1、第四節(jié) 離子交換色譜 (ion-exchange column chromatography，IEC),離子交換色譜原理 離子交換色譜基本構(gòu)成要素 影響離子交換的主要原因 離子交換色譜的操作技術(shù) 離子交換色譜的應(yīng)用,一、原理 離子交換色譜法是以離子交換樹脂作為固定 相，用水或水溶性溶劑作為流動(dòng)相。在流動(dòng) 相中的離子型成份與樹脂上的同電荷離子進(jìn) 行交換而被吸附，再用帶有同種電荷的溶劑 進(jìn)行洗脫，來分離離子型化合物的一種色譜 方法。,分離機(jī)理是利用樣品組分的選擇性系數(shù)不同而進(jìn) 行分離。 R-A+B+ R-B+A+ 當(dāng)平衡時(shí)： K= 若K1，說明樹脂對B比A有更大的親和力,B+樹脂A+,A+樹脂B+

2、,離子交換色譜,若以R代表離子交換樹脂的母體，則其色譜分離的基本原理可表示為： 陽離子交換樹脂 RSO3-H+Na+Cl- RSO3-Na+H+ + Cl- 陰離子交換樹脂 RN+OH-Na+Cl- RN+Cl-Na+ + OH- 要求離子交換可逆，樹脂可再生。,二、構(gòu)成要素,（一）固定相 固定相是離子交換劑，分離子交換樹脂和硅 膠化學(xué)鍵合離子交換劑兩類。 離子交換樹脂簡介：立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的高分子 多元酸或多元堿的聚合物。 離子交換樹脂的分子結(jié)構(gòu)中，由兩大部分構(gòu) 成：穩(wěn)定的網(wǎng)架及網(wǎng)架上的交換基。,1、分類： 根據(jù)交換基結(jié)合離子的性能不同將離子交換樹脂分為兩類： 陽離子交換樹脂 陰離子交換樹脂,商

3、品樹脂的類型：鈉鹽（陽離子型）和氯型（陰離子型），而交換時(shí)用的是氫型和氫氧型。 陽離子交換樹脂：強(qiáng)酸型SO3 弱酸型COOH、PO3H2 陰離子交換樹脂：強(qiáng)堿型,2、組成 離子交換樹脂由樹脂母體和交換基團(tuán)構(gòu)成。常見的是聚苯乙烯樹脂作為母體。,CH2CH2CHCH2CH2CH,SO3,CH CH2CH2CH,苯環(huán)SO3,有氫型和鈉型,H+或Na+,H+或Na+,3、離子交換層析的原理：交換基上的活性離子（H+或OH-）在水溶液中與其它陰、陽離子的可逆交換來達(dá)到逐步分離的目的。,當(dāng)兩種（或兩種以上）不同的可交換物質(zhì)離子通過離子交換樹脂柱時(shí)， 各不同成分的親和力不同，在柱上的交換速度也不同，被洗脫的

4、時(shí)間也就不同，從而達(dá)到分離目的。,4、 離子交換樹脂的性能： 交聯(lián)度：離子交換樹脂中所含的交聯(lián)劑的 百分含量。 例如：上海樹脂廠生產(chǎn)的聚苯乙烯強(qiáng)酸型 陽離子交換樹脂，從其產(chǎn)品牌號：732（強(qiáng)酸 17）可以得知，交聯(lián)度為7%（17）。 交聯(lián)度越大，網(wǎng)眼越小、網(wǎng)隙越小，交換 的離子越小。,交換容量：單位質(zhì)量的離子交換樹脂中所含交換基團(tuán)的毫摩爾數(shù)。單位為mmol/g。 交換容量是用來表示離子交換樹脂進(jìn)行交換離子的能力大小的，其數(shù)值大小決定于以樹脂表面及網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)內(nèi)部所含的交換基的多少。 溶脹性：指樹脂吸收水分后，浸潤膨脹能力的大小,離子交換色譜,（二）流動(dòng)相： 多是具一定pH和離子強(qiáng)度的緩沖溶液， 如

5、磷酸鹽緩沖液。有時(shí)加入少量的有機(jī)溶 劑提高選擇性，如甲酸、乙酸、堿等做成 的緩沖液。 （三）被分離成分： 必須能被分離成離子成分。即具有一 定的離子強(qiáng)度。,三、影響離子交換的因素,（一）成分 離子化程度越高越好。 （二）溫度 越高越好，但要注意不能破壞成分。 （三）溶劑 極性越高越好。 （四）濃度 越低越好。,四、離子交換色譜的技術(shù)操作,樹脂的預(yù)處理 裝柱 上樣交換 洗 脫,收集檢查,樹脂的再生,四、操作技術(shù) （一）樹脂的預(yù)處理 含義：將市售的含有雜質(zhì)的樹脂，處理去除雜質(zhì)，并轉(zhuǎn)為交換使用的類 型的過程。 方法：市售的陽離子交換樹脂均為鈉型，要轉(zhuǎn)為氫型備用。 市售的陰離子交換樹脂均為氯型，要轉(zhuǎn)為

6、氫氧型備用。 1 、浸蒸餾水中12天。 2、10倍量2mol/lHCl 浸23h，再用蒸餾水洗至中性。 3、.NaOH.。 4、交叉重復(fù)1、2。 注意：陽樹脂先2后3，三酸兩堿，共五次。 陰32，堿酸，。,2、裝柱： 柱底墊玻璃絲或脫脂棉，將事先用水溶脹并洗滌干凈的離子交換樹脂（如果是新購商品一定要先進(jìn)行預(yù)處理，詳細(xì)操作見樹脂的預(yù)處理與再生）與水的混合物灌入柱內(nèi)。 要求均勻、密實(shí)、無氣泡。,3、 上樣交換： 在柱頂放置一層玻璃絲，下端徐徐放液，同時(shí)將樣品溶液慢慢倒入柱內(nèi)。 注意：所加入的樣品溶液中被交換成分的毫摩爾數(shù)，應(yīng)與柱內(nèi)所加的離子交換樹脂的總?cè)萘肯噙m應(yīng)，經(jīng)驗(yàn)比例為：加入量占總交換容量的陽

7、1/2、陰1/4，1/3。,4、洗脫： 用合適的洗脫劑從上端加入，使樣品中各種不同的成分先后流出，分段定量收集洗脫液，可得單一成分的化合物。,規(guī)則：活潑離子優(yōu)先交換到樹脂上。,5、收集檢查 6、樹脂的再生： 樹脂長期使用，當(dāng)它的交換基大部分已經(jīng)交換了離子后，就會(huì)失去交換能力而失效，需要適當(dāng)處理使交換基上的已交換離子（如鈣、鎂離子等）變成可繼續(xù)交換的游離型交換基離子（H及OH）。,方法：同預(yù)處理,五、離子交換色譜的應(yīng)用,離子交換色譜時(shí)20世紀(jì)70年代發(fā)展起來的一種新的分析方法。主要用于能產(chǎn)生離子型的成分如氨基酸、肽類、生物堿、有機(jī)酸、酚類等成分的分離，并廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、環(huán)保（如水質(zhì)的測定）、食品

8、等多種行業(yè)。,第五節(jié) 凝膠色譜,凝膠色譜概念 凝膠色譜原理 凝膠色譜構(gòu)成要素 凝膠色譜的類型 凝膠色譜的操作技術(shù),第五節(jié) 凝膠色譜 一、凝膠色譜概念 以多孔凝膠為固定相的柱色譜。 二、原理： 利用凝膠的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的分子篩的過濾作用，使分子大小不同的成分，可以達(dá)到相互分離的目的。,凝膠，是在水中不溶、但可膨脹的球形顆粒，具有三維空間的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。 當(dāng)在水中充分膨脹后，裝入色譜柱中，加入樣品混合物，用同一溶劑洗脫時(shí)， 樣品 凝膠,由于凝膠網(wǎng)孔半徑的限制，大分子將不能滲入凝膠顆粒內(nèi)部（即被排阻在外）而在顆粒間隙移動(dòng)，并隨溶劑一起柱底流出； 小分子因可自由滲入并擴(kuò)散到凝膠顆粒內(nèi)部，故通過色譜柱時(shí)阻力增

9、大、流速變緩，將較晚流出。 故凝膠色譜按分子由大到小的順序流出分離。,大分子,小分子,凝膠顆粒,凝膠排阻示意圖解,三、凝膠色譜基本構(gòu)成要素,基本要素： 固定相、流動(dòng)相、被分離成分的溶液。,（一）固定相多孔凝膠 1、分類 （ 1 ）軟質(zhì)凝膠如葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠等，適用于水為流動(dòng)相。 （ 2 ）半硬質(zhì)凝膠如苯乙烯二乙烯基苯交聯(lián)共聚凝膠（交聯(lián)聚苯乙烯凝膠）是應(yīng)用最多的有機(jī)凝膠，適用于非極性有機(jī)溶劑。 （ 3 ）硬質(zhì)凝膠如多孔硅膠、多孔玻珠等，多孔硅膠是用得較多的無機(jī)凝膠。,2、葡聚糖凝膠的結(jié)構(gòu) 葡聚糖與甘油基通過醚橋并聯(lián)而成的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。,3. 葡聚糖凝膠的性質(zhì),極性：葡聚糖分子內(nèi)含有大量羥基

10、 穩(wěn)定性：由于醚鍵的不活潑性 ，不溶于水和鹽溶 液，在堿性和弱酸性溶液中性質(zhì)穩(wěn)定 ， 但在酸性溶液中高溫加熱能促使糖苷鍵 水解。和氧化劑接觸會(huì)分解，長期不用 宜加防腐劑。,4、葡聚糖凝膠的型號 GX G：葡聚糖凝膠 X：1克干凝膠吸水量的10倍 不同型號的性能及應(yīng)用 型號數(shù)字越大，吸水量越大，凝膠體積膨脹越大，孔隙也越大， 可用于大分子物質(zhì)的分離；反之，可用于小分子物質(zhì)的分離。 G型凝膠用于流動(dòng)相為水的色譜分離。另外，LH型凝膠應(yīng)用圍更廣，極性、親水性和親脂性流動(dòng)相中均可應(yīng)用。,（二）流動(dòng)相,親脂性溶劑：氯仿、甲苯。 極性和親水性溶劑：水、水溶液。 選用原則： 分離脂溶性成分，選用親脂性溶劑為

11、流動(dòng)相。 分離水溶性成分，選用極性和親水性溶劑為 流動(dòng)相。,四、凝膠色譜類型,凝膠過濾色譜：水為流動(dòng)相 （GFC）； 凝膠滲透色譜：有機(jī)溶劑為流動(dòng)相(GPC) 。,五、凝膠色譜操作技術(shù),凝膠的預(yù)處理 裝柱 上樣 洗脫 收集、檢查 凝膠的再利用,凝膠的預(yù)處理 將干凝膠用選好的流動(dòng)相（或溶劑）充分浸泡膨脹后被用。 裝柱 一般選擇直徑為2.5 cm的柱子。凝膠裝入柱中，放出溶劑，再用溶劑不斷流洗柱子，使凝膠沉集、柱床穩(wěn)定，并始終保持一定的液面。 上樣 把需要分離的成分溶于選好的溶劑中，上樣前為防止破壞柱床表面，要在 柱床表面放一張濾紙。上樣方法同一般柱色譜。 洗脫 洗脫劑和浸泡凝膠所用的溶劑相同。

12、收集 分段收集，定性檢查，合并同一組分，再進(jìn)行精制。 凝膠的再利用 可反復(fù)使用，無需再生。,六、應(yīng)用,分離分子大小不同的化合物。 分離大分子-廣泛應(yīng)用。 分離小分子，或其他方面(脫鹽、吸水濃縮、除熱源、測定分子量)-也有應(yīng)用。,第六節(jié) 大孔吸附樹脂色譜,大孔吸附樹脂色譜的概念 大孔吸附樹脂色譜的原理 大孔吸附樹脂色譜基本構(gòu)成要素 影響分離的主要因素 大孔吸附樹脂色譜的操作技術(shù) 大孔吸附樹脂的應(yīng)用,一、概念 吸附劑和分子篩應(yīng)用的柱色譜。 二、原理 吸附性：范德華引力、氫鍵 分子篩性：滲透、過濾,三、構(gòu)成要素,（一）固定相 1、分類：極性、非極性 2、性質(zhì)：大孔網(wǎng)狀的高分子吸附劑 3、選用：根據(jù)成

13、分的極性和分子大小 如分離大分子的物質(zhì)選擇能使大孔吸附樹脂體積膨脹大的溶劑。反之，選用使其體積膨脹小 的溶劑。,（二）流動(dòng)相,1、種類： 2、選用原則： 非極性大孔吸附樹脂：選擇流動(dòng)相極性越小，洗脫力越強(qiáng)。反之亦然。 一般上樣后先用水（或酸、堿水）洗去雜質(zhì)，然后用不同濃度的含水醇、甲醇、乙醇、丙酮等依次洗脫。,四、影響因素,極性大孔樹脂：極性大的或分子小的成分吸附力強(qiáng)。 非：小大,五、操作技術(shù),樹脂的預(yù)處理：丙酮加熱回流除雜質(zhì)， 裝柱 上樣 洗脫 收集、檢查,六、大孔吸附樹脂的應(yīng)用,大孔吸附樹脂主要應(yīng)用于中藥化合物的分離和富集工作。如多糖和苷類物質(zhì)的分離，黃酮苷、生物堿、三萜類化合物的分離和精

14、制，并廣泛應(yīng)用于其它各個(gè)領(lǐng)域。,第七節(jié) 高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）,近十幾年來發(fā)展起來的一種快速、靈敏、高效的分離技術(shù)。 特點(diǎn)是： 使用的固定相支持劑顆粒很細(xì)，因而表面積很大；溶劑系統(tǒng)采用高壓，因此洗脫速度增大。 多種類型的柱層析都可用HPLC來代替，例如分配層析、離子交換層析、吸附層析以及凝膠過濾等。,高效液相色譜的概念 高效液相色譜（HPLC）又稱高壓液相色譜或高速液相色譜，是利用高壓的手段加快液體流動(dòng)相流速，采用高效能固定相及高靈敏度檢測器發(fā)展起來的現(xiàn)代液相色譜法。 高效液相色譜的原理 包括前面講過的分配原理、吸附原理、離子交換原理和分子篩過濾、滲透原理。,高效液相色譜的類型 按分離原理不同分為 分配色譜 吸附色譜 離子交換色譜 凝膠色譜 按固定相和流動(dòng)相極性選擇不同分為 正相色譜 反相色譜,高效液相色譜的主要組成 主要包括：溶劑槽、高壓泵、進(jìn)樣器、色譜柱及高靈敏度的檢測器、數(shù)據(jù)處理器等。,溶劑槽,高壓泵,梯度淋洗,進(jìn)樣器,色譜柱,檢測器,收集器,記錄器,應(yīng)用 只要求試樣能制成溶液，而不需要?dú)饣?/p>