1、糖生物學(xué),第十章 糖基化工程,糖基化工程,糖基化工程的含義和意義 影響糖基化的因素 糖基化工程的手段 糖基化的監(jiān)測 常用表達(dá)體系的糖基化特點 糖基化工程技術(shù)及其應(yīng)用,Protein Market (2000),EPO2005年銷售額超過百億美元,Biogenerics: expiry date of patent and market,貧血,貧血是指循環(huán)中紅細(xì)胞的數(shù)量和血紅蛋白濃度低于正常值，不足以維持血液組織正常氧和作用的代償機制病癥。最常見的是缺鐵性貧血、再生障礙性貧血、巨幼細(xì)胞性貧血、溶血性貧血等。 治療 (Pre-1989): 紅細(xì)胞療法（輸血，連同維生素和礦物質(zhì)）。 問題: 對某些貧

2、血不太有效。,Erythropoietin，EPO,美國Amgens 于1989年開發(fā)了Epogen（recombinant human erythropoietin，rhEPO） 促紅細(xì)胞生成素 (erythropoietin, EPO) 水平在經(jīng)歷了化學(xué)療法的癌癥患者體內(nèi)很低（尤其是腎衰竭者）。EPO可以刺激紅細(xì)胞的生成， 并具有神經(jīng)保護(hù)劑功能。 適應(yīng)癥: 紅細(xì)胞生成不足引起的貧血 (來自腫瘤化療、AIDS、慢性腎衰竭等),Erythropoietin Drug development,First cloned and expressed in bacteria: E. coli Bact

3、erial EPO is fully active: binds to tightly to the EPO receptor stimulates erythroid development has different binding kinetics than native hEPO while bacterial rhEPO is 500-fold less effective in vivo,N-linked glycans on EPO,High mannose N-glycansComplex N-glycans no sialic acid3-4 sialic acid term

4、ini no negative charges3-4 negative charges,Sialic acid modication varies from 0-4 residues per N-glycan,3條N-糖鏈均為復(fù)雜型,have different numbers of glycosylation and sialation sites (%),Different Biotech Formulation,Some hrEPOs with varying sites of glycosylation (a post-translation modification of prote

5、in) outlast others.,Amgens Biotech Business,Amgen的兩大拳頭產(chǎn)品： erythropoietin Epogen (epoetin alpha) colony stimulating factor Neupogen (filgrastim). 繼Epogen后開發(fā)的新一代EPO產(chǎn)品仍是市場領(lǐng)軍者： Aranesp (darbepoetin alpha) ：增加了兩個Asn，使每分子EPO的唾液酸基團(tuán)數(shù)量增加到22個。 Neulasta (pegfilgrastim)：對Neupogen進(jìn)行PEG化修飾,PharmaFocus 2003,重組表達(dá)的藥

6、用糖蛋白,世界生物醫(yī)藥市場主要品種大多為糖蛋白：rhEPO、GM-CSF、tPA等。全球產(chǎn)值約數(shù)百億美元。 糖蛋白中的糖鏈對于藥物在體內(nèi)的穩(wěn)定性、活性、靶向性及藥代動力學(xué)有顯著的影響，因此在開發(fā)這類藥物時控制其糖基化具有較大的重要性。大多數(shù)情況下，對產(chǎn)品的糖基化必須予以優(yōu)化和質(zhì)量控制。,唾液酸化程度對EPO活性的影響,天然的和重組的EPO含有三條唾液酸化的復(fù)雜型N-糖鏈。 唾液酸化程度對EPO的體內(nèi)半衰期有很大影響。 培養(yǎng)基pH、前體或營養(yǎng)成分的可利用性、不同細(xì)胞因子和激素的存在、細(xì)胞株中糖基轉(zhuǎn)移酶和糖苷酶活性的強弱等因素均能影響培養(yǎng)細(xì)胞產(chǎn)物糖基化程度、分支程度、唾液酸化程度、硫酸化程度等。,

7、酶替代療法中溶酶體酶的靶向,溶酶體貯積性疾病 Gauchers disease（葡萄糖腦苷脂酶缺陷）的酶替代療法需要通過細(xì)胞表面的Man受體靶向到巨噬細(xì)胞的溶酶體。 可由哺乳動物生成的含有N-聚糖的酶經(jīng)糖苷酶（唾液酸酶、半乳糖苷酶、己糖胺酶等）降解產(chǎn)生。 也可由桿狀病毒-昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)加工生產(chǎn)。,糖基化工程的目的,控制蛋白質(zhì)上的寡糖鏈加工，使其 增加合成及分泌的效率 增加溶解度 延長體內(nèi)半衰期：如rhEPO的Sia基團(tuán) 增強對抗蛋白酶的穩(wěn)定性 增加生物活性 降低抗原性 靶向?qū)耄喝缭诿柑娲煼ㄖ腥苊阁w酶的靶向 有助于蛋白質(zhì)的純化等,影響糖基化的因素,多肽鏈自身結(jié)構(gòu) 潛在糖基化位點的分布和數(shù)目

8、 蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu) 宿主系統(tǒng)糖基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá) 細(xì)胞培養(yǎng)的環(huán)境條件,糖基化工程的手段,體內(nèi)控制 利用不同表達(dá)系統(tǒng)的糖基化差異 利用基因工程改變肽鏈上的糖基化位點 與GPI信號肽融合表達(dá) 重組表達(dá)糖基轉(zhuǎn)移酶和糖苷酶等 體外修飾 利用天然的和合成的糖基化抑制劑 利用糖苷酶切除不需要的糖基 體外合成糖鏈 精確控制培養(yǎng)條件,常用表達(dá)系統(tǒng)的糖基化差異（一）,原核表達(dá)體系： 對重組蛋白不能糖基化 真核表達(dá)體系： 酵母： 釀酒酵母：過度甘露糖基化。需進(jìn)行改造。 甲醇營養(yǎng)型酵母：Pichia pastoris; Hansenula polymorph：與哺乳動物接近 絲狀真菌：表達(dá)異源蛋白比較困難,酵母表達(dá)產(chǎn)物

9、的糖型,常用表達(dá)系統(tǒng)的糖基化差異（二）,昆蟲細(xì)胞/桿狀病毒： 應(yīng)用廣泛的真核表達(dá)體系。但其生產(chǎn)的重組糖蛋白一般僅具有高甘露糖或寡甘露糖型糖鏈，難以生成復(fù)雜型糖鏈成為該系統(tǒng)的缺陷之一。 轉(zhuǎn)基因植物：表達(dá)哺乳動物糖蛋白具有較高免疫原性 哺乳動物細(xì)胞： 廣泛應(yīng)用的CHO細(xì)胞株。 具有多種糖基化突變株。 轉(zhuǎn)基因動物： 器官專一性。 需與乳汁中的其他寡糖分離。,植物糖蛋白中復(fù)雜型N-聚糖結(jié)構(gòu),結(jié)構(gòu)的不同導(dǎo)致植物N-糖鏈具有高免疫原性 核心1,3Fuc（哺乳動物中主要為1,6Fuc） 1,2Xyl 能否合成Sia末端尚不清楚 植物的糖基化工程改造 缺失GlcNAcT-1基因 敲除某些糖基轉(zhuǎn)移酶 使重組蛋白

10、C端帶有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號H/KDEL,重組rhEPO的糖基化,糖基化位點 糖鏈結(jié)構(gòu)和功能 表達(dá)體系對糖基化的影響 培養(yǎng)條件對糖基化的影響 糖基化的檢測與質(zhì)量控制,rhEPO糖基化程度的檢測,SDS-PAGE（表觀分子量） 等電聚焦電泳 高效液相色譜（HPLC） 核磁共振（1HNMR） 質(zhì)譜（MS） 凝集素法（Lectin-binding assays for the isoforms of human erythropoietin: comparison of urinary and four recombinant erythropoietins. Journal of Endocrinolo

11、gy, Vol 150, Issue 3, 401-412） ： 雞冠刺桐凝集素(Erythrina cristagalli agglutinin，ECA);與無唾液酸末端的具有Gal beta1-4GlcNAc 外鏈的糖連結(jié)合 朝鮮槐白血球凝集素(Maackia amurensis leukoagglutinin，MAL)：NeuAc alpha 2-3Gal beta 1-4GlcNAc,SDS-PAGE檢測rhEPO的糖基化,BACK,思考,糖鏈在糖復(fù)合物中的功能 糖基化工程的技術(shù)和應(yīng)用基因工程技術(shù) 糖基化的檢測糖鏈分析方法 rhEPO綜合應(yīng)用實例,糖生物學(xué),第十一章 糖生物學(xué)在醫(yī)藥、工

12、農(nóng)業(yè)中的應(yīng)用,糖生物學(xué)對醫(yī)藥領(lǐng)域的啟示,醫(yī)學(xué) 早期診斷：凝集素，糖芯片 藥物設(shè)計 抗細(xì)胞粘附：精卵結(jié)合，炎癥反應(yīng) 抗感染 抗腫瘤轉(zhuǎn)移 抗凝血 酶替代療法治療糖合成和代謝酶缺陷性疾病 酶抑制劑干擾有害糖代謝：糖尿病 提高靶向性 。 農(nóng)藥設(shè)計 殺真菌：干擾真菌細(xì)胞壁合成 殺蟲：干擾昆蟲體內(nèi)特殊糖的代謝 激活植物自衛(wèi)系統(tǒng)：寡糖素 重組蛋白類藥物的糖基化工程 天然藥物的糖基雜化、糖的酶法合成 。,糖生物學(xué)對醫(yī)藥領(lǐng)域的啟示,寡糖類藥物 分子和細(xì)胞識別抑制劑： 病原性微生物及毒素的抑制劑：分子小，可溶，可經(jīng)呼吸道或腸道進(jìn)入人體 抗炎癥藥物 精卵結(jié)合抑制劑 免疫增強劑：-葡聚糖 疫苗：細(xì)菌疫苗，腫瘤疫苗 糖

13、酶抑制劑：唾液酸酶抑制劑，阿卡波糖等 重組類糖蛋白藥物 延長體內(nèi)半衰期 提高藥物的靶向性 治療用蛋白聚糖：抗凝血、聚透明質(zhì)酸等 器官移植急性排斥中的糖生物學(xué) 中草藥活性成分,寡糖類抗感染藥物,可口服或氣管給藥，不需注射 病原性微生物及毒素的抑制劑,寡糖類疫苗藥物,細(xì)菌的糖疫苗：如Hib疫苗，使Hib感染發(fā)病率下降95%。 腫瘤的糖疫苗： 黑色素瘤、乳腺癌：GM2, GD2與蛋白載體綴合 乳腺癌：Sialyl 2-6GalNAc -（唾液酸Tn抗原） 對選凝素介導(dǎo)的白細(xì)胞穿行的抑制： SiaLex FucTVII酶抑制劑 抑制腫瘤轉(zhuǎn)移：硫酸乙酰肝素抑制劑,擬糖類糖酶抑制劑藥物,N-糖鏈加工中的酶,寡糖類酶抑制劑作為藥物,-葡萄糖苷酶抑制劑治療糖尿病的原理,糖尿病藥物中的糖基化抑制劑, -葡萄糖苷酶抑制劑研究現(xiàn)狀 競爭性抑制劑：阿卡波糖、米格列醇等 非競爭性抑制劑（少）：染料木素等黃酮類物質(zhì) 蛋白質(zhì)非酶糖基化抑制劑研究現(xiàn)狀 氨基胍、鹽酸二甲