121，20min。,過濾水樣 用無菌鑷子夾取滅菌濾膜邊緣部分，將粗糙面向上，貼放在已滅菌的濾床上，固定好 濾器，將100mL水樣注入濾器中，打開濾器閥門，在 -5.07104Pa下抽濾,培養(yǎng) 水樣濾完后，再抽氣約5s，關(guān)上濾器閥門，取下濾器，用滅菌鑷子夾取濾膜邊緣部分，移放在品紅亞硫酸鈉培養(yǎng)基上，濾膜截留細菌面向上，濾膜應(yīng)與培養(yǎng)基完全貼緊，兩者間不得留有氣泡，然后將平皿倒置，放入37恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)24h2h,結(jié)果觀察與報告： 深紫黑色，具有金屬光澤的菌落 紫黑色，不帶或

13、略帶金屬光澤的菌落 淡紫紅色，中心較深的菌落 作革蘭氏染色，鏡檢。 經(jīng)革蘭氏染色為陰性無芽孢桿菌，再接種乳糖蛋白胨培養(yǎng)液，37培養(yǎng)24h，有產(chǎn)酸產(chǎn)氣者，則判定總大腸菌群陽性。,計算濾膜上生長的總大腸菌群數(shù)，報告每100mL水樣中的總大腸菌群數(shù)（CFU/100mL） 100,總大腸菌群菌落數(shù)（CFU/100mL）,數(shù)出的總大腸菌群菌落數(shù),過濾的水樣體積,方法：酶底物法 范圍 本法可在24h判斷水樣中是否含有總大腸菌群及含有的總大腸菌群的最可能數(shù)（MPN）。 本法可同時檢測大腸埃希氏菌。,總大腸菌群的檢驗,耐熱大腸菌群,耐熱大腸菌群 用提高培養(yǎng)溫度的方法將自然環(huán)境中的大腸菌群與糞便中的大腸菌群分開

14、，在44.5 仍然能生長的大腸菌群，稱為耐熱大腸菌群。,總大腸菌群乳糖發(fā)酵試驗陽性管 EC培養(yǎng)基，44.5培養(yǎng)24h 不產(chǎn)氣 陰性 產(chǎn)氣 轉(zhuǎn)接EMB平板，44.5 培養(yǎng)1824h 典型菌落，陽性 未經(jīng)氯化消毒的水，且僅檢耐熱大腸菌群，或水源水： 水樣 接種乳糖蛋白胨培養(yǎng)液，44.5 培養(yǎng)24h 不產(chǎn)氣 陰性 產(chǎn)氣 EC培養(yǎng)基，44.5培養(yǎng)24h，判斷方法同上面步驟 幻燈片 35,耐熱大腸菌群濾膜法： 是指用孔徑為0.45m的微孔濾膜過濾水樣，細菌被阻留在膜上，將濾膜貼在添加乳糖的選擇性培養(yǎng)基上，44.5培養(yǎng)24h，能形成特征菌落以此來檢測水中耐熱大腸菌群的方法,檢驗步驟： 準(zhǔn)備工作：同總大腸菌

15、群 過濾水樣：同總大腸菌群 培養(yǎng) 用滅菌鑷子移取濾膜于MFC培養(yǎng)基上，放入44.5恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)24h2h。耐熱大腸菌群在此培養(yǎng)基上菌落為藍色，非耐熱大腸菌群菌落為灰色至奶油色。 對可疑菌落轉(zhuǎn)種EC培養(yǎng)基， 44.5培養(yǎng)24h2h，如產(chǎn)氣則證實為耐熱大腸菌群。,計算被證實的耐熱大腸菌群數(shù)，報告每100mL水樣中的耐熱大腸菌群數(shù)（CFU/100mL） 100,耐熱大腸菌群菌落數(shù)（CFU/100mL）,所計的總大腸菌群菌落數(shù),過濾的水樣體積,大腸埃希氏菌 大腸埃希氏菌多管發(fā)酵法是指多管發(fā)酵法總大腸菌群陽性，在含有熒光底物的培養(yǎng)基上44.5培養(yǎng)24h產(chǎn)生-葡萄糖醛酸酶，分解熒光底物釋放出熒光產(chǎn)物，使培養(yǎng)基在紫外光下產(chǎn)生特征性熒光的細菌，以此來檢測水中大腸埃希氏菌的方法。,檢驗步驟： 總大腸菌群乳糖發(fā)酵試驗陽性管 ECMUG管中，44.5培養(yǎng)24h 366nm波長6W的紫外燈照射 產(chǎn)生藍色熒光 陽性 計算EC-MUG的管數(shù)，查