1、第一章 植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室 及操作技術(shù),第一節(jié) 實(shí)驗(yàn)室設(shè)置及基本技術(shù) 第二節(jié) 組織培養(yǎng)所需的環(huán)境條件及營(yíng)養(yǎng)成分 第三節(jié) 培養(yǎng)基的配制與滅菌,第一節(jié) 實(shí)驗(yàn)室設(shè)置及基本技術(shù),一、實(shí)驗(yàn)室組成 二、基本設(shè)備 三、培養(yǎng)器皿及實(shí)驗(yàn)用具 四、洗滌技術(shù) 五、滅菌技術(shù) 六、無菌操作,組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室布局的總體要求 便于隔離 便于操作 便于滅菌 便于觀察,一、實(shí)驗(yàn)室組成,基本實(shí)驗(yàn)室,輔助實(shí)驗(yàn)室,實(shí)驗(yàn)室組成,準(zhǔn)備室 緩沖室 無菌操作室 培養(yǎng)室,細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室 溫 室 生化分析實(shí)驗(yàn)室,基本實(shí)驗(yàn)室布局平面圖,實(shí)驗(yàn)臺(tái),擱架,培養(yǎng)架,培養(yǎng)架,培養(yǎng)架,培養(yǎng)架,藥品及儀器柜,無菌臺(tái),無菌臺(tái),擱 架,拉窗,冰箱,擱 架,水槽,電

2、爐,門,4.5m,3.0m,3.5m,4.0m,準(zhǔn)備室,緩沖室,無菌室,培養(yǎng)室,組織培養(yǎng)準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)室,緩沖室,培養(yǎng)室,無菌室（一）,無菌室（二）,二、儀器與設(shè)備,1、基本設(shè)備 冰箱、電爐、酸度計(jì)、純水器、天平、培養(yǎng)基分裝器、攪拌器等。,冰箱,酸度計(jì),電爐,天平,純水器,培養(yǎng)基分裝器,攪拌器,2、滅菌設(shè)備 蒸汽壓力滅菌鍋、干熱消毒柜、過濾滅菌裝置、噴霧消毒器、紫外燈。,蒸汽壓力滅菌鍋,干熱消毒柜,無菌瓶頂過濾裝置,噴霧消毒器,（參考圖）,（參考圖）,3、無菌操作設(shè)備,超凈工作臺(tái),無菌接種箱,4、細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)備,搖 床,培養(yǎng)架,HZC-250恒溫振蕩培養(yǎng)箱,150C250D光照培養(yǎng)箱,5、細(xì)胞學(xué)鑒定設(shè)

3、備 光學(xué)研究顯微鏡、實(shí)體顯微鏡、倒置顯微鏡,倒置顯微鏡,光學(xué)顯微鏡,1、玻璃器皿,三、培養(yǎng)器皿及實(shí)驗(yàn)用具,培養(yǎng)皿,三角瓶,培養(yǎng)瓶,2、金屬材質(zhì)用具,鑷子,解剖刀,接種針,四、洗滌技術(shù),1、玻璃器皿洗滌,新購(gòu)置玻璃器皿,1%稀HCl,浸漬12h,洗衣粉洗滌,清水沖洗,晾干備用,已用過的玻璃器皿,2、塑料用品洗滌,新的塑料器皿打開即用,已用過的塑料器皿,2%NaOH浸泡12h,清水沖洗,2%5%鹽酸浸泡30min,清水沖洗,蒸餾水沖洗,晾干備用,3、金屬用品洗滌,熱洗衣粉水洗凈,沖洗,擦干,清潔液配方,五、滅菌技術(shù),物理方法： 物理滅菌干熱、濕熱、射線處理、物理除菌、過濾、離心、沉淀等 化學(xué)方法：

4、 消毒劑、抗菌素滅菌,1、滅菌方法,2、滅菌,（1）培養(yǎng)基滅菌：高溫高壓濕熱滅菌法 壓力在9.810410.8104Pa 溫度在121 滅菌2030min （2）玻璃器皿滅菌：蒸汽高壓消毒滅菌 干熱消毒滅菌,飽和蒸汽壓力與其對(duì)應(yīng)的溫度,（3）塑料器皿滅菌： 多采用高壓蒸汽消毒滅菌 （4）金屬用具滅菌：灼燒滅菌 浸入95%酒精，后置于酒精火焰上灼燒，冷卻后使用,（5）接種室滅菌,空氣消毒滅菌,接種室,超凈工作臺(tái),紫外燈照射,70%75%的酒精擦洗,培養(yǎng)材料的接種,紫外燈照射,（6）外植體滅菌,流水沖洗1020min或更長(zhǎng)時(shí)間,70%75%酒精中浸泡30s,0.1%0.2%氯化汞液中浸泡10min

5、左右,蒸餾水沖洗45次,在10%的次氯酸鈉、飽和漂白粉浸泡30min左右,備用,常用消毒劑消毒滅菌比較表,六、無菌操作,實(shí)驗(yàn)員消毒,實(shí)驗(yàn)室、無菌臺(tái)滅菌,實(shí)驗(yàn)器材的滅菌,無菌接種,消 毒,實(shí)驗(yàn)臺(tái)衛(wèi)生,培養(yǎng)室培養(yǎng),1、消毒，更換實(shí)驗(yàn)服、帽子與鞋子，進(jìn)入接種室。 2、打開超凈工作臺(tái)和無菌操作室的紫外燈，照射40min左右，后關(guān)閉。 3、開啟過濾室風(fēng)機(jī)，使無菌風(fēng)吹拂工作臺(tái)面和四周的臺(tái)壁。 4、用70%75%的酒精擦拭工作臺(tái)和雙手。,5、用沾有70%75%酒精的紗布擦拭盛培養(yǎng)基的培養(yǎng)器皿，放進(jìn)工作臺(tái)。 6、把解剖刀、剪刀、鑷子等器械浸泡在95%的酒精中，再在火焰上消毒，放在器械架上。 7、在酒精燈火焰附

6、近切割備用的接種材料。 8、打開瓶口，用火焰燒瓶口，轉(zhuǎn)動(dòng)瓶口使瓶口各部分都燒到。,9、取下接種器械，在火焰上消毒。 10、把培養(yǎng)材料放入培養(yǎng)瓶，蓋上瓶口。 11、接種結(jié)束后，清理和關(guān)閉超凈工作臺(tái)。,注意：操作期間應(yīng)經(jīng)常用70%75%的酒精擦拭工作臺(tái)和雙手；接種器械應(yīng)反復(fù)在95%的酒精中浸泡和在火焰上消毒。,第二節(jié) 植物組織培養(yǎng)所需的環(huán)境 條件及營(yíng)養(yǎng)成分,一、所需環(huán)境條件,與自然條件一樣，組織培養(yǎng)中的材料的生長(zhǎng)要受到溫度、光照、濕度等各種物理?xiàng)l件，不同氣體、培養(yǎng)基的組成、pH值和滲透壓等各種化學(xué)條件，以及外植體部位、大小、細(xì)胞密度等各種生物條件等環(huán)境條件的影響。如何根據(jù)需要來控制培養(yǎng)條件是組織培

7、養(yǎng)中的一個(gè)重要問題。,溫度 光照 濕度 氣體 培養(yǎng)基的滲透壓 pH值,植物材料一般最適溫度在252之間,環(huán)境條件,最常用的光周期是光照16h，黑暗8h,一般情況下，培養(yǎng)器內(nèi)相對(duì)濕度應(yīng)達(dá)100%，培養(yǎng)室內(nèi)環(huán)境的相對(duì)濕度在70%80%,氧氣是愈傷組織生長(zhǎng)所必需的,調(diào)節(jié)滲透壓常常從糖入手,植物組織培養(yǎng)時(shí)培養(yǎng)基的pH值大多在5.06.5,二、營(yíng)養(yǎng)成分,植物體內(nèi)至少含有幾十種化學(xué)元素，其中大部分元素在植物體內(nèi)起到一定的生理作用： a、組成各種化合物，參與機(jī)體的建造，成為結(jié)構(gòu)物質(zhì)； b、構(gòu)成一些特殊的生理活性物質(zhì)，參與活躍的新陳代謝； c、元素之間相互協(xié)調(diào)，以維持離子濃度平衡、膠體穩(wěn) 定、電荷平衡等點(diǎn)化學(xué)

8、方面的作用； d、發(fā)育方面，特定的元素影響植物的形態(tài)發(fā)生和組織、 器官建成。,Arnon和Stout（1939）提出的確定植物必需營(yíng)養(yǎng)元素的3個(gè)標(biāo)準(zhǔn),A、缺乏該元素，植物生育發(fā)生障礙，不能完成其生活史 B、缺乏該元素，就表現(xiàn)為專一的病癥，且這種缺素癥可以用補(bǔ)充改元素來預(yù)防和恢復(fù) C、改元素在植物營(yíng)養(yǎng)生理上表現(xiàn)直接的效果，而不是由于土壤的物理、化學(xué)、微生物條件的改進(jìn)而產(chǎn)生的間接效果。,國(guó)內(nèi)外公認(rèn)的高等植物所必需的營(yíng)養(yǎng)元素有16（17）種： C、H、O、N、P、K、Ca、Mg、S、Fe、B、Mn、Cu、Zn、Mo、Cl、（Ni） 在植物中含量差別很大，同一元素在植物不同時(shí)期、不同條件下含量也不同。

9、,根據(jù)植物體內(nèi)含量多少，可把這些元素分為 大量營(yíng)養(yǎng)元素：占干物質(zhì)重量的0.1%以上； C、H、O、N、P、K、Ca、Mg、S等9種 微量營(yíng)養(yǎng)元素：占干物質(zhì)重量的0.1%以下 有的只含0.1mg/kg Fe、B、Mn、Cu、Zn、Mo、Cl等7種,按照國(guó)際植物生理協(xié)會(huì)的建議： 所需濃度 0.5mmol/L的元素為大量元素 所需濃度 0.5mmol/L的元素為微量元素,1、大量元素 N是蛋白質(zhì)、酶、葉綠素、維生素、核酸、磷脂、生物堿等的組成成分，在植物生命活動(dòng)中占有重要的位置。 P是磷脂的主要成分。培養(yǎng)基中常用KH2PO4 NaH2PO4等。 K對(duì)碳水化合物合成，轉(zhuǎn)移，以及氮素代謝等有密切關(guān)系。,

10、Mg、S、Ca是葉綠素的組成成分，又是激酶的活化劑，對(duì)核蛋白體結(jié)構(gòu)具有穩(wěn)定作用； S是含S氨基酸的蛋白質(zhì)的組成成分。 Ca是構(gòu)成細(xì)胞壁的成分，對(duì)細(xì)胞分裂，穩(wěn)定質(zhì)膜結(jié)構(gòu)有顯著作用，此外，Ca及鈣調(diào)素在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起重要作用。,2、微量元素 在微量元素中，鐵的使用最大 ： 一些氧化酶的組成成分 葉綠素形成的必要條件 使用乙二胺四乙酸鐵（EDTA-Fe）鰲合物防止鐵的沉淀,硼與蛋白質(zhì)合成、糖類運(yùn)輸有著密切的關(guān)系 銅是某些氧化酶的成分，能夠促進(jìn)離體根的生長(zhǎng) 錳參與植物的光合、呼吸代謝 鉬參與氮素的代謝 氯是光合作用水光解的活化劑 微量元素的主要作用是作為酶的輔助因子或激活劑參與代謝的調(diào)節(jié)。,缺鐵癥狀

11、：葉面呈綠色網(wǎng)紋狀失綠。隨病勢(shì)發(fā)展，葉片失綠程度加重，出現(xiàn)整葉變?yōu)榘咨?，葉緣枯焦，引起落葉。嚴(yán)重缺鐵時(shí)，新梢頂端枯死。,桃樹,缺銅癥狀： 新梢頂端葉片的葉尖失綠變黃，葉片出現(xiàn)褐色斑點(diǎn)至擴(kuò)大變成深褐色，引起落葉。 枝頂端生長(zhǎng)不良，其下部的芽開始生長(zhǎng)，形成叢生的細(xì)枝。,菊花,缺錳典型癥狀： 葉脈間失綠褪色，但葉脈仍保持綠色，脈間出現(xiàn)壞死斑，缺素癥狀由幼葉開始。,菜豆,缺鉬典型癥狀： 葉較小，葉脈間失綠,有壞死斑點(diǎn)，且葉邊緣焦枯，向內(nèi)卷曲。 十字花科植物缺鉬時(shí)葉片卷曲畸形，老葉變厚且枯焦。,白菜,缺硼典型癥狀： 受精不良,籽粒減少 ，“花而不實(shí)”， “蕾而不花”； 根尖、莖尖的生長(zhǎng)點(diǎn)停止生長(zhǎng)，而形成

12、簇生狀； 常引起各種腐爛病。,馬鈴薯,3、碳源 碳源物質(zhì)包括糖類物質(zhì)、醇類物質(zhì)和有機(jī)酸，以糖類物質(zhì)最重要。 糖類物質(zhì)特點(diǎn)： 具有熱易變的性質(zhì) 利于吸收和利用 使用濃度一般在2%5% 提供能源和調(diào)節(jié)滲透壓,4、維生素類 以各種輔酶的形式存在 參與多種代謝活動(dòng) 對(duì)生長(zhǎng)，分化等有很好的促進(jìn)作用 主要分為脂溶性維生素和水溶性維生素 常用維生素有VB1和VB6,5、肌醇 環(huán)己六醇 細(xì)胞壁的構(gòu)建材料 參與碳水化合物、磷脂代謝及離子平衡等生理活動(dòng) 促進(jìn)活性物質(zhì)發(fā)揮作用,6、氨基酸 蛋白質(zhì)的組成成分 有機(jī)氮源 可直接被細(xì)胞吸收利用 培養(yǎng)基中常用的是甘氨酸 7、天然復(fù)合物 促進(jìn)某些愈傷組織和器官的生長(zhǎng) 化學(xué)成分

13、不明、復(fù)雜 天然營(yíng)養(yǎng)混合物 如：水解酪蛋白、玉米胚乳、酵母提取物,8、瓊脂 是使用最普遍的凝固劑 用量一般在610g/L之間 顏色以淺、透明度高好，潔凈為上品 除了瓊脂外，在組織培養(yǎng)中還可以使用瓊脂糖、結(jié)冷膠等。,9、活性炭 吸附培養(yǎng)基及培養(yǎng)物分泌物中的抑制物質(zhì) 抑制外植體褐變氧化 防止玻璃苗的產(chǎn)生 促進(jìn)培養(yǎng)物生長(zhǎng)和分化 促進(jìn)生根 缺點(diǎn)： 沒有選擇性 10、抗生素 防止外植體內(nèi)生菌造成的污染,活性炭,11、生長(zhǎng)素類 促進(jìn)細(xì)胞伸長(zhǎng)和分裂 促進(jìn)生根、抑制器官脫落、性別控制、延長(zhǎng)休眠、頂端優(yōu)勢(shì)、單性結(jié)實(shí) 誘導(dǎo)愈傷組織形成 溶于95%酒精或0.1mol/L的NaOH中，后者的溶解效果更好 常用的生長(zhǎng)素

14、： IAA(吲哆乙酸) NAA (奈乙酸 ) 2,4-D(二氯苯氧乙酸) IBA(吲哆丁酸) 促進(jìn)細(xì)胞分裂分化,12、細(xì)胞分裂素類 促進(jìn)細(xì)胞分裂和分化 誘導(dǎo)胚狀體和不定芽的形成 延緩組織的衰老并增強(qiáng)蛋白質(zhì)的合成 用于離體成花的調(diào)控 溶于0.51.0mol/L的鹽酸或稀薄的NaOH中 常用的細(xì)胞分裂素： KT (激動(dòng)素) BA(6-卞基腺嘌呤) 2-ip(異戊烯氨基嘌呤)玉米素,13、赤霉素類和脫落酸 A、赤霉素類 組織培養(yǎng)中不常使用 加速細(xì)胞的伸長(zhǎng)生長(zhǎng) 促進(jìn)細(xì)胞的分裂 主要是GA3 B、脫落酸 抑制細(xì)胞分裂和伸長(zhǎng) 促進(jìn)脫落和衰老 促進(jìn)休眠和提高抗逆能力,培養(yǎng)基形態(tài)不同：固體培養(yǎng)基、液體培養(yǎng)基

15、培養(yǎng)過程不同：初代培養(yǎng)基、繼代培養(yǎng)基 其作用不同：誘導(dǎo)培養(yǎng)基、增殖培養(yǎng)基、生根培養(yǎng)基 營(yíng)養(yǎng)水平不同：基本培養(yǎng)基、完全培養(yǎng)基,一、培養(yǎng)基的種類,第三節(jié) 培養(yǎng)基的配制、滅菌與保存,1、MS培養(yǎng)基 無機(jī)鹽濃度高 高含量的氮、鉀，尤其是硝酸鹽 含有一定數(shù)量的銨鹽 營(yíng)養(yǎng)豐富 不需要添加更多的有機(jī)附加物,二、幾種常見培養(yǎng)基的特點(diǎn),2、White培養(yǎng)基 1943年由White為培養(yǎng)番茄根尖而設(shè)計(jì) 1963年作了改良，提高M(jìn)gSO4的濃度和增加硼元素 無機(jī)鹽濃度較低 使用廣泛 在生根培養(yǎng)、胚胎培養(yǎng)中有良好的效果,附表：White培養(yǎng)基,3、B5培養(yǎng)基 1968年由Gamborg等為培養(yǎng)大豆根細(xì)胞而設(shè)計(jì) 含有較

16、低的銨鹽 較高的硝酸鹽和鹽酸硫胺素,B5培養(yǎng)基的組成和配方,4、N6培養(yǎng)基 1974年朱至清等為水稻等禾谷類作物花藥培養(yǎng)設(shè)計(jì) KNO3和（NH4）SO4含量高，不含鉬,N6培養(yǎng)基組成及配方,配制培養(yǎng)基應(yīng)做好幾點(diǎn)工作： 1、實(shí)驗(yàn)用具的準(zhǔn)備。包括配制過程中所需電爐、酸度計(jì)、高壓滅菌鍋等設(shè)備及其他玻璃器皿的清洗和準(zhǔn)備 2、試劑、藥品的準(zhǔn)備 3、根據(jù)培養(yǎng)基的配方、母液擴(kuò)大倍數(shù)及需要配制的培養(yǎng)基體積計(jì)算所需各種母液及其他附加物的量,三、培養(yǎng)基的配制,具體操作如下： 1、取規(guī)定數(shù)量的糖源和凝固劑置于燒杯或搪瓷鍋內(nèi)，加蒸餾水加熱使之溶解，并不斷攪拌； 2、根據(jù)計(jì)算所需量依次加入大量元素、微量元素、鐵鹽、有機(jī)物、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)母液及其他特殊的附加物，攪拌均勻； 3、加水定容至規(guī)定體積，攪拌均勻； 4、調(diào)整培養(yǎng)基的pH值； 5、分裝； 6、封口。,組織培養(yǎng)必須在無菌環(huán)境中進(jìn)行，因此培養(yǎng)基的滅菌操作非常重要。 培養(yǎng)基分裝封口后立刻進(jìn)行滅菌，至少在24h內(nèi)完成滅菌程序。 一般采用的是高壓蒸汽滅菌。,四、培養(yǎng)基的滅菌,滅菌鍋有很多種，實(shí)驗(yàn)室中常用手提式高壓蒸汽滅菌鍋，使用時(shí)要注意一下幾點(diǎn)： 1、鍋中應(yīng)放足量的水，以免造成空燒或干燒；