1、目標導航,預(yù)習導引,1.能進行PCR技術(shù)的基本操作。 2.能記住PCR的原理。 3.能說出PCR的應(yīng)用。,目標導航,預(yù)習導引,一,二,三,四,五,一、PCR原理 1.細胞內(nèi)DNA復(fù)制所需基本條件,DNA分子能準確復(fù)制的原因有哪些? 提示:DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)提供模板;堿基互補配對。,目標導航,預(yù)習導引,一,二,三,四,五,2.子鏈延伸的方向 (1)DNA的兩條鏈是反向平行的,通常將DNA的羥基末端稱為3端,而將磷酸基團的末端稱為5端。DNA聚合酶不能從頭開始合成DNA,而只能從3端延伸DNA鏈,因此,DNA復(fù)制需要引物。 (2)DNA的合成方向總是從子鏈的5端向3端延伸。 3.DNA分子復(fù)制的人工

2、控制 (1)雙鏈的解開是進行DNA復(fù)制的前提。在體外可通過控制溫度來實現(xiàn)。在80100 的溫度范圍內(nèi),DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)將解體,雙鏈分開,這個過程稱為變性。 (2)當溫度緩慢降低后,兩條彼此分離的DNA鏈又會重新結(jié)合成雙鏈,稱為復(fù)性。,目標導航,預(yù)習導引,一,二,三,四,五,(3)PCR利用了DNA的熱變性原理,通過控制溫度來控制雙鏈的解聚與結(jié)合。 (4)由于PCR過程的溫度高,會導致普通的DNA聚合酶失活,后來耐高溫的TaqDNA聚合酶的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用,大大增加了PCR的效率。 (5)PCR反應(yīng)需要在一定的緩沖溶液中才能進行,需提供:DNA模板,分別與兩條模板鏈相結(jié)合的兩種引物,四種脫氧核苷酸,

3、耐熱的DNA聚合酶,同時通過控制溫度使DNA復(fù)制在體外反復(fù)進行。,二、PCR的反應(yīng)過程 1.PCR一般要經(jīng)歷三十多次循環(huán),每次循環(huán)可以分為變性、復(fù)性和延伸三步。 2.在循環(huán)之前,常要進行一次預(yù)變性,以便增加大分子模板DNA徹底變性的概率。 3.過程 (1)變性:在溫度上升到90 以上時,雙鏈DNA解聚為單鏈。 (2)復(fù)性:當溫度下降到50 左右時,兩種引物通過堿基互補配對與兩條單鏈DNA結(jié)合。 (3)延伸:當溫度上升到72 左右時,合成新的DNA鏈。 4.從第二輪循環(huán)開始,上一次循環(huán)的產(chǎn)物也作為模板參與反應(yīng),并且由引物延伸而成的DNA單鏈會與引物結(jié)合,進行DNA的延伸,這樣,DNA聚合酶只能特

4、異地復(fù)制處于兩個引物之間的DNA序列,使這段固定長度的序列呈指數(shù)擴增。,目標導航,預(yù)習導引,一,二,三,四,五,目標導航,預(yù)習導引,一,二,三,四,五,三、實驗操作 在PCR實驗中,通常要用到微量離心管。具體操作時,用微量移液器依次加入各種組分。,目標導航,預(yù)習導引,一,二,三,四,五,四、實驗注意事項 1.為避免外源DNA等因素的污染,所用儀器、緩沖液以及蒸餾水等在使用前必須進行高壓滅菌。 2.緩沖液和酶應(yīng)分裝成小份,并在-20 儲存。 3.在微量離心管中添加反應(yīng)成分時,每吸取一種成分后,移液器上的槍頭都必須更換。所有成分加入后蓋嚴離心管口的蓋子。 4.混勻后要離心處理,使反應(yīng)液集中在離心管

5、底部,再放入PCR儀中進行反應(yīng)。 你知道乙肝病毒基因診斷盒所需的大量乙肝病毒基因是怎樣獲得的嗎? 提示:采用PCR技術(shù)對乙肝病毒基因進行迅速擴增產(chǎn)生的。,目標導航,預(yù)習導引,一,二,三,四,五,五、DNA含量的測定 1.理論上DNA擴增呈指數(shù)增長,即一條DNA片段循環(huán)n次后產(chǎn)物DNA的數(shù)目為2n,但實際可能會有諸多因素影響DNA含量,所以需要對DNA含量進行測定。 2.DNA在260 nm的紫外線波段有一強烈的吸收峰,峰值的大小與DNA的含量有關(guān),可以利用DNA這一特點進行DNA含量的測定。,知識梳理,典例透析,比較細胞內(nèi)DNA復(fù)制與體外DNA擴增(PCR),知識梳理,典例透析,知識梳理,典例

6、透析,題型一,題型二,題型一 PCR的原理及應(yīng)用 【例題1】 下列關(guān)于PCR的描述,不正確的是() A.PCR技術(shù)的原理是DNA復(fù)制 B.PCR是一酶促反應(yīng),需耐高溫的解旋酶和DNA聚合酶 C.一個DNA片段經(jīng)PCR擴增,理論上可以形成2n個DNA片段(n代表循環(huán)次數(shù)) D.PCR利用了DNA的熱變性來控制DNA的解聚與結(jié)合 解析:PCR是一種體外迅速擴增DNA片段的技術(shù),以極少量的DNA為模板,DNA聚合酶從引物的3端連接脫氧核苷酸,短時間內(nèi)迅速復(fù)制上百萬份的DNA拷貝。PCR利用DNA的熱變性原理來解旋,不需要解旋酶。 答案:B,知識梳理,典例透析,題型一,題型二,反思領(lǐng)悟DNA復(fù)制時要解螺旋,細胞內(nèi)DNA的解旋需要解旋酶催化,而體外DNA復(fù)制時一般是加熱解旋。,知識梳理,典例透析,題型一,題型二,題型二 PCR技術(shù)操作 【例題2】 下列有關(guān)PCR操作過程的敘述,錯誤的是 () A.PCR實驗中使用的微量離心管、槍頭、緩沖液以及蒸餾水等在使用前必須進行高壓滅菌 B.PCR所用的緩沖液和酶應(yīng)分裝成小份,并在-20 儲存 C.PCR所用的緩沖液和酶從冰箱拿出之后,迅速融化 D.在微量離心管中添加反應(yīng)成分時,每吸取一種試劑后,移液器上的槍頭都必須更換 解析:為了防止外源DNA等因素的污染,PCR實驗中使用的微量離心管、槍頭、