1、第三節(jié) 提取分離方法,一、中草藥有效成分的提取 提?。褐高x擇適當(dāng)?shù)娜軇┖瓦m當(dāng)?shù)姆椒ǎ瑢⑺某煞秩芙獬鰜?lái)并同原料脫離的過(guò)程。,(一) 提取分離前的準(zhǔn)備,動(dòng)植物的拉丁學(xué)名 產(chǎn)地 藥用部位 采集時(shí)間與方法 系統(tǒng)查閱文獻(xiàn),（二）常用溶劑的特點(diǎn),環(huán)己烷，石油醚，苯，二氯甲烷，氯仿，乙醚， 乙酸乙酯，正丁醇，丙酮，乙醇，甲醇，水 極性： 親脂性： 親水性：,環(huán)己烷，石油醚，苯，二氯甲烷，氯仿，乙醚，乙酸乙酯，正丁醇，丙酮，乙醇，甲醇，水,比水重的有機(jī)溶劑：,二氯甲烷，氯仿,能與水分層的極性最大的有機(jī)溶劑：,正丁醇,與水分層的有機(jī)溶劑：,環(huán)己烷-正丁醇,與水可以以任意比例混溶的有機(jī)溶劑：,丙酮-甲醇,極性

2、最大的有機(jī)溶劑：,甲醇,常用來(lái)從水中萃取苷類、水溶性生物堿類的有機(jī)溶劑：,正丁醇,（三）提取方法：,提取方法,溶劑提取法,水蒸氣蒸餾法,升華法,(應(yīng)用最廣),1. 溶劑提取法：,相似相溶原理,（1）溶劑提取法原理：,（2）提取溶劑的選擇原則：, 對(duì)所提取成分溶解度大，對(duì)雜質(zhì)溶解度小 不與提取成分起化學(xué)變化 經(jīng)濟(jì)、易得、使用安全,（3）影響溶劑提取法提取效率的因素:, 原料粉碎度 提取時(shí)間 提取溫度 設(shè)備條件,溶劑提取法,（4）溶劑提取法分類,浸漬法,滲漉法,煎煮法,回流提取法,連續(xù)回流提取法,以水或稀醇在常溫下浸泡提取,滲漉筒,用水加熱煮沸提取,有機(jī)溶劑,在回流裝置中加熱提取,以索氏提取器（或

3、稱脂肪抽出器）回流提取,滲漉法,冷提-浸漬法、滲漉法： 適用于熱不穩(wěn)定的化合物,回流提取法,連續(xù)回流提取法,粉碎原料 放在濾紙筒內(nèi) 置于提取器中 加熱盛有溶劑圓底燒瓶 溶劑沸騰 蒸氣通過(guò)提取器的導(dǎo)氣管上升 冷凝滴入提取器中 當(dāng)溶劑面超過(guò)虹吸管的最高處時(shí)，含有萃取物的溶劑虹吸回?zé)?，因而萃取出一部分物質(zhì)，如此重復(fù)。,索氏提?。豪萌軇┗亓骷昂缥?各種溶劑提取法的特點(diǎn)比較,超臨界提取法(Supercritical Fluid Extraction，SFE),超臨界流體（SF）：指處于臨界溫度（Tc）和臨界壓力（Pc）以上，介于氣體和液體之間的、以流動(dòng)形式存在的物質(zhì)。 超臨界提取法利用溶劑在超臨

4、界條件下特殊的流體性能對(duì)樣品進(jìn)行提取。,超臨界提取法,選用超臨界流體（SF）替代有機(jī)溶劑的特點(diǎn)： 可在低溫下提取，“熱敏性”成分尤其適用 無(wú)溶劑殘留，對(duì)作為制劑的中藥提取物的提取是一大優(yōu)勢(shì) 提取與蒸餾合為一體，無(wú)需回收溶劑 具選擇性分離 設(shè)備昂貴，需專業(yè)人員操作,超聲提取法,物理過(guò)程。 超聲波引起液體介質(zhì)的振動(dòng)，并且通過(guò)空化現(xiàn)象，造成植物細(xì)胞壁及整個(gè)生物體破裂； 溶液滲透到藥材細(xì)胞中，加速成分的溶解。,微波提取法,穿透性強(qiáng)，選擇性高， 加熱效率高，操作簡(jiǎn) 便。 缺點(diǎn)：成分變化、生物 活性變化。,2. 水蒸氣蒸餾法：,適用于具有揮發(fā)性、能隨水蒸汽蒸餾而不被破壞，難溶或不溶于水的成分的提取。 如揮

5、發(fā)油、小分子的香豆素類、小分子的醌類成分的提取。,3.升華法（sublimation）,固體物質(zhì)受熱不經(jīng)過(guò)熔融，直接 變成蒸汽，遇冷后又凝固為固態(tài)，稱為升華。 中草藥中有一些成分具有升華的性質(zhì)，可以利用升華法直接自中草藥中提取出來(lái)。如樟腦、咖啡因。,二、中草藥有效成分的分離與精制,（一）根據(jù)物質(zhì)溶解度差別進(jìn)行分離 結(jié)晶及重結(jié)晶法（溫度不同，溶解度不同） 沉淀法 溶劑沉淀法（改變?nèi)芤旱臉O性去雜，水提醇沉） 酸堿酸堿法（酸提堿沉法：生物堿） （堿提酸沉法：黃酮、蒽醌類酚酸性成分） 沉淀試劑（如鉛鹽沉淀法）,（二）根據(jù)物質(zhì)在兩相溶劑中的分配比不同 進(jìn)行分離,1. 液-液萃取法 （1） 原理：利用混合

6、物中各成分在兩相互不相溶的溶劑中分配系數(shù)的不同而實(shí)現(xiàn)分離。 （2） 分配系數(shù)K值（即分配比）： K = CU/CL CU、CL分別表示溶質(zhì)在上相和下相溶劑中的濃度。,（3）分離因子： = KA/KB (注：KAKB） 可表示分離的難易 100，一次簡(jiǎn)單萃取即可分離 10010時(shí)，需萃取10-12次，CCD法。 2時(shí)，需100次以上萃取才能完成，DCCC法。 1時(shí)， KAKB，意味著兩者性質(zhì)相似， 無(wú)法實(shí)現(xiàn)萃取分離,可以根據(jù)紙色譜法計(jì)算值，選擇理想的分配條件 = = = Rfa、Rfb為A、B兩物質(zhì)在PC上Rf值。,KA,KB,1/r( ),Rfa 1-Rfa,1/r( ),Rfb 1-Rfb,

7、Rfa(1-Rfb) Rfb(1-Rfa),（4）分配比與pH,酸性、堿性及兩性化合物，PH可改變它們的存在狀態(tài)（游離型或解離型），影響在溶劑系統(tǒng)中的分配比。 酚類 pKa值 9.2-10.8 羧酸類 pKa值 約5 PH12，酸性物質(zhì)呈解離狀態(tài)（A） 堿性物質(zhì)呈非解離狀態(tài)（B）存在,HA+H2O A- +H3O+ Ka= PKa=PH-lgA-/HA PH=Pka+lgA-/HA HA達(dá)到99%解離時(shí)，PH=Pka+2 HA達(dá)到99%游離時(shí)，PH=Pka-2,A-H3O+ HA,試樣水溶液,水相堿性解離,有機(jī)相,PH 3，有機(jī)溶劑提,PH 12，有機(jī)溶劑提,水相,有機(jī)相,堿性物質(zhì),PH 9，

8、有機(jī)溶劑提,水相酸性強(qiáng)解離,有機(jī)相酸弱非解離,水相酸弱解離,有機(jī)相,中性物質(zhì),PH 6,有機(jī)溶劑提,水相,有機(jī)相,（酚等酸性物質(zhì)）,PH 3，有機(jī),水相,有機(jī)相,（有機(jī)酸等）,PH12，酸性物質(zhì) 解離（A） 堿性物質(zhì) 非解離（B）,（糖類、中性物質(zhì)、兩性物質(zhì)）,酸性非解離,PH 13，有機(jī),2. 逆流分溶法（CCD法）：,多次、連續(xù)的液-液萃取分離過(guò)程，可用于分離因子值小的萃取分離。 條件溫和，樣品易回收，適用于中等極性、不穩(wěn)定物質(zhì)的分離。,液滴逆流色譜 (DCCC),液滴逆流色譜 (DCCC)：流動(dòng)相呈液滴形式垂直上升或下降，通過(guò)固定相的液柱，實(shí)現(xiàn)物質(zhì)的逆流色譜。（特別適合皂苷類的分離） 優(yōu)

9、點(diǎn)：克服固體載體引起的不可逆吸附消耗、試樣變性污染及色譜峰脫尾現(xiàn)象。,液滴逆流色譜DCCC,流動(dòng)相液滴垂直上下，經(jīng)過(guò)固定相液,高速逆流色譜(HSCCC)：,依靠聚四氟乙烯蛇形管的方向性及高速行星式旋轉(zhuǎn)產(chǎn)生離心力 使無(wú)載體支持的固定相保留在蛇形管內(nèi)，并使流動(dòng)相單向、低速通過(guò)固定相，實(shí)現(xiàn)連續(xù)逆流萃取分離物質(zhì)的目的。,3. 紙色譜（PC）：,原理：分配原理 支持劑：纖維素 固定相：水 流動(dòng)相：水飽和的有機(jī)溶劑 K = 1/r(Rf/1-Rf)（ r為紙層色譜定數(shù)） 若A、B兩種物質(zhì)的Rf值分別為Rfa，Rfb，則 Rfa（1Rfb）/ Rfb（1Rfa） (Rfa Rfb) 故紙色譜可為液-液萃取分

10、離提供指導(dǎo)。,4液-液分配柱色譜：,原理：分配原理 支持劑： 硅膠、硅藻土、纖維素粉等,（1）正相分配色譜：,固定相：極性大，如水、緩沖溶液 流動(dòng)相：極性小，如氯仿、乙酸乙酯、丁醇等 載體：硅膠（含水大于17%）、硅藻土、纖維素等 洗脫順序：化合物極性越小，越先出柱；極性越大，越后出柱。 應(yīng)用：通常用于分離水溶性或極性較大的成分，如生物堿、苷類、糖類、有機(jī)酸等化合物。,（2）反相分配色譜（固定相極性 流動(dòng)相）：,固定相：石蠟油、化學(xué)鍵合固定相 流動(dòng)相：水或甲醇等強(qiáng)極性有機(jī)溶劑 洗脫順序：化合物極性越大，越先出柱；極性 越小，越后出柱。 應(yīng)用：適合于分離脂溶性化合物，如高級(jí)脂肪 酸、油脂、游離甾

11、體等。,反相硅膠色譜色譜填料：,將普通硅膠鍵合上長(zhǎng)度不同的烴基（R）形成親脂性表面而成。 根據(jù)烴基（R）長(zhǎng)度（C2H5、C8H17、C18H37）分別命名為：RP-2、RP-8、RP-18。 親脂性強(qiáng)弱順序：RP-18 RP-8 RP-2。,RP-2,RP-8,RP-18,化學(xué)修飾,（3）液-液分配薄層色譜：,液-液分配色譜法可在硅膠薄層色譜上進(jìn)行。,分配柱色譜,最佳分離條件,注：正相柱用正相薄層色譜，反相柱用反相薄層色譜,4加壓液相柱色譜：,加壓液相柱色譜依所用壓力大小分為： 快速柱色譜（約2.02105Pa） Lobar低壓柱色譜（20.2105Pa）。,（三）根據(jù)物質(zhì)的吸附性差別進(jìn)行分離

12、,物理吸附:分子間力，無(wú)選擇性，可逆 化學(xué)吸附:化學(xué)鍵，選擇性較強(qiáng)， 常不可逆 半化學(xué)吸附:氫鍵，選擇性較弱， 多可逆,固液吸附,1物理吸附,基本規(guī)律：“極性相似者易于吸附” 基本特點(diǎn)：無(wú)選擇性、可逆吸附、快速 基本原理：吸附與解吸附的往復(fù)循環(huán) 三要素：吸附劑 、溶質(zhì)(被分離物)、溶劑,吸附,再吸附,解吸,再解吸,直至分離,（1）硅膠、氧化鋁為極性吸附劑，特點(diǎn)： 被分離物質(zhì)極性越強(qiáng)，吸附力越強(qiáng)。 溶劑極性越弱，吸附劑的吸附能力越強(qiáng)。溶劑極性的增強(qiáng)，吸附力減弱。 當(dāng)加入極性較強(qiáng)的溶劑后，先前被硅膠或氧化鋁所吸附的溶質(zhì)可被置換洗脫下來(lái)。,（2）非極性吸附劑：活性炭,對(duì)非極性物質(zhì)具有較強(qiáng)的親和力 在

13、水中對(duì)溶質(zhì)表現(xiàn)出強(qiáng)的吸附能力 從活性炭上洗脫被吸附的物質(zhì)時(shí)，溶劑的極性越小，洗脫能力越強(qiáng),2極性及其強(qiáng)弱判斷：,極性強(qiáng)弱是支配物理吸附過(guò)程的主要因素。 官能團(tuán)極性（按下列順序依次遞增）： CH2CH2，CH2=CH2，OCH3，COOR，C=O，CHO， R-CO-NH-，NH2，ROH，H2O，ArOH，COOH 溶劑的極性可大體根據(jù)介電常數(shù)的大小來(lái)判斷。 介電常數(shù)越大，極性越大。,3進(jìn)行硅膠或氧化鋁吸附柱色譜時(shí)需注意：, 用極性小的溶劑裝柱和溶解樣品，或用極性稍大的溶劑溶解樣品后，以少量吸附劑拌勻揮干，上柱。 最佳溶劑系統(tǒng)：Rf值=0.2-0.3。 為避免化學(xué)吸附，酸性物質(zhì)宜用硅膠、堿性物

14、質(zhì)宜用氧化鋁分離。 在分離酸性（或堿性）物質(zhì)時(shí)，洗脫劑中常加適量的醋酸（或氨、吡啶、二乙胺），防止拖尾。 吸附劑用量: 3060倍，有時(shí)100200倍,TLC,1,5 10,5聚酰胺吸附色譜法：,（1）原理：氫鍵吸附。 分子中的酰胺羰基與化合物的酚羥基 酰胺鍵上的游離胺基與羰基形成氫鍵締合 吸附強(qiáng)弱取決于各種化合物與之形成氫鍵締合的能力。,聚酰胺吸附層析原理,（2）吸附能力的強(qiáng)弱規(guī)律（在含水溶劑中）：, 形成氫鍵的基團(tuán)數(shù)目越多，則能力越強(qiáng)。 成鍵位置對(duì)吸附能力也有影響。易形成分子內(nèi)氫鍵者，其在聚酰胺上的吸附相應(yīng)減弱。 分子中芳香化程度高者，則吸附性增強(qiáng)；反之，則減弱。,（3）各種溶劑在聚酰胺柱

15、上的洗脫能力由弱到強(qiáng)的順序：,水 甲醇 乙醇 NaOH水溶液 甲酰胺 二甲基甲酰胺 尿素水溶液 最常應(yīng)用的洗脫系統(tǒng)是：乙醇-水,（4）應(yīng)用：, 特別適合于酚類、黃酮類化合物的制備和分離。 脫鞣質(zhì)處理 注意：對(duì)堿穩(wěn)定，對(duì)酸特別是無(wú)機(jī)酸穩(wěn)定性差 可溶于濃鹽酸、冰乙酸、甲酸中,6大孔吸附樹脂：,（1）組成：苯乙烯，二乙烯苯和致孔劑 （2）原理：吸附作用和分子篩作用（多孔）相結(jié)合。 （3）分類： 非極性:苯乙烯，二乙烯苯縮合而成（芳香吸附 樹脂） 中極性:含脂基的吸附樹脂 極 性:含酰胺基、氰基、酚羥基等極性基團(tuán)的 吸附樹脂,6大孔吸附樹脂：,一般非極性化合物在水中易被非極性樹脂吸附，極性化合物在水中

16、易被極性樹脂吸附。 物質(zhì)在溶劑中的溶解度大，樹脂對(duì)此物質(zhì)的吸附力就小，反之就大。 洗脫劑：最常用的是乙醇-水。 H2O洗：糖、水溶性色素 30%乙醇洗：極性較大成分 50%-75%乙醇洗：皂苷類成分 95%乙醇洗：極性較小成分,（四）根據(jù)物質(zhì)分子大小差別進(jìn)行分離,主要的幾種方法： 透析法：半透膜，分子篩濾過(guò)作用 超濾法：分子大小不同，擴(kuò)散速度不同 超速離心法：溶質(zhì)在超速離心作用下，沉降性和 浮游性不同 凝膠濾過(guò)法（分子篩濾過(guò)色譜或排阻色譜）：,（四）根據(jù)物質(zhì)分子大小差別進(jìn)行分離,1凝膠過(guò)濾法： 原理：分子篩原理 利用凝膠的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)分子篩的過(guò)濾作用將化合物按分子量大小不同進(jìn)行分離。 出柱順序

17、：分子量由大到小,葡聚糖凝膠Sephadex G-25,羥丙基葡聚糖凝膠Sephadex LH-20,羥丙基化,（3）凝膠的種類與性質(zhì)：,葡聚糖凝膠（Sephadex G）： 只適用于水中應(yīng)用，不同規(guī)格適合分離不同分子量的物質(zhì)，分離多糖、蛋白質(zhì)等。 數(shù)字表示葡聚糖凝膠的吸水量，數(shù)字吸水量10，如Sephadex G-25中的25表示吸水量為2.5ml/g,羥丙基葡聚糖凝膠（Sephadex LH-20 ）的特點(diǎn)： 具有分子篩特性 在水、極性有機(jī)溶劑及極性有機(jī)溶劑與水的混合物中均可使用，適用于各類化合物的分離。 在由極性與非極性溶劑組成的混合溶劑中常起到反相分配色譜的作用,（五）根據(jù)物質(zhì)解離程度不同進(jìn)行分離,原理：離子交換原理 固定相：離子交換樹脂（聚苯乙烯高分子化 合物，引入交換基團(tuán)） 流動(dòng)相：水或含水溶劑,1分類：,根據(jù)交換基團(tuán)不同分為： 陽(yáng)離子交換樹脂 強(qiáng)酸型（RSO3H+） 弱酸型（RCOOH+） 陰離子交換樹脂 強(qiáng)堿型RN+(CH3)3Cl 弱堿型（RNH2，仲胺、叔胺基）,交換原理：,R-SO3H+ + BH+ R-SO3BH+