1、PCR 引物設(shè)計(jì),PCR primer express,聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase Chain Reaction ,PCR)體外核酸擴(kuò)增技術(shù),能在一個(gè)試管內(nèi)將所要研究微量的目的基因或某一DNA片段于數(shù)小時(shí)內(nèi)擴(kuò)增至十萬乃至百萬倍,使肉眼能直接觀察和判斷。 PCR使人們能通過試管內(nèi)的數(shù)小時(shí)的反應(yīng)將特定的DNA片段擴(kuò)增數(shù)百萬倍。該技術(shù)已成為分子生物學(xué)研究的重要技術(shù)體系，其建立極大地推動了生命科學(xué)的研究進(jìn)展。在DNA重組與表達(dá)、基因結(jié)構(gòu)分析與功能檢測具有重要的應(yīng)用價(jià)值。,PCR技術(shù)的創(chuàng)建,Kary B. Mullis（穆利斯（美）,Khorana(1971)等提出在體外經(jīng)DNA變性,與適當(dāng)引物

2、雜交,再用DNA聚合酶延伸,擴(kuò)增DNA的設(shè)想。 1983年,Mullis發(fā)明了PCR技術(shù),使Khorana的設(shè)想得到實(shí)現(xiàn)。 1988年Saiki等將耐熱DNA聚合酶（Taq）引入了PCR技術(shù)。 1989年美國Science雜志列PCR 為十余項(xiàng)重大科學(xué)發(fā)明之首,比喻1989年為PCR爆炸年,Mullis榮獲1993年度諾貝爾化學(xué)獎。,1. PCR的基本原理,PCR的原理是根據(jù)待測DNA片段兩端的核苷酸序列，設(shè)計(jì)并人工合成兩個(gè)分別與DNA片段兩端互補(bǔ)的寡聚核苷酸引物，在有過量的引物、過量的底物（4種dNTP）、DNA聚合酶以及模板的反應(yīng)體系中，經(jīng)過高溫變性、低溫退火和適溫延伸三個(gè)階段的循環(huán)周期，

3、對DNA分子進(jìn)行擴(kuò)增。 由于新合成的DNA雙鏈能夠作為下一循環(huán)的模板，所以模板DNA以幾何級擴(kuò)增。一般經(jīng)過30-35次擴(kuò)增循環(huán)，可使目的基因DNA片段放大數(shù)百萬倍。,2. PCR體系的主要成分,模板DNA（靶基因） 特異引物 底物dNTP 耐熱性DNA聚合酶（如TaqDNA聚合酶） Mg2+緩沖液 1988年Saiki 等從溫泉中分離的一株水生嗜熱桿菌(thermus aquaticus) 中提取到一種耐熱DNA聚合酶。此酶具有以下特點(diǎn)：耐高溫，在70下反應(yīng)2h后其殘留活性大于原來的90%，在93下反應(yīng)2h后其殘留活性是原來的60%，在95下反應(yīng)2h后其殘留活性是原來的40%。在熱變性時(shí)不會被

4、鈍化，不必在每次擴(kuò)增反應(yīng)后再加新酶。大大提高了擴(kuò)增片段特異性和擴(kuò)增效率，增加了擴(kuò)增長度(2.0Kb)。由于提高了擴(kuò)增的特異性和效率，因而其靈敏性也大大提高。,（1）模板 單、雙鏈DNA均可。 不能混有蛋白酶，特別是染色體中的組蛋白、核酸酶、DNA聚合酶抑制劑、DNA結(jié)合蛋白類。 一般100ng DNA模板/100L。 模板濃度過高會導(dǎo)致反應(yīng)的非特異性增加。 （2）引物濃度 0.1-0.5 mol/L 濃度過高易導(dǎo)致模板與引物錯(cuò)配,反應(yīng)非特異性擴(kuò)增，且可增加引物之間形成二聚體的機(jī)會。 （3）Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus) 0.5-2.5 U/50 l 酶量過高可引起反

5、應(yīng)非特異性擴(kuò)增;酶量過少則合成產(chǎn)物量減少。,（4）dNTP濃度 取決于擴(kuò)增片段的長度 四種dNTP濃度應(yīng)相等，如果有一種濃度不同于其他幾種，就會引起錯(cuò)配。 濃度過高易產(chǎn)生錯(cuò)誤堿基的摻入，濃度過低則降低反應(yīng)產(chǎn)量 dNTP可與Mg2+結(jié)合，使游離的Mg2+濃度下降，影響DNA聚合酶的活性。 （5） Mg2+濃度 Mg2+是DNA聚合酶的激活劑。 0.5mmol/L-2.5mmol/L反應(yīng)體系。 Mg2+濃度過低會使Taq酶活性喪失、PCR產(chǎn)量下降； Mg2+過高反應(yīng)特異性降低，出現(xiàn)非特異擴(kuò)增。Mg2+可與負(fù)離子結(jié)合，所以反應(yīng)體系中dNTP、EDTA等的濃度影響反應(yīng)中游離的Mg2+濃度。,three

6、 steps: Denaturation (變性): 將反應(yīng)體系加熱至90-97，使模板DNA完全變性成為單鏈，同時(shí)引物自身以及引物之間存在的局部雙鏈也得以消除。 Annealing (退火): 當(dāng)溫度突然降低至45-65,引物與其互補(bǔ)的單鏈DNA模板在局部形成雜交鏈。 Extension (延伸): 將溫度升高至70-74下，在Taq DNA 聚合酶和四種脫氧核糖核苷三磷酸底物及Mg2+存在的條件下引物沿著模板DNA延伸。 利用PCR儀來控制溫度,3. How PCR works,聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng),1. Denaturation,2. Annealing,3. Extension,以上三個(gè)步驟

7、構(gòu)成一個(gè)循環(huán)，新合成的DNA分子繼續(xù)作為下一輪合成的模板，經(jīng)多次循環(huán)（2530）次即可達(dá)到擴(kuò)增DNA片段的目的。,5,Primer 1,5,Primer 2,5,5,Template DNA,5 Essential Components of PCR Reaction,PCR動畫,4. 引物設(shè)計(jì)原則,引物設(shè)計(jì)是PCR技術(shù)中至關(guān)重要的一環(huán)，其優(yōu)劣直接關(guān)系到PCR的特異性和實(shí)驗(yàn)?zāi)芊癯晒Α?引物要與模板鏈的序列緊密互補(bǔ)。合成的一對引物分別與待測DNA的5端和3端互補(bǔ)。 引物內(nèi)和引物之間不能形成穩(wěn)定的二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)。這會破壞引物退火穩(wěn)定性。引物內(nèi)部和引物之間不應(yīng)有互補(bǔ)序列，一般來說，引物內(nèi)部以及引物

8、之間連續(xù)互補(bǔ)的堿基不應(yīng)多于4個(gè)。 引物與非特異性擴(kuò)增區(qū)無同源性。引物不能在模板的非目的位點(diǎn)引發(fā)DNA聚合反應(yīng)，即錯(cuò)配。 長度：1530個(gè)核苷酸。常用18-27bp。引物需要足夠長，保證序列獨(dú)特性，并降低序列存在于非目的序列位點(diǎn)的可能性。但是長度大于24 核苷的引物并不意味著更高的特異性。較長的序列可能會與錯(cuò)誤配對序列雜交，降低了特異性，而且會導(dǎo)致其延伸溫度大于74，不適于Taq DNA 聚合酶進(jìn)行反應(yīng)。 引物序列在模板內(nèi)應(yīng)當(dāng)沒有相似性較高，尤其是3端相似性較高的序列，否則容易導(dǎo)致錯(cuò)配。引物3端出現(xiàn)3 個(gè)以上的連續(xù)堿基，如GGG 或CCC，也會使錯(cuò)誤引發(fā)機(jī)率增加。,引物3端的末位堿基對Taq 酶

9、的DNA 合成效率有較大的影響。末位堿基為A 的錯(cuò)配率明顯高于其他3 個(gè)堿基，因此應(yīng)當(dāng)避免在引物的3端使用堿基A。5端序列對PCR 影響不太大，因此常用來引進(jìn)修飾位點(diǎn)或標(biāo)記物。 選擇 GC 含量為40到60或GC 含量與模板GC 含量接近的引物。引物與模板形成雙鏈的內(nèi)部穩(wěn)定性(internal stability, )。設(shè)計(jì) 5端和中間區(qū)為G 或C 的引物，這會增加引物的穩(wěn)定性和引物同目的序列雜交的穩(wěn)定性。過高或過低都不利于引發(fā)反應(yīng)。 兩引物的Tm 值相差不應(yīng)大于5 。 DNA熔解溫度，指把DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)降解一半時(shí)的溫度。不同序列的DNA，Tm值不同。DNA中GC含量越高，Tm值越高，成正

10、比關(guān)系。復(fù)性溫度=Tm值-(510)在Tm值允許范圍內(nèi)， 選擇較高的復(fù)性溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結(jié)合， 提高PCR反應(yīng)的特異性。復(fù)性時(shí)間一般為3060sec，足以使引物與模板之間完全結(jié)合。 對引物的修飾一般是在5端增加酶切位點(diǎn)，應(yīng)根據(jù)下一步實(shí)驗(yàn)中要插入PCR 產(chǎn)物的載體的相應(yīng)序列而確定。,5. Premier 5.0 使用,“Premier”的主要功能分四大塊，其中有三種功能比較常用，即引物設(shè)計(jì)、限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)分析和DNA 基元(motif)查找。“Premier”還具有同源性分析功能，但并非其特長。 此外，該軟件還有設(shè)計(jì)簡并引物、DNA與蛋白質(zhì)序列的互換等功能。 簡并引物：有時(shí)候，對于引物設(shè)計(jì)僅了解有限的序列信息。比如，如果僅知道氨基酸序列，可以設(shè)計(jì)簡并引物。簡并引物是指代表編碼單個(gè)氨基酸所有不同堿基可能性的不同序列的混合物。為了增加特異性，可以參考密碼子使用表，根據(jù)不同生物的堿基使用偏好，減少簡并性。,豬的UCP3基因（脂調(diào)節(jié)基因）的第五外顯子（exon）序列 1.輸入目的基因