1、第十一章 電泳分離技術(shù),廣泛應用于各個科學領(lǐng)域的新型 分離技術(shù),概述,在電解質(zhì)溶液中，位于電場中的帶電離子在電場力的作用下，以不同的速度向其所帶電荷相反的電極方向遷移的現(xiàn)象，稱之為電泳。由于不同離子所帶電荷及性質(zhì)的不同，遷移速率不同，可實現(xiàn)分離。,1809年俄國物理學家Peiice首次發(fā)現(xiàn)電泳現(xiàn)象，他在濕粘土中插上帶玻璃管的正負兩個電極，加電壓后發(fā)現(xiàn)正極玻璃管中原有的水層變渾濁，即帶負電荷的粘土顆粒向正極移動，這就是電泳現(xiàn)象。 1909年Michaelis首次將膠體離子在電場中的移動稱為電泳。他用不同pH的溶液在U形管中測定了轉(zhuǎn)化酶和過氧化氫酶的電泳移動和等電點。 1937年，Tiselius

2、(瑞典)將蛋白質(zhì)混合液放在兩段緩沖溶液之間，兩端施以電壓進行自由溶液電泳，第一次將人血清提取的蛋白質(zhì)混合液分離出白蛋白和、球蛋白。,第一次的自由溶液電泳；第一臺電泳儀； 1948年，獲諾貝爾化學獎；,由于早期的電泳儀價格昂貴，分辨率低，易產(chǎn)生對流，因而逐漸發(fā)展起了區(qū)帶電泳。 自由界面電泳：又稱移動界面電泳，是指在沒有支持介質(zhì)的溶液中進行的電泳。其裝置復雜，價格昂貴，費時費力，不便于推廣應用。 區(qū)帶電泳是指在電泳遷移中以一個緩沖溶液飽和了的固相介質(zhì)作為支持介質(zhì)，減少外界干擾的電泳技術(shù)。 凝膠電泳和等電聚焦電泳由于其明顯的優(yōu)越性，得到了越來越廣泛的應用。,電泳分析的特點,各種電泳技術(shù)具有如下特點：

3、 凡是帶電物質(zhì)均可應用某一電泳技術(shù)進行分離，并可以進行定性或定量分析； 樣品量極少； 設(shè)備簡單，可在常溫下進行； 操作簡單省時； 分辨率高。已被廣泛應用于基礎(chǔ)理論研究，臨床診斷及工業(yè)制造等方面。,電泳技術(shù)圍繞制膠、電泳、染色三個技術(shù)環(huán)節(jié)，不斷改進，以實現(xiàn)下列目標： 1、提高分辨率及靈敏度。 2、簡化操作，縮短電泳時間。 3、擴大應用范圍。,電泳的分類,1.電泳按其分離原理不同，分為區(qū)帶電泳、移動界面電泳、等速電泳、等電聚焦電泳等。 區(qū)帶電泳 自由界面電泳 等速電泳： 需使用專用電泳儀，當電泳達到平衡后，各電泳區(qū)帶相隨，分成清晰的界面，并以等速向前運動。 等電聚焦電泳： 由兩性電解質(zhì)在電場中自動

4、形成pH梯度，當被分離的生物大分子移動到各自等電點的pH出聚集成很窄的區(qū)帶。,2.電泳按支持介質(zhì)的不同，分為紙電泳、醋酸纖維薄膜電泳、瓊脂凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳、SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳等。 3.電泳按支持介質(zhì)形狀的不同，分為薄層電泳、板電泳、柱電泳等。 4.按用途不同可分為分析電泳、制備電泳、定量免疫電泳、連續(xù)制備電泳等。 5.按所用電壓不同可分為： 低壓電泳：100v500v，電泳時間較長，適于分離蛋白質(zhì)等生物大分子。 高壓電泳：1000v5000v，電泳時間短，有時只需幾分鐘，多用于氨基酸、多肽、核苷酸和糖類等小分子物質(zhì)的分離,影響電泳速度的因素,顆粒性質(zhì)：直徑、形狀、靜電荷。 電

5、場強度：電場強度越高，帶電顆粒的泳動速度越快常壓：2-10V/cm 溶液性質(zhì)：電極溶液和蛋白質(zhì)樣品溶液pH、離子強度、溶液黏度。 電滲：液體對固體支持物的相對移動。顆粒運動的方向與電滲方向一致時，加快顆粒的遷移率。反之亦然。 支持介質(zhì)的篩孔,V: 泳動速度cm/秒or分 d: 泳動距離cm t: 電泳時間 (秒/分) E: 電場強度 伏特/cm,u: 泳動率or泳動度(cm/伏秒or分) U: 電壓 常壓(100500v) 高壓(50010000v)僅需幾分鐘 l: 支持場的長度 (有效長度),遷移率(mobility) ： 帶電顆粒在單位電場強度下的泳動速度.,凝膠電泳,主要介質(zhì)為瓊脂糖和聚

6、丙烯酰胺凝膠 瓊脂糖篩分作用小，適于大分子物質(zhì) 聚丙烯酰胺分離效果好，分辨率高，適于小分子物質(zhì),聚丙烯酰胺,聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)是一種利用人工合成的凝膠作為支持介質(zhì)的區(qū)帶電泳。聚丙烯酰胺凝膠是由單體丙烯酰胺和交聯(lián)劑N，N甲叉雙丙烯酰胺經(jīng)過聚合交聯(lián)從而形成的三維空間凝膠網(wǎng)絡。 PAGE具有電泳和分子篩的雙重作用。 PAGE是目前最常用的電泳方法。,原理,以孔徑大小不同的聚丙烯酰胺凝膠為支持物，采用電泳基質(zhì)的不連續(xù)體系（即凝膠層、緩沖液離子成分、PH、電位梯度均不連續(xù)），使樣品在不連續(xù)的兩層凝膠之間積聚濃縮成很窄的樣品區(qū)帶（厚度為0.1毫米），然后再進行分離，從而提高了分辨率。,聚丙烯酰

7、胺凝膠電泳的特點,設(shè)備簡單 樣品量?。?-100微克） 時間短（30-60分鐘） 操作方便 分離范圍廣（多肽，蛋白，多糖等） 可提高靈敏度改為超微量測定（10-1210-9） 可用于蛋白質(zhì)分子量測定,凝膠特性,機械性能、彈性、孔徑大小等。 T單體的總百分濃度 C交聯(lián)百分濃度 a丙烯酰胺的克數(shù) b亞甲基雙丙烯酰胺克數(shù) m體積,聚丙烯酰胺凝膠的有效孔徑取決于總濃度，隨濃度的增加而降低。,有效孔徑?jīng)Q定蛋白質(zhì)的分離,聚合方式,光聚合：核黃素為催化劑(陽光,日光)，制大孔膠。 化學聚合：制小孔膠。 過硫酸銨 APS (引發(fā)劑) N,N,N,N-四甲基乙二胺 TEMED (加速劑) 被激活的單體和未被激活

8、的單體開始了多聚鏈的延伸，正在延伸的多聚鏈也可以隨機地接上雙丙稀酰胺，使多聚鏈交叉互連成為網(wǎng)狀立體結(jié)構(gòu)，最終多聚鏈聚合成凝膠狀。,特別注意,丙烯酰胺和亞甲基雙丙烯酰胺對中樞神經(jīng)系統(tǒng)有損傷作用. 丙烯酰胺和亞甲基雙丙烯酰胺要避光保存. 混合的溶液保存不宜超過一個月.,瓊脂糖凝膠電泳,（一）優(yōu)點 1.因不含硫酸根和羧基，幾乎消除了瓊脂的電滲 2.對蛋白質(zhì)吸附極微，故無拖尾現(xiàn)象。 3.凝膠結(jié)構(gòu)均勻，孔徑較大，可用來分離酶的復合物、核酸、病毒 等大分子物質(zhì)。 4.透明度較好，可直接或干燥成薄膜后進行染色。 5.不吸收紫外光，可直接利用紫外光吸收法作定量測定 6.有熱可逆性,（二）缺點 1.易破碎，濃度

9、不能太低。 2.易被細菌污染，不易保存，臨用前配制。 3.瓊脂糖支持層上的區(qū)帶易于擴散，電泳后必須立即固定染色。 4.與PAGE相比，分子篩作用小，區(qū)帶少。,主要性能指標,電內(nèi)滲 膠凝溫度 熔化溫度 凝膠強度 脫水收縮作用,瓊脂糖的選擇,凝膠電泳的應用常規(guī)聚丙烯酰胺電泳,分子篩效應提高了分辨率 各種大分子的分離 研究生物大分子的特性 可保持分離物的生物活性,緩沖系統(tǒng)的選擇,pH值由于影響蛋白質(zhì)的解離，在電泳過程中具有重要作用 離子強度既要起到緩沖作用，同時還需產(chǎn)熱少，對電流相對貢獻小。一般選用較低的離子濃度。 凝膠濃度的選擇在于選擇合適的孔徑。 濃縮膠分離膠 均一膠梯度膠 染色方法常用考馬斯亮

10、藍、溴酚藍等。,理想顯色劑的7S 安全（safety） 靈敏（sensitivity） 簡單（simplicity） 特異性（specificity） 快速（speed） 穩(wěn)定（stability） 兼容性（synergy）,考馬斯亮藍R250：靈敏度是氨基黑10B的5倍，但不適用與酸溶蛋白、醇溶蛋白。 考馬斯亮藍G250：靈敏度不如R250，但不溶于酸性溶液。 考染靈敏度為30100ng，線性范圍是20倍.,銀染法,機制：將蛋白質(zhì)帶上的硝酸銀（銀離子）還原成金屬銀，使銀顆粒沉積在蛋白帶上。銀染蛋白的吸光度與他們的濃度成線性關(guān)系。 蛋白質(zhì)的染色程度與蛋白質(zhì)上的特殊基團有關(guān)，堿性和含硫氨基酸的存

11、在對染色有貢獻。 銀染應先固定，固定的作用有兩個：第一是把蛋白質(zhì)固定在凝膠中阻止擴散。第二為了除去干擾染色的物質(zhì)，如去污劑、還原試劑和緩沖液中的成分（甘氨酸）。固定劑有戊二醛、乙醇、甲醇醋酸、三氯醋酸。 染色分為雙胺銀染和非雙胺銀染。 銀染的線性范圍是40倍，靈敏度是考染的100倍。,雙胺銀染過程： 1. 膠在50%甲醇中浸泡至少1小時. 2. 配制溶液A 0.8克硝酸銀到4毫升無離子水。B21毫升0.36% 氫氧化鈉和1.4毫升14.8摩爾的氫氧化胺. 3. 將A滴到B中，用無離子水加至100毫升，此溶液臨用前配制，染色15分鐘. 4. 無離子水漂洗5分鐘. 5. 顯色液：2.5毫升1%檸檬

12、酸與0.25毫升37%甲醛混合，加無離子水至500毫升。顯色約10分鐘，蛋白帶出現(xiàn)。 6. 無離子水漂洗后用50%甲醇終止顯色。,十二烷基硫酸鈉（SDS）的聚丙酰胺凝膠電泳是最常用的定性分析蛋白質(zhì)的電泳方法，特別是用于蛋白質(zhì)純度檢測和測定。,SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳,SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳的基本原理是SDS能和蛋白質(zhì)結(jié)合并使蛋白質(zhì)帶有大量的負電荷，大大超過其原來所帶電荷，從而使各天然蛋白質(zhì)分子間的電荷差別消除；同時通過斷裂分子內(nèi)和分子間的氫鍵，蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)也在SDS作用下變得松散，形狀趨于一致。排除了電泳過程中電荷的影響，使SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳時，蛋白質(zhì)遷移率的差異僅是相對分子質(zhì)量的函數(shù)

13、。,原理,在一定范圍內(nèi)，電泳遷移率與相對分子質(zhì)量的對數(shù)呈線性關(guān)系。 測定蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量時，用已知相對分子質(zhì)量的蛋白質(zhì)與被測樣品在同一條件下進行電泳，最后計算出被測樣品的分子量。 由于蛋白質(zhì)與SDS的結(jié)合對電泳影響顯著，因此需要注意SDS單體濃度、離子強度等影響因素。 用SDS-凝膠電泳法測定分子量，每次測定樣品必須同時做標準曲線，而不得利用另一次電泳的標準曲線。,蛋白質(zhì) Z 在左邊的 native-PAGE 中無法向下泳動，但在右邊的 SDS-PAGE 則可以依其分子量正確泳動；因此一般使用上，SDS-PAGE 的應用較廣泛。 在 SDS-PAGE 下，雖然 X 分子被解析成單元體，因此分

14、子量由 160 kD 變成 40 kD；但若在較溫和的樣本處理件下，有可能看到未完全解析的 160 kD 蛋白質(zhì)色帶。,Staking gel,Separating gel,該方法可選擇的緩沖液范圍較廣，主要影響蛋白質(zhì)分離效率和電泳速度。,由于無電荷濃度的影響，因此凝膠濃度選擇成為關(guān)鍵因素。,等電聚焦,等電聚焦（isoelectric focusing，IEF）是60年代中期問世的一種利用有pH梯度的介質(zhì)分離等電點不同的蛋白質(zhì)的電泳技術(shù)。由于其分辨率可達0.01pH單位，因此特別適合于分離分子量相近而等電點不同的蛋白質(zhì)組分。,蛋白質(zhì)是帶有電荷的兩性生物大分子，其正負電荷的數(shù)量隨所處環(huán)境酸堿度的

15、變化而變化。在電場存在下的一定pH溶液中，帶正電的蛋白分子將向負極移動而帶負電的蛋白分子將向正極移動，在某一pH時，蛋白分子在電場中不再移動，此時的pH值即為該蛋白質(zhì)的等電點。 等電聚焦(IEF）電泳就是在凝膠中加入兩性電解質(zhì)從而構(gòu)成從正極到負極pH逐漸增加的pH梯度，處在其中的蛋白分子在電場的作用下運動，最后各自停留在其等電點的位置上，測出蛋白分子聚焦位置的pH值，便可以得到它的等電點。,雙向電泳,1975年，OFarrell 首先運用雙向電泳技術(shù)將大腸桿菌總蛋白分離出1100多個蛋白點。后來此技術(shù)一直用于原核生物和真核生物總蛋白的分離。目前，隨著蛋白組工程的發(fā)展，雙向電泳技術(shù)越來越廣泛的用

16、于發(fā)現(xiàn)未知蛋白。 雙向電泳由第一向等電聚焦(IEF)電泳和第二向SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)組成，第一向使等電點不同的蛋白得到分離，第二向使分子量不同的蛋白得到分離，兩向結(jié)合便得到高分辨率的蛋白圖譜。,雙向電泳具有一些明顯的優(yōu)點 可在不同電泳技術(shù)的基礎(chǔ)上構(gòu)建雙向電泳,雙向電泳的應用,低豐度蛋白質(zhì)的檢測 蛋白質(zhì)檢測和分析 蛋白質(zhì)組學和代謝組學,毛細管電泳,毛細管電泳（capillary elecrophoresis, CE）是以高壓電場為驅(qū)動力，以毛細管為分離通道，依據(jù)樣品中各組分之間淌度和分配行為上的差異而實現(xiàn)分離分析的液相分離方法。 高效毛細管電泳在技術(shù)上采取了兩項重要改進：采用了0.05mm內(nèi)徑的毛細管；采用了高達數(shù)千伏的電壓。,電極槽和進樣系統(tǒng),清洗系統(tǒng),毛細管,檢測器,鉑電極,電極槽,恒溫系統(tǒng),記錄和數(shù)據(jù)處理,毛細管電泳的特點,柱效高，可達105106/m 分離速度快，幾十秒幾十分鐘 溶劑和試樣消耗極少 沒有高壓泵，儀器成本比HPLC更低 選擇性強,檢測器,紫外/可見光檢測器 安培檢測器 MS,應用,測序