1、實(shí)驗(yàn)十四,氨基移換反應(yīng)及其產(chǎn)物的鑒定,一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵?1、學(xué)習(xí)鑒定氨基移換反應(yīng)的簡(jiǎn)便方法及其原理； 2、學(xué)習(xí)紙層析的原理和操作技術(shù)。,二、實(shí)驗(yàn)基本原理 1.氨基移換反應(yīng)： 在氨基移換酶（轉(zhuǎn)氨酶)的催化下，氨基酸的-氨基和-酮酸的-酮基之間發(fā)生的互換反應(yīng)。 轉(zhuǎn)氨酶的種類很多，任何一種氨基酸進(jìn)行轉(zhuǎn)氨作用時(shí)都由其專一的轉(zhuǎn)氨酶催化。轉(zhuǎn)氨酶的最適pH接近7.4，在各種轉(zhuǎn)氨酶中，谷丙轉(zhuǎn)氨酶（GPT）和谷草轉(zhuǎn)氨酶（GOT）的活性最強(qiáng)。 轉(zhuǎn)氨酶廣泛存在于機(jī)體的各種組織中。在肝、心、腎等組織中谷丙轉(zhuǎn)氨酶（glutamic pyruvic transaminase, GPT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（glutamic o

2、xalacetic transaminase,GOT）活性較高。,GPT催化下的轉(zhuǎn)氨基反應(yīng)為：,L谷氨酸脫氫酶在體內(nèi)特別是在肝細(xì)胞內(nèi)含量豐富，活性高，催化L谷氨酸氧化脫NH2，加碘乙酸能抑制其活性，從而可以保護(hù)氨基移換反應(yīng)的產(chǎn)物L(fēng)谷氨酸。 本實(shí)驗(yàn)用紙層析法，檢查由丙氨酸和酮戊二酸在肝細(xì)胞谷丙轉(zhuǎn)氨酶（GPT) 的作用下所生成的谷氨酸，證明組織內(nèi)的氨基移換作用。,2. 紙層析原理： 濾紙層析是以濾紙作為惰性支持物的分配層析。利用不同物質(zhì)在兩個(gè)互不相溶的溶劑中分配情況（溶解度）的不同來分離混合物的一種技術(shù)。 層析溶劑是由有機(jī)溶劑和水組成。濾紙纖維上羥基具有親水性，因此吸附一層水作為固定相，而通常把有

3、機(jī)溶劑作為流動(dòng)相。進(jìn)行分離時(shí)，由于被分離物質(zhì)的組分在兩相中的分布不同，隨著流動(dòng)相的移動(dòng)，物質(zhì)將在兩相間進(jìn)行連續(xù)的、動(dòng)態(tài)的不斷分配，從而造成不同組分移動(dòng)的速度也不相同。易溶于流動(dòng)相中的組分移動(dòng)快，在固定相中溶解度大的組分移動(dòng)慢，于是得到分離。,溶質(zhì)在濾紙上的移動(dòng)速率用Rf值表示：,X原點(diǎn)到層析斑點(diǎn)中心距離 Y原點(diǎn)到溶劑前沿的距離,在一定的條件下某種物質(zhì)的Rf值是常數(shù)。Rf值的大小與樣品的性質(zhì)、結(jié)構(gòu)、溶劑系統(tǒng)（溶劑的性質(zhì)、溶劑的pH）、層析的溫度和層析濾紙有關(guān)。此外，樣品中的鹽分，其他雜質(zhì)以及點(diǎn)樣過多皆會(huì)影響樣品的有效分離。,用濾紙層析法分離氨基酸，是根據(jù)氨基酸樣品的R基團(tuán)的化學(xué)結(jié)構(gòu)或極性大小的不

4、同，將樣品氨基酸溶解在適當(dāng)?shù)娜軇?0.01mol/L pH7.4磷酸緩沖液）中，點(diǎn)樣在濾紙的一端，再選用適當(dāng)?shù)娜軇┫到y(tǒng)（酚溶液），通過毛細(xì)現(xiàn)象向另一端展層，展層完畢后，用茚三酮作為顯色劑，即可得到氨基酸樣品的分離圖譜。,3. 茚三酮的顯色原理： 氨基酸+茚三酮類 紫紅色復(fù)合物,三、實(shí)驗(yàn)材料與試劑 1、實(shí)驗(yàn)材料 動(dòng)物肝臟(牛蛙肝或豬肝） 2、實(shí)驗(yàn)試劑 0.01mol/L 磷酸緩沖液（pH7.4）（轉(zhuǎn)氨反應(yīng)所需緩沖溶液）； 0.1mol/L 丙氨酸 （pH7.4）（轉(zhuǎn)氨反應(yīng)底物，同時(shí)作為紙層析點(diǎn)樣 時(shí)的標(biāo)準(zhǔn)樣品）； 0.1mol/L 酮戊二酸 （pH7.4）（轉(zhuǎn)氨反應(yīng)底物）； 0.1mol/L

5、谷氨酸（pH7.4）（紙層析點(diǎn)樣時(shí)的標(biāo)準(zhǔn)樣品）； 展層溶劑酚溶液（紙層析用）； 10三氯乙酸（終止酶促反應(yīng)，同時(shí)使轉(zhuǎn)氨酶及其它蛋白質(zhì)變性、沉淀下 來）； 0.25%碘乙酸（抑制L谷氨酸脫氫酶活性）； 顯色劑（0.1%茚三酮-乙醇溶液）。,四、實(shí)驗(yàn)器材與儀器 勻漿器或研缽； 試管及試管架； 恒溫水浴箱（37、100）； 鉛筆、尺和圓規(guī)； 毛細(xì)管（直徑0.5mm)； 新華定性濾紙（直徑11cm）； 剪刀和鑷子； 電吹風(fēng)； 滴管； 康氏皿； 噴霧器； 烘箱（80 ）。,五、實(shí)驗(yàn)操作方法和步驟 1、酶液的制備 取新鮮牛蛙肝或豬肝約3g，剪碎放入勻漿器中加12ml磷酸緩沖液，將肝臟勻漿液或用研缽將肝臟碾

6、碎，加3ml磷酸緩沖液迅速碾磨，加9ml磷酸緩沖液，用兩層紗布過濾，收集漿液或?yàn)V液即得轉(zhuǎn)氨酶提取液備用。 2、氨基移換反應(yīng) 取4支潔凈、干燥的試管，按表1操作,表1,3、層析 準(zhǔn)備：取新華定性濾紙（直徑11cm）一張，找出圓心，用圓規(guī)畫一直徑2 cm的細(xì)圓圈（保持干凈），并按圖1作出點(diǎn)樣位置。找出圓心，用鉛筆尖在圓心處截一小孔（孔徑約0.2cm)。另取2cm2cm濾紙，先將下端剪成須狀，卷成“燈芯”，備用。 點(diǎn)樣：用毛細(xì)管依次點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)丙氨酸(Ala)、 谷氨酸(Glu)各點(diǎn)2次，其余14號(hào)管樣液各點(diǎn)23次。點(diǎn)樣時(shí)，要待前次點(diǎn)樣干燥（可用電吹風(fēng)吹干）后方可再次點(diǎn)樣，點(diǎn)樣直徑不超過0.3cm。,1,

7、2,3,4,5,6,11號(hào)管反應(yīng)樣液（ 丙氨酸 ） 22號(hào)管反應(yīng)樣液（ 丙氨酸 ） 33號(hào)管反應(yīng)樣液 44號(hào)管反應(yīng)樣液（ 丙氨酸 、谷氨酸） 5標(biāo)準(zhǔn)樣液：丙氨酸 6標(biāo)準(zhǔn)樣液：谷氨酸,圖1層析濾紙示意圖,5.5cm,1cm, 展層、顯色 將下端剪成須狀,卷成的“燈芯”，然后將上端插入層析濾紙圓心處的小孔中, 平放在盛有展層溶劑的康氏皿中,使“燈芯”下端須狀浸入展層溶劑中,再在濾紙上蓋上另一康氏皿（圖2）。展層劑沿?zé)粜纳仙綖V紙,再向四周擴(kuò)散,待溶劑前沿距康氏皿外槽內(nèi)緣0.5cm(約需半小時(shí))，取出濾紙，用鑷子拔出燈心，濾紙用電吹風(fēng)吹干，再用噴霧器向?yàn)V紙均勻噴灑0.1%茚三酮乙醇溶液，用電吹風(fēng)熱風(fēng)吹干或放入烘箱（80 ）中顯色3min。,4,3,2,圖2層析裝置示意圖,1. 康氏皿 2. 展層溶劑 3. “燈芯” 4. 層析濾紙,1,谷氨酸,丙氨酸,丙氨酸,氨基酸樣品的分離圖譜,溶劑前沿,原點(diǎn),6,5,1,2,3,4,氨基酸樣品的分離圖譜,六、結(jié)果分析討論 七、思考題 1.為什么要設(shè)計(jì)4支反應(yīng)管？每管所要說明的問題是什么？ 2.