1、基金申請技巧講座第四軍醫(yī)大學科學研究部小慶寬，1，1部分申請表格填寫方法，2，1，摘要(400字):研究方法，內(nèi)容，目標，科學意義。例如：采取方法，進行研究，闡明機制，闡明規(guī)律，提供奠基的想法。角色：和龍點睛效果：引起平議專家的興趣，到底引起了好奇心?！八烤故窃趺醋龅降?？”，3，利用改進的減影雜交技術(shù)構(gòu)建老年性白內(nèi)障晶狀體上皮細胞差異表達的基因庫，用牙齒芯片篩選白內(nèi)障相關(guān)基因。通過用基因觀察軀干和培養(yǎng)的晶狀體上皮細胞，觀察細胞的形態(tài)、增殖和凋亡、骨架蛋白及晶狀體蛋白的變化，研究基因的功能。從晶狀體上皮細胞的角度闡述老年性白內(nèi)障發(fā)生的分子生物學機制，為預防白內(nèi)障提供了新的思路和理論依據(jù)。4，2

2、，立論基礎(chǔ)研究，國際科學發(fā)展趨勢相結(jié)合，科學意義對應(yīng)用基礎(chǔ)研究，科系前沿相結(jié)合，以國民經(jīng)濟和社會發(fā)展的重要科學技術(shù)問題為中心，應(yīng)用前景，5， 以信號轉(zhuǎn)導等特定科學問題(本項目研究目標)為中心進行歸納分析，提出研究構(gòu)想，從研究領(lǐng)域開始，8、老年白內(nèi)障是與年齡相關(guān)的疾病，隨著年齡的增長，發(fā)病率也在提高。特別是隨著人類老齡化的趨勢，白內(nèi)障的患者人數(shù)將繼續(xù)增加。目前，它已經(jīng)是人類第一種失明疾病。到目前為止，治療白內(nèi)障的唯一有效方法是通過手術(shù)切除混濁的晶狀體，移植人工晶狀體。手術(shù)后患者可以恢復良好的視力，但不可避免的術(shù)后并發(fā)癥、手術(shù)設(shè)備、材料費用很高。治療白內(nèi)障的資金已經(jīng)成為世界各國包括富裕發(fā)達國家在內(nèi)

3、的嚴重醫(yī)療負擔。最近的調(diào)查顯示，如果將老年白內(nèi)障的發(fā)病時間推遲10年，白內(nèi)障手術(shù)數(shù)將減少45%。因此，一些學者認為，通過預防或減緩白內(nèi)障發(fā)生的途徑征服白內(nèi)障成為全球社會和社會經(jīng)濟問題2。9，但目前我們對老年白內(nèi)障發(fā)病機制的認識還不清楚。多年來，許多學者的研究發(fā)現(xiàn)晶狀體上皮細胞在老年性白內(nèi)障發(fā)生中起著重要作用，但對其中更多的基因調(diào)控知之甚少。從老年性白內(nèi)障晶體上皮細胞變化相關(guān)的基因開始，研究基因的生物學功能，可以抓住引起白內(nèi)障發(fā)生和發(fā)展的主要部分。因此，本研究利用改良的減毒雜交技術(shù)和基因籌碼技術(shù)，利用準確、全面、快速的特點，以晶體上皮細胞為研究對象，一次篩選出所有老年性白內(nèi)障差異表現(xiàn)的基因，篩選

4、出與白內(nèi)障相關(guān)的基因，重點研究其功能，在基因?qū)用娼沂景變?nèi)障的發(fā)病機制，為預防白內(nèi)障提供了新的思路和理論依據(jù)。10，2，國內(nèi)外現(xiàn)狀分析(與綜合的差異)問題：A，低水平重復：不了解最新進展，缺乏對國內(nèi)外現(xiàn)狀的真正了解，提出的問題已經(jīng)被別人解決了。b，文獻復習不足：文獻檢索方法不合適，選擇關(guān)鍵詞不合適，甚至人為地縮小了搜索范圍。c，摘要表達不足：對國內(nèi)外現(xiàn)狀的歸納分析不足，只是單純的羅列，缺乏邏輯和目標。d，對方法原理的理解不足：不熟悉研究方法，進行簡單移植或夸張，缺乏實際應(yīng)用的可行性。11，寫作方法：要緊緊圍繞這次申請項目的主題。a，在領(lǐng)域切入，簡要論述國內(nèi)外研究成果，提出當前熱點研究方向。b，從

5、研究方向展開，對國內(nèi)外研究進展進行更詳細的分析，闡述了該方向存在的問題。c、圍繞現(xiàn)有問題，結(jié)合國內(nèi)外科舉研究結(jié)果、當前現(xiàn)狀及今后的發(fā)展趨勢，詳細論述和分析了這些問題的原因，并提出了牙齒方面的空白、未知數(shù)、研究的難點、重點，為確立自己申請項目的研究目標提供了充分的論據(jù)。12、D，介紹和分析要采用的技術(shù)方法。成熟的方法重點介紹了適用于本研究的理論基礎(chǔ)和實驗依據(jù)。新方法在詳細介紹其原理的基礎(chǔ)上，闡述了適用于本研究的理論依據(jù)和實驗依據(jù)。需要特別注意的問題：對于使用的技術(shù)方法的原理、過程，尤其是實際操作中可能出現(xiàn)的問題，必須非常明確，并應(yīng)渡邊杏成為簡單的移植。例如：抗體功能基團在理論上可以實現(xiàn)融合，但存

6、在“活性，表達載體選擇，純化等問題。e、提出牙齒項目的研究思路。、13、要預防白內(nèi)障，必須針對發(fā)病的主要部分。多年來，國內(nèi)外學者徐璐從不同角度探討白內(nèi)障的發(fā)生機理。對致病環(huán)境因素來說，氧化因子、紫外線輻射、晶狀體周圍環(huán)境中離子濃度的變化和部分生長因子、細胞因子的變化都與老年性白內(nèi)障的發(fā)生有關(guān)。以研究部位為例，晶狀體中皮質(zhì)和核的蛋白質(zhì)變化及晶狀體纖維的變化與白內(nèi)障的形成有關(guān)，晶狀體前囊膜下單層的晶狀體上皮細胞在白內(nèi)障的形成方面更加引人注目。14、晶狀體上皮細胞是晶狀體中唯一具有分裂活性、相對穩(wěn)定的細胞，因此，對分裂、分化晶狀體纖維細胞、產(chǎn)生晶體蛋白、終身不停止、晶狀體形成均勻?qū)ΨQ的結(jié)構(gòu)，維持晶狀

7、體透明度具有重要作用。不僅如此，在晶狀體上皮細胞或晶狀體中，受外來刺激影響的早期部位，老年性白內(nèi)障的晶狀體上皮細胞也有退行性變化，細胞膜通透性增加，細胞內(nèi)酶活性變化，細胞數(shù)減少，細胞凋亡細胞增加等與單純老化晶狀體的差異3-5。15，體外實驗也證實了多種茄子因素(H2O2，UV-B，晶狀體蛋白自身抗體)導致的白內(nèi)障模型的晶狀體上皮損傷是晶狀體混濁的主要環(huán)6-8。因此，從晶狀體上皮細胞的變化開始，探討白內(nèi)障的原因，就可以捕捉到揭示白內(nèi)障發(fā)病機制的主要部分。晶狀體上皮細胞變化的基因調(diào)控機制是問題的關(guān)鍵，也是我們需要深入研究的問題。16，白內(nèi)障的形成與晶狀體的老化有著不可分割的關(guān)系，是晶狀體老化的極端

8、表現(xiàn)。晶狀體的老化是各種因素相互作用的結(jié)果，包括基因和非電子隨機變化的積累和組織特異性的各種基因表達變化，而不是程序性和隨機性。目前國內(nèi)外對白內(nèi)障相關(guān)基因的研究主要是，17，一是對體外培養(yǎng)的晶狀體白內(nèi)障模型和上皮細胞的研究。UV-B輻射誘導的白內(nèi)障中晶狀體上皮細胞是主要靶細胞，其Na-K-ATP酶活性增加，蛋白質(zhì)的合成和分泌增加。上皮細胞凋亡包括c-fos基因的表達增加。也有粗蛋白H4，H3的低表達和蛋白質(zhì)C，-肌動蛋白，-肌動蛋白基因的高表達9-12。Carper等13利用反轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄-聚合反應(yīng)差異顯示(RT-PCR-DD)技術(shù)研究H2O2柔道晶體上皮細胞的基因差異表達結(jié)果，結(jié)果為NADH谷氨酰

9、胺轉(zhuǎn)氨酶基因表現(xiàn)減少，細胞因子的核蛋白、替代拼接因子2 (alternative splicing factor)、-三羥異丁基?；o酶A水解酶基因表達增加。18，第二個是利用轉(zhuǎn)基因動物進行的研究。波形纖維蛋白基因(vimentin)、雜交中纖維蛋白基因的轉(zhuǎn)基因小鼠表現(xiàn)出白內(nèi)障，隨著老鼠的年齡，白內(nèi)障有增加的趨勢。晶狀體變化的共同特征是晶狀體纖維細胞分化抑制14，15。Gong等16報告，晶狀體的細胞膜蛋白連接蛋白3(3 Connexin)基因敲除大鼠(knockout mouse)在晶狀體形成初期及纖維細胞分化初期沒有受到影響，隨后發(fā)生了與晶狀體蛋白溶解相關(guān)的核性白內(nèi)障。體外實驗和白內(nèi)障轉(zhuǎn)基

10、因小鼠都提示我們一些基因的變化與白內(nèi)障有關(guān)，但這種變化的基因是否與老年白內(nèi)障的形成有關(guān)，還沒有進一步的報告。19、3是老年性白內(nèi)障晶體上皮的研究。Lee17通過RT-PCR技術(shù)研究，發(fā)現(xiàn)前極性白內(nèi)障和核白內(nèi)障上皮細胞中纖維連接蛋白、I型膠原蛋白、-平滑肌蛋白、TGF-1、TGF-2、TGF-型受體、結(jié)締組織生長因子的基因表達存在差異。Kantorow等18利用RT-PCR-DD研究了老年性白內(nèi)障和正常晶狀體上皮的基因差異性表達，老年性白內(nèi)障有3個高表達基因和12個低表達基因。但是，對于DD-PCR技術(shù)，在實驗中很難解決假陰性、假陽性和全長cDNA復制問題。20，牙齒三方面的研究都取得了不同程度

11、的研究結(jié)果，但由于當時技術(shù)條件的限制，未能全面闡明與白內(nèi)障相關(guān)的基因及其功能。尋找白內(nèi)障時，晶狀體上皮細胞和正常晶狀體上皮細胞之間差異表達的基因可以揭示白內(nèi)障的發(fā)病機制。21，尋找差異表達基因的經(jīng)典方法是減少消減雜交(sh)。但是實驗工作很復雜。改進的抑制性減少交配(Suppression Subtractive Hybridization，SSH是Diatchenko等1996年建立的方法)簡化了實驗操作，但仍然存在很多問題。我們學校生物化學研究室建立了改良還原雜交技術(shù)19，20，其特點是，目的細胞很容易獲得特異表達的全長基因，低豐度基因也能有效地分離。22、牙齒方法的創(chuàng)始人利用牙齒技術(shù)，從

12、刺激脂肪多糖前后英寸細胞差異表達的基因復制到刺激脂肪多糖后特殊表達的基因。其中5個是新的基因。同樣，使用牙齒方法，可以快速有效地獲得白內(nèi)障晶狀體上皮細胞和正常晶狀體上皮細胞之間差異表達的基因，并復制到全長cDNA，為進一步的結(jié)構(gòu)和功能研究奠定基礎(chǔ)。23，基因籌碼技術(shù)的出現(xiàn)，檢測差異表達基因和未知DNA分子更快、更準確、更高效?；蛐酒窃?996年提出并開始開發(fā)的。牙齒技術(shù)將數(shù)千個DNA探針集中在1厘米正方形的基板上，利用堿基互補原理。DNA探針的已知堿基序列和測量的未知DNA分子雜交后，由標記分子標記雜交體，通過自動讀取裝置分析雜交結(jié)果，通過對基因檢測的定性、定量、結(jié)構(gòu)分析確定未知DNA分子

13、。24，是尚未對白內(nèi)障進行研究的現(xiàn)成基因芯片，根據(jù)本研究的需要，我們選擇的所有差異表達的基因都可以建立cDNA文庫，利用基因籌碼技術(shù)制作基因芯片，進一步篩選白內(nèi)障晶體上皮細胞和正常晶狀體上皮細胞之間差異表達的基因。其中可能有已知的基因。通過牙齒兩種技術(shù)的有機結(jié)合，我們可以更快、更有效、更準確地獲得白內(nèi)障相關(guān)基因。25，概括地說，分子生物學技術(shù)的發(fā)展為研究白內(nèi)障發(fā)生過程中的功能基因和特異性調(diào)節(jié)基因提供了有利的武器。本項目從晶狀體上皮細胞開始，利用改良的減影雜交技術(shù)和基因籌碼技術(shù)系統(tǒng)，研究了與白內(nèi)障相關(guān)的基因，并采用體外培養(yǎng)細胞和體晶狀體上皮細胞的基因傳播，探討了晶狀體上皮細胞的變化及其在白內(nèi)障形

14、成中的作用。希望通過揭示白內(nèi)障晶體上皮細胞變化的分子生物學機制，為預防白內(nèi)障提供新的思考和理論依據(jù)。26，3，工具書A，文獻類別全部：以英語文獻為主，同時應(yīng)引用中文文獻-國內(nèi)同行的著名專家的文獻。b，引文信息：文章標題、作者姓名、具體來源，包括期刊名稱、年份、發(fā)行、頁碼等。c，文獻年代要新：主要是近5年的文獻，最好有07年的最新文獻。27，3，研究方案，1，研究目標編寫要求：限定目標，與研究內(nèi)容相對應(yīng)。例如，明確的關(guān)系，公開紀律，原則(機制)，建立方法等，例如與老年性白內(nèi)障相關(guān)的基因篩選，28，2，研究內(nèi)容：問題：內(nèi)容太多，一個研究周期難以完成內(nèi)容分配，不能集中說明研究目標編寫要求。內(nèi)容必須適

15、當保證在研究周期內(nèi)完善目標服務(wù)和目標。要重點說明注意事項和技術(shù)路線的差異。29，如：(1)準備差異表達基因的基因芯片，利用基因籌碼技術(shù)從多個標本的老年性白內(nèi)障晶體上皮細胞中篩選出白內(nèi)障相關(guān)基因。30，(2)研究白內(nèi)障相關(guān)基因的結(jié)構(gòu)。(3)研究白內(nèi)障相關(guān)基因在晶狀體上皮細胞改變中的作用。觀察指標如下。存活細胞數(shù)；光學顯微鏡、透射電子顯微鏡下細胞形態(tài)的變化；細胞凋亡檢測：用原位末端標記和連接酶誘導PCR方法，在形態(tài)和DNA水平分析細胞凋亡。細胞增殖檢測：細胞骨架蛋白檢測：晶狀體蛋白檢測：31，3，需要解決的重要問題：問題：無法抓住重要問題或抓不到正確。重要的問題是什么？在研究過程中，對達到預期目標有重要影響的一些研究內(nèi)容或因素。-為實現(xiàn)所需目標必須掌握的核心技術(shù)或研究手段。提出要求：確定主要問題并提出解決方案。32、例：(1)構(gòu)建差異表達的cDNA庫：構(gòu)建差異cDNA庫是篩選老年性白內(nèi)障相關(guān)基因的前提。為了代表差異cDNA文庫，選擇了多種類型老年性白內(nèi)障晶狀體的前囊膜，并取了足夠數(shù)量的標本(50例標本)作為mRNA的來源。利用改