1、基因工程郭玉柱,1.1基因工程的基本操作工具,1、概念：定向改造生物性狀，解讀2、原理：基因重組3、操作水平：DNA分子水平4、操作工具：（1）限制性核酸內切酶-分子手術刀 1）來源：微生物（原核+真菌） 2）作用特點：識別雙鏈DNA分子的某種特定的核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷裂。,3）結果：形成平末端或粘性末端（2）DNA連接酶分子縫合針1）種類：E.coliDNA連接酶和T4DNA 連接酶2）作用特點：使兩個DNA分子片段之間形成磷酸二酯鍵，從而使之連接在一起。 E.coliDNA連接酶只連接粘性末端，T4DNA 連接酶兩種末端都能連，但連接平末端效率

2、低。,比較限制酶、DNA連接酶、DNA聚合酶、RNA聚合酶的異同點？相同點：都作用于磷酸二酯鍵不同點：1）限制酶切割DNA的磷酸二酯鍵2）DNA連接酶連接雙鏈DNA片段形成磷酸二酯鍵。3）DNA聚合酶使單個脫氧核苷酸之間形成磷酸二酯鍵。4）RNA聚合酶使單個核糖核苷酸之間形成磷酸二酯鍵。,（3）運載體-分子運輸車1）種類：質粒、噬菌體衍生物、動植物病毒2）天然質粒不能作為運載體，需要加工修飾后才可以。3）質粒作為運載體滿足的條件：1、有一個至多個限制酶切位點，便于目的基因插入。2、能在宿主細胞中自我復制或整合到染色體DNA上，隨染色體DNA同步復制。,3、具有標記基因（如抗生素抗性基因、熒光標

3、記基因），便于將含有目的基因的細胞篩選出來。4、大小適宜，對宿主細胞無傷害。,1.2 基因工程的基本操作程序,基因工程基本操作的四個步驟,1、目的基因的獲取,2、基因表達載體的構建,3、將目的基因導入受體細胞,4、目的基因的檢測與鑒定,一、目的基因的獲取,(一)、目的基因主要是_,編碼蛋白質的結構基因,請舉出三個以上的例子,（二）、獲取目的基因的常用方法有哪些?,1、從基因文庫中獲取,2、利用PCR技術擴增,3、人工合成,請閱讀P9第一和二兩段,一、目的基因的獲取,（一）從基因文庫中直接獲取,1.基因文庫,cDNA( 互補DNA)： 是由生物的某一特定器官或特定發(fā)育時期細胞內的mRNA經體外反

4、轉錄后形成的互補DNA片段，與載體連接后儲存在一個受體菌群中，這個受體菌群就叫做這種生物的cDNA文庫,2)cDNA文庫 (cDNA library),基因重組,反轉錄酶,mRNA,cDNA,一、目的基因的獲取,（一）從基因文庫中直接獲取,按照外源DNA片段的來源： 從特定組織提取的染色體基因組DNA -基因組DNA文庫（總） mRNA反轉錄成的cDNA拷貝-cDNA文庫（部分）,基因文庫的目的,為了在不知目的基因序列的情況下，便于獲得所需的目的基因。,基因文庫的分類,2.基因文庫的構建方法,：直接分離法,供體細胞中的DNA,許多DNA片段,運載體,限制酶,受體細胞,產生特定性狀,導入,外源D

5、NA擴增,目的基因,分離,(鳥槍法),一、目的基因的獲取,（一）從基因文庫中直接獲取,多用于原核生物,反轉錄法,目的基因的信使RNA,目的基因,化學合成法,肽鏈氨基酸序列,信使RNA序列,基因的核苷酸序列,目的基因,合成,逆轉錄,2.基因文庫的構建方法,一、目的基因的獲取,（一）從基因文庫中直接獲取,人工合成法（真核生物）,推測,推測,單鏈DNA,合成,基因組文庫的構建,（2）.基因文庫的構建方法,通過對受體菌的培養(yǎng)而儲存基因, cDNA文庫的構建-反轉錄法： 以目的基因轉錄成的信使RNA為模板，反轉錄成互補的單鏈DNA，然后在酶的作用下合成雙鏈DNA，從而獲得所需的基因。,目的基因的mRNA

6、,單鏈DNA,反轉錄酶,DNA聚合酶,雙鏈DNA (目的基因),怎樣從基因文庫中得到我們所需的目的基因呢?,依據：目的基因的有關信息。 如：根據基因的核苷酸序列 基因的功能 基因在染色體上的位置 基因的轉錄產物mRNA 基因翻譯產物蛋白質等特性,從基因文庫中得到目的基因的方法,2、利用PCR技術擴增目的基因, 概念：PCR全稱為_，是一項 在生物_復制_的核酸合成技術,條件：_、 _、_ 、 _.等,原理：_,方式：以_方式擴增，即_（n為擴增循 環(huán)的次數）,結果：,聚合酶鏈式反應,體外,特定DNA片段,DNA復制,四種脫氧核苷酸,一對引物,DNA聚合酶,指數,2n,使目的基因的片段在短時間內

7、成百萬倍地擴增,要有一段已知目的基因的核苷酸序列（前提條件）,過程：,a、DNA變性（90-95）：雙鏈DNA模板 在熱作用下，_斷裂，形成_,b、退火（復性55-65）：系統(tǒng)溫度降低，引 物與DNA模板結合，形成局部_。,c、延伸（70-75）：在Taq酶的作用下， 合成與模板互補的_。,氫鍵,單鏈DNA,雙鏈,DNA鏈,3、人工合成法：,基因較小，核苷酸序列已知，可以利用DNA合成儀人工合成,1、原核細胞的基因結構,非編碼區(qū),非編碼區(qū),編碼區(qū),編碼區(qū)上游,編碼區(qū)下游,與RNA聚合酶結合位點,啟動子,終止子,啟動子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片斷，它是RNA聚合酶識別和結合的部位，有了

8、它才能驅動基因轉錄出mRNA，最終獲得蛋白質 終止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片斷，能終止mRNA的轉錄,1、原核細胞的基因結構,非編碼區(qū),非編碼區(qū),編碼區(qū),編碼區(qū)上游,編碼區(qū)下游,與RNA聚合酶結合位點,啟動子,終止子,RNA聚合酶:能夠識別啟動子上結合位點的一種蛋白質.,RNA聚合酶能夠識別調控序列中的結合位點，并與其結合。,轉錄開始后，RNA聚合酶沿DNA分子移動，并以DNA分子的一條鏈為模板合成RNA。,轉錄完畢后，RNA鏈釋放出來，緊接著RNA聚合酶也從DNA模板鏈上脫落下來。,不能轉錄為信使RNA，不能 編碼蛋白質。,：能轉錄相應的信使RNA，能 編碼蛋白質,編碼區(qū),非編碼

9、區(qū),原核細胞的 基因結構,有調控遺傳信息表達的核 苷酸序列.包括啟動子和終止子,非編碼區(qū),非編碼區(qū),編碼區(qū),編碼區(qū)上游,編碼區(qū)下游,啟動子,終止子,2、真核細胞的基因結構,編碼區(qū),與RNA聚合酶 結合位點,內含子,外顯子,能夠編碼蛋白質的序列叫做外顯子,不能夠編碼蛋白質的序列叫做內含子,啟動子,終止子,編碼區(qū)上游,編碼區(qū)下游,內含子：,外顯子：,真核細胞的 基因結構,編碼區(qū),非編碼區(qū),外顯子：能編碼蛋白質的序列 內含子：不能編碼蛋白質的序列,：有調控作用的核苷酸序列， 包括位于編碼區(qū)上游的RNA 聚合酶結合位點（啟動子）。,非編碼序列：,包括非編碼區(qū)和內含子,3、原核細胞與真核細胞的基因結構比

10、較,思考,編碼相同數目氨基酸的蛋白質，原核細胞與真核細胞基因結構一樣長嗎？,連續(xù),不連續(xù),編碼區(qū),非編碼,二、基因表達載體的構建 基因工程的核心,1、目的： 所需物質：,使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代，同時使目的基因能夠表達和發(fā)揮作用。,它們各自的作用是什么?,2、基因表達載體的組成：,復制原點+目的基因+啟動子+終止子+標記基因,它們各自的作用是什么?,載體與表達載體的區(qū)別：二者都有標記基因和復制原點兩部分DNA片段。表達載體在載體基礎上增加了目的基因、啟動子、終止子三部分結構 用到的工具酶：既用到限制酶切割載體，又用到DNA連接酶將目的基因和載體拼接，兩種酶作用的化學

11、鍵都是磷酸二酯鍵 啟動子、終止子對于目的基因表達必不可少 目的基因不能單獨進入受體細胞，必需以表達載體的方式攜帶進去。,注意,三將目的基因導入受體細胞,（一）轉化：,（二）方法,將目的基因導入 植物細胞,將目的基因導入 動物細胞,將目的基因導入 微生物細胞,農桿菌轉化法(雙子葉）,基因槍法（單子葉）,花粉管通道法,顯微注射法,Ca2+處理法,目的基因進入_內，并且在 受體細胞內維持_和_的過程,受體細胞,穩(wěn)定,表達,1、將目的基因導入植物細胞的方法： （1）農桿菌轉化法 農桿菌特點：,易感染雙子葉植物和裸子植物，對大多數單子葉植物沒有感染能力,原理：Ti質粒上的T-DNA可以轉移到受體細胞，并

12、整合到受體細胞染色體的DNA上。,過程：,優(yōu)點,（2）基因槍法 （3）花粉管通道法,2、將目的基因導入動物細胞 方法：顯微注射法 程序：,目的基因表達載體提純 取卵（受精卵） 顯微注射 受精卵（或胚胎干細胞) 新性狀動物,3、將目的基因導入微生物細胞 原核生物特點：繁殖快、單細胞、遺傳物質少 方法：,用Ca2+處理細胞 感受態(tài)細胞 表達載體與感受態(tài)細胞混合 感受態(tài)細胞吸收DNA分子 CacL2可以改變微生物細胞壁的通透性,四、目的基因的檢測與鑒定,檢查是否成功,（一）、檢測,1、檢測轉基因生物染色體的DNA上是否插入了目的基因,.首先取出轉基因生物的基因組DNA .用含目的基因的DNA片段用放

13、射性同位素等作標記,以此做探針 .使探針和轉基因生物的基因組雜交,若顯示出雜交帶,表明染色體已插入染色體DNA中,（1）方法:,DNA分子雜交,（2）過程:,（二）、鑒定（個體生物學+分子生物學水平）,2、檢測目的基因是否轉錄出了mRNA,3、檢測目的基因是否翻譯成蛋白質,抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等,方法:,分 子 雜 交,方法:,抗原-抗體雜交,過程: 用上述探針和轉基因生物的mRNA雜交,若出現雜交帶,表明目的基因轉錄出了mRNA,歸納: 基因工程的基本操作程序,獲取目的基因 從基因文庫 利用PCR 化學方法人工合成 構建基因表達載體 目的基因、啟動子、終止子、標記基因 將目的基因導入受體細胞 農桿菌轉化法、顯微注射法等 目的基