1、ICS11.220B 41DB37山東省地方標(biāo)準(zhǔn)DB37/T 40502020中獸藥散劑中添加磺胺類藥物的測(cè)定超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法Determination of sulfonamides added to chinese veterinary drug powderUltra-high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry2020 - 07 - 09發(fā)布2020 - 08 - 09實(shí)施山東省市場(chǎng)監(jiān)督管理局發(fā)布DB37/T 40502020目次前言II1范圍12規(guī)范性引用文件13原理14試劑或材料15儀器設(shè)備

2、26試驗(yàn)步驟26.1陰性樣品26.2提取26.3儀器參考條件26.4測(cè)定37試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理38精密度4附錄A（資料性附錄）磺胺類藥物特征離子參考質(zhì)量色譜圖5前言本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T 1.12009給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由山東省畜牧獸醫(yī)局提出并組織實(shí)施。本標(biāo)準(zhǔn)由山東省畜牧業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：山東省獸藥質(zhì)量檢驗(yàn)所、威海市畜牧業(yè)發(fā)展中心。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：魏秀麗、徐恩民、張傳津、張志民、尹伶靈、劉霄飛、陳玲、王燕、陳志強(qiáng)、趙國(guó)清。 5中獸藥散劑中添加磺胺類藥物的測(cè)定超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法1 范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了中獸藥散劑中磺胺類藥物的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于中獸

3、藥散劑（白頭翁散，黃連解毒散、清瘟敗毒散）中添加磺胺嘧啶、磺胺甲基異噁唑、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺喹噁啉的測(cè)定。本方法的檢出限為0.2 mg/g，定量限為0.5 mg/g。2 規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T 6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法3 原理中獸藥散劑中添加的磺胺類藥物經(jīng)提取后，超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定，依據(jù)保留時(shí)間和離子豐度比定性，外標(biāo)法定量。4 試劑或材料除非另有規(guī)定，所用試劑均為色譜純。4.1 水符合GB/T 668

4、2一級(jí)水的規(guī)定。4.2 乙腈（CH3CN）：色譜純。4.3 甲酸（HCOOH）：色譜純。4.4 甲醇（CH3OH）：色譜純。4.5 流動(dòng)相： 流動(dòng)相A（0.1 %甲酸水溶液）：吸取甲酸（4.3）1.0 mL，加水稀釋至1 000 mL，過0.22 m微孔濾膜備用； 流動(dòng)相B (0.1 %甲酸乙腈)：吸取甲酸（4.3）1.0 mL，加乙腈（4.2）稀釋至1 000 mL，過0.22 m微孔濾膜備用； 初始流動(dòng)相：量取0.1 %甲酸乙腈50 mL與0.1 %甲酸水溶液450 mL，混勻，備用。4.6 五種磺胺類藥物對(duì)照品：磺胺嘧啶，磺胺甲基異噁唑，磺胺間甲氧嘧啶，磺胺二甲嘧啶，磺胺喹噁啉，純度95

5、.0 %。4.7 混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：稱取五種磺胺類藥物對(duì)照品（4.6）各10 mg（準(zhǔn)確至0.01 mg），分別置10 mL容量瓶中，加甲醇（4.4）溶解并稀釋至刻度，搖勻，得五種磺胺類藥物對(duì)照品溶液。準(zhǔn)確吸取五種磺胺類藥物對(duì)照品溶液各1.0 mL，置10 mL容量瓶中，加甲醇（4.4）稀釋至刻度，搖勻，得混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，4 冰箱保存，有效期3個(gè)月。4.8 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備：吸取混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液適量，用初始流動(dòng)相稀釋，制備成系列濃度為：10 ng/mL、20 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL、200 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液，作標(biāo)準(zhǔn)曲線。100 ng/mL工作液作為超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜

6、（UPLC-MS/MS）的對(duì)照品溶液。4.9 有機(jī)微孔濾膜：0.22 m。5 儀器設(shè)備5.1 超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀：配電噴霧離子源（ESI）。5.2 分析天平：感量0.01 g，0.000 01 g。5.3 離心機(jī)：5 000 r/min。5.4 超聲波清洗機(jī)。6 試驗(yàn)步驟6.1 陰性樣品未添加五種磺胺類藥物的樣品。6.2 提取取試樣1 g（準(zhǔn)確至0.01 g），置離心管中，加10 mL甲醇，提取5 min，5 000 r/min離心10 min，取上清液，逐級(jí)稀釋10 000倍，用濾膜（4.9）過濾，得UPLC-MS/MS供試品溶液，待測(cè)。6.3 儀器參考條件6.3.1 高效液相色譜參考

7、條件色譜柱：C18，50 mm2.1 mm，粒徑1.7 m，或性能相當(dāng)者。流動(dòng)相A：0.1 %甲酸水溶液。流動(dòng)相B：0.1 %甲酸乙腈。流速：0.25 mL/min。進(jìn)樣量：10 L。柱溫：35 。液相色譜梯度洗脫條件見表1。表1 液相色譜梯度洗脫條件時(shí)間minA%B%090104.055454.290105.090106.3.2 質(zhì)譜參考條件掃描模式：電噴霧正離子（ESI+）。毛細(xì)管電壓：3 kv。離子源溫度：105 。脫溶劑溫度：350 。脫溶劑氮?dú)饬魉伲?00 L/h。采集方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）?；前奉愃幬锏亩ㄐ浴⒍侩x子見表2。表2 五種磺胺的定性離子對(duì)、定量離子對(duì)、錐孔電壓和碰撞

8、能量品名定量離子對(duì)定性離子對(duì)錐孔電壓V碰撞能量V保留時(shí)間min磺胺嘧啶251155.5251155.5251107.52715231.45磺胺二甲嘧啶279185.6279185.6279123.63218282.03磺胺間甲氧嘧啶281155.5281155.5281107.52817242.40磺胺甲基異惡唑254155.5254155.5254107.52515232.77磺胺喹噁啉301.1155.8301.1155.8301.1107.83020203.366.4 測(cè)定6.4.1 定性測(cè)定通過樣品溶液色譜圖的保留時(shí)間與相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)溶液的保留時(shí)間、各色譜峰的特征離子與相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)溶液各色譜峰的

9、特征離子相對(duì)照定性。樣品溶液與標(biāo)準(zhǔn)溶液保留時(shí)間的相對(duì)偏差不大于2.5 %；樣品溶液特征離子的相對(duì)離子豐度與標(biāo)準(zhǔn)溶液的相對(duì)離子豐度一致，相對(duì)離子豐度偏差不超過表3的規(guī)定，則可判斷樣品中存在磺胺類藥物。表3 定性測(cè)定時(shí)相對(duì)離子豐度的最大允許偏差相對(duì)離子豐度（%）5020至5010至2010允許的相對(duì)偏差（%）202530506.4.2 定量測(cè)定取樣品溶液和對(duì)照溶液各10 L注入液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀，在上述色譜-質(zhì)譜條件下進(jìn)行測(cè)定，記錄質(zhì)量色譜圖，外標(biāo)法定量。典型的磺胺類藥物標(biāo)準(zhǔn)溶液中特征離子的質(zhì)量色譜圖參見附錄A。7 試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理樣品中磺胺類藥物的含量按下式計(jì)算：(1)式中：X 試樣中磺胺類藥物的含量，單位為毫克每克（mg/g）；C 試樣溶液中磺胺類濃度，單位為納克每毫升（ng/mL）；V1 試樣溶液總體積（按6.2描述為100 000，經(jīng)三次稀釋10100100=100 000），單位 為毫升（mL）；m 試樣的取樣量，單位為克（g）；