1、植物快速繁殖技術植物快速繁殖就是應用組織培養(yǎng)技術，快速繁殖名優(yōu)特新品種，使其在較短時間內繁衍較多的植株；快速繁衍珍稀瀕危植物，使物種得以保存?？焖俜敝呈钱斍爸参锛毎こ讨袘米顝V泛，又最有效的方法之一。除了一部分豆類作物外，種子是不會傳遞病毒的。植物病毒是通過無性繁殖傳遞的，而快速繁殖是建立在無性繁殖的基礎上，病毒在母體內逐代積累，危害越來越嚴重。目前在生產上尚無特效藥物可徹底除去病毒，而快速繁殖卻可以，因此，快速繁殖脫毒顯得非常重要。一、植物快速繁殖的途徑和方法 以植物的根、莖、葉柄和花等片段以及孢子作為外植體，或者切取莖尖、腋芽進行離體培養(yǎng)，可以直接誘導器官分化，產生芽、根，也可以誘導改變

2、原有的分化狀態(tài)，脫分化形成愈傷組織，再經過不同的細胞分化途徑重建形成不同的器官，直到完整植株。(P86 L.1L.16) 植物快速繁殖的類型與方式可歸納如下表： 類型方 式特 點事 例器官型腋芽萌發(fā)，以芽增殖芽，擴大繁殖系數繁殖系數高，一轉性較穩(wěn)定，是快速繁殖的主要方式甘蔗、香蕉、香石竹、絲石竹等器官發(fā)生型通過脫分化形成愈傷組織，再分化出苗可獲得與母株相同的小植株，繁殖系數較低，可用于細胞分化的研究煙草、油菜等胚狀體發(fā)生型從愈傷組織或直接從子葉、下胚軸和花藥培養(yǎng)中產生首先證明植物細胞的全能性，繁殖系數高甘蔗、胡蘿卜、石刁柏等原球莖型由莖尖或腋芽產生原球莖放入培養(yǎng)基中發(fā)育成小植株遺傳性較穩(wěn)定，原

3、球莖可作為繁殖系母體蘭花球莖芽型葉柄表面產生圓球形小突起球莖芽，一端出芽一端出根遺傳性較穩(wěn)定，球莖芽可直接放入土中種植觀葉海棠塊莖型葉片或葉柄上形成粒狀芋塊，進一步分化出芽和根塊莖芽可為繁殖系母體，不斷切割繁殖移栽，成活率高花葉芋鱗莖型鱗片近軸面或邊緣直接形成帶根的小鱗莖在試管內形成小鱗莖需較長時間百合、郁金香、貝母等孢子型用成熟或未成熟的孢子進行培養(yǎng)孢子繁殖最困難的是表面消毒，萌發(fā)時間較長地錢、狼尾蕨等根莖型蕨類具有橫向的莖及直立的短根莖，為組織培養(yǎng)的最佳外植體根狀莖上產生蕨葉及根，繁殖速度較孢子型快腎蕨、裂葉腎蕨、波士頓蕨等微枝扦插型帶芽的小插條在試管內進行無菌扦插為木本植物進行快速繁殖的

4、主要方式葡萄、楊樹快速繁殖中莖尖培養(yǎng)脫毒 無病毒苗的獲得：（一）材料的培養(yǎng)和滅菌 為了獲得無菌的莖尖，應把供試植株種在無菌的盆土中，放在溫室栽培。澆水要澆在土中，不要澆在葉片上。如材料取自田間，可切取插條，在實驗室內進行溶液培養(yǎng)。由這些插條的腋芽長成的枝條，其污染程度比直接從田間植株取來的枝條少得多。自外，定期噴施內吸殺菌劑（如0.1%多菌靈和0.1%鏈霉素）也十分有效。（二）莖類剝離 取幼苗莖尖23cm小段，剝去可見的大葉，放在燒杯內用自來水沖洗1h左右，移入無菌室進行嚴格消毒。先用95%酒精快速浸泡一下，再放入5%的漂白粉溶液內消毒710min（也可用市場上出售的次氯酸鈉溶液稀釋為5%），

5、然后用無菌水沖洗34次，在雙筒解剖鏡下一手用細鑷子將莖芽按住，另一手用解剖針仔細地將幼葉剝去，最后露出圓滑的生長點，用注的針頭側刃或自制的解剖針，仔細地切取帶有12個葉原基的生長點，隨即接種到試管培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)。這樣外植體（生長錐帶12個原葉基）的培養(yǎng)，嚴格來說，應稱為分生組織培養(yǎng)。 以上操作必須嚴格在無菌條件下的超凈工作臺中進行，所用器具都應浸泡于70%的酒精中，使用前要在究竟燈上燒灼滅菌，注意不使解剖針、刀太燙，以免損傷組織。解剖鏡臺應墊載玻片，每剝離一個莖尖應以酒精棉團擦拭，手也應經常用70%酒精擦試。莖尖很幼嫩，暴露時間越短約好。因為超凈臺的氣流和酒精燈發(fā)出的熱都會使莖尖迅速變干。（

6、三）莖尖培養(yǎng) 目前常使用的的基本培養(yǎng)基是MS培養(yǎng)基或White培養(yǎng)基，它有較高濃度的無機鹽，對促進組織分化和愈傷組織生長是有利的。在培養(yǎng)基中可酌情添加5%10%椰乳，0.11.0mg/L的吲哚乙酸、萘乙酸、芐基腺嘌呤等，有的還需添加活性炭。根據培養(yǎng)種類不同，添加的生長調節(jié)劑可適當調整。（P92P93 L.11） 莖尖培養(yǎng)的生長可能有4種類型： 組織不增大，不久變褐死亡，這可能是生長點受傷所致。 組織漸變綠，但體積增大緩慢，可把組織轉到NAA濃度高于0.05mg/L的培養(yǎng)基上，并提高溫度以加速其生長。 組織基部不產生或少量產生愈傷組織，而生長點發(fā)育正常，一個月內可形成無根的小植株，這是最理想的情

7、況。當長有23片西歐啊葉時，應把小植株轉到無生長素的培養(yǎng)基上，促進生根。 莖尖基部產生大量愈傷組織而生長點很少伸長，不理想。這時應把這些愈傷組織轉移到無生長素的培養(yǎng)基上，并降低培養(yǎng)溫度，以抑制愈傷組織生長促進其分化。（P94P95 L.2）（四）提高脫毒效果 感染了病毒的蜘蛛在切取莖尖進行培養(yǎng)之前，進行高溫處理、低溫處理或化學處理，可以提高脫毒效果。1. 高溫處理又稱溫熱療法。某些病毒受熱以后不穩(wěn)定，失去活性。根據這個原理，把植物放在高于正常溫度的環(huán)境中，組織內部的病毒受熱后部分或全部鈍化，但寄主植物的組織很少或不會受到傷害。 高溫處理有兩種方法：（1）湯浸漬處理，適用于切下的材料，在50C左

8、右的溫水中浸漬數分鐘至數小時，方法簡便易行但易致材料受傷。 （2）熱風處理，將生長的盆栽植物移入室內或生長箱內，處理溫度和時間因植物種類和器官生理狀況而異。一般為3540C，短則幾十分鐘，長可達數月。（P95 L.3L.15） 每一種植物高溫處理有他的臨界溫度，超出這個溫度或溫度雖在此范圍內但處理時間過長，組織就受傷?？梢圆捎米儨胤椒?，即每天40C處理4 h，1620C處理20 h，這樣，既可保持芽眼的活力，亦可清除芽眼中幼葉的病毒。2. 低溫處理，亦稱冷療法。菊花植株在5C條件下分別處理4個月或7.5個月，沒有菊花矮化病毒（CSV）的無病毒苗分別是67%和73%，而沒有菊花褪綠斑駁病毒（CC

9、MV）的無病毒苗分別是22%和49%，未經處理的莖尖則無脫毒效果。3. 化學處理，又稱化學療法。一些化學藥品如嘌呤和嘧啶；類似物、氨基酸、抗生素處理，可在某種程度上抑制植物體內或離體葉片內病毒的合成，但仍不能是病毒失活。近年發(fā)現(xiàn)三氮唑核苷（1D呋喃核糖1，2，4三氮唑）用于防治一系列動物DNA和RNA病毒，對植物也有效。將感染了馬鈴薯Y型病毒（PVY）、黃瓜花葉?。–MV)或煙草花葉病毒（TMV）的葉柄，培養(yǎng)在三氮唑核苷的MS培養(yǎng)基上，子代植株則除去病毒，而對照則無效，說明三氮唑核苷抑制病毒的增殖。其他途徑脫毒 （一）愈傷組織脫毒 感染病毒的愈傷組織細胞并非全部都含有病毒。例如已經感染TMV的

10、煙草愈傷組織，經機械分離后，發(fā)現(xiàn)僅有40%細胞含有病毒。用感染TMV的煙草髓部愈傷組織誘導出的愈傷組織，繼代四次后用熒光抗體法檢驗，幾乎不存在病毒。從馬鈴薯莖尖培養(yǎng)產生植株概率。許多試驗也報道，從有病毒的草莓、唐菖蒲、老鸛草、大蒜、火蔥、款冬等的愈傷組織中，都分化出無病毒的植株。以上事實，可能因為細胞增殖速度快過病毒復制速度，或者細胞產生變異，獲得對病毒感染的抗性，最終表現(xiàn)出脫毒現(xiàn)象。 （二）珠心胚培養(yǎng)脫毒 柑橘類多胚品種中除了一個受精胚以外，尚有多個由珠心細胞形成的無性胚，稱為珠心胚。珠心胚與維管束系統(tǒng)無聯(lián)系，因此由珠心胚產生的植株全部均無病毒。但珠心胚 大多是不育的，必須分離培養(yǎng)才能發(fā)育成

11、正常的幼苗。珠心胚培養(yǎng)技術對除去柑橘主要病毒，如引起銀屑病、葉脈突出病、柑橘裂皮病、柑橘速衰病等的病毒，都十分有效。 （三）莖尖微體嫁接脫毒 木本植物莖尖培養(yǎng)難以生根形成植株。為了克服這個困難、可將實生苗砧木培育在培養(yǎng)基上，再從成年無病毒樹枝上切取莖尖（0.141.0mm），在砧木切斷面上進行試管微體嫁接，就可獲得無病毒的幼苗。利用這個方法，柑橘類嫁接成活率為30%50%，移栽成活率約95%，嫁接兩年后即可結實。應用這個技術，可獲得柑橘類沒有銀屑病植株、桃樹沒有洋李環(huán)斑病毒、洋李矮縮病毒、褪綠葉斑病毒的無病毒苗。 （四）培育抗病毒栽培種 上述各法可以脫毒，但最有效的方法還是培育抗病毒的栽培種，

12、可以一勞永逸。可采用導入抗病毒的原生質體融合技術，得到抗病毒的雜交種。例如煙草和黃花煙草（N.rustica）原生質體融合，得到的細胞雜交種，對TMV有抗性；馬鈴薯栽培種與野生種（S.chanocoense）有性雜交產生的后代，可抗PVY的感染。脫毒苗的鑒定 利用生長點培養(yǎng)無毒苗的成苗率和脫毒率都非常低，有時無毒株只占千分之幾。因此，每一莖尖分化產生的植株，在作為母本生產無病毒原種以前，必須進行特定病毒鑒定。由于在培養(yǎng)的植株中許多病毒具有延遲的恢復期，所以在最初18個月中每隔一定時間仍需進行鑒定。只有對待病毒顯示持續(xù)陰性反應的無病毒植株，才能進一步擴大繁殖。無病毒植株容易再被感染，因此在繁殖的

13、不同時期仍需重復進行鑒定。常用的鑒定法有直接測定法、指示植物法、抗血清鑒定法和電子顯微鏡檢查法等。 （一）直接測定法 直接觀測植株莖葉有無某種病毒引起的可見癥狀。下表是馬鈴薯幾種主要病毒的病狀，供參考。然而寄主植株感染病毒后需要較長的時間才出現(xiàn)癥狀，有的并不能使寄主植物出現(xiàn)可見的癥狀，因此需要更敏感的測定方法。 幾種馬鈴薯病毒種類的癥狀 種 類癥 狀鑒定寄主馬鈴薯X病毒，PVX脈間花葉千紅日、曼陀羅、辣椒、番茄、心葉煙馬鈴薯S病毒，PVS葉脈深陷粗縮莧色藜、千日紅、光曼陀羅、昆諾阿藜（Chenopodium quinoa）馬鈴薯Y病毒，PVY隨品種而異，有些輕微花葉或粗縮，敏感品種反應為壞死野

14、生馬鈴薯、洋酸菜、曼陀羅馬鈴薯卷葉病毒，PLRV初浸染幼葉尖呈淺黃白色，有些品種呈紫色或紅色洋酸菜 （二）指示植物法 利用病毒在其植株上出現(xiàn)癥狀的特征，作為鑒別種類的標準。這種專用以產生癥狀的寄主即為指示植物，又稱鑒別寄主。指示植物分為兩種類型：一種早接種后產生的癥狀可擴張到非接種部位；另一種只在接種部位產生病斑。接種時取待測植物的幼葉，加少量水及等量0.1mol/L磷酸緩沖液（pH值7.0），磨成勻漿，吸取少量漿液揩抹在事先涂有500600目金剛砂（有利于破損葉片表面細胞）部分，輕輕摩擦務使?jié){液能侵入葉片表皮細胞但又不損傷葉片。5分鐘后用水沖洗葉面。將被接種的指示植物置于有防蚜蟲網罩的溫室內

15、，1525，如接種植物的漿液含有病毒，數天至幾周后，指示植物即出現(xiàn)可見的癥狀。較常用的指示植物有莧色藜（Chenopodium amaranticolor）、昆諾阿藜(C.quinoa)、千日紅(Gomphrena globosa)和各種煙草等。 （三）抗血清鑒定法 植物病毒是由核酸和蛋白質組成的核蛋白復合體，因而也是一種抗原，注射到動物體內即產生抗體，抗體存在于血清之中，稱為抗血清。由于不同病毒產生的抗血清都有特異性，用特定病毒的抗血清來鑒定該種病毒，具有高度專一性和特異性，幾分鐘至幾小時即可完成，方法簡便，所以成為植物病毒鑒定中最有用的方法之一。抗血清鑒定首先要進行抗原的制備，只有獲得高純度的抗原，才有可能獲得高度純凈的抗血清。抗血清的鑒定法主要根據沉淀反映原理，具體測定有試管沉淀、凝聚試驗、免疫擴散、免疫電泳、熒光抗體技術和酶聯(lián)免疫吸附試驗等多種方法。 （四）酶聯(lián)免疫吸附法 這是用酶標記抗原或抗體的微量測定方法。將抗體固定在支持物上，加入待檢植物組織提取液，然后加入酶（過氧化物酶或堿性磷酸酶）標記的抗體，再加入底物經酶催化，吸收波長發(fā)生變化，因而可用分光光度計鑒定。此法靈敏度極高，檢測大量樣本時特別實用。 （五）電子顯微鏡檢查法 此法可直接觀察到病毒微粒是否存在，病