1、高級(jí)儀器分析技術(shù)實(shí)驗(yàn),食品與營(yíng)養(yǎng)保健學(xué)院,目錄,實(shí)驗(yàn)一：水的純度測(cè)定及電導(dǎo)率儀的使用 實(shí)驗(yàn)二：鐵的分光光度計(jì)法測(cè)定 實(shí)驗(yàn)三：瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)四：高效液相色譜法測(cè)定茶葉中咖啡因,高級(jí)儀器分析技術(shù)實(shí)驗(yàn)一,水的純度測(cè)定及 電導(dǎo)率儀的使用,一、電導(dǎo)率儀的使用,液體中的電流流動(dòng),在固體導(dǎo)體中，電流是通過(guò)自由電子的移動(dòng)而產(chǎn)生的。 在液體導(dǎo)體中，電流是通過(guò)自由離子的移動(dòng)而產(chǎn)生的。,傳輸電流的離子物質(zhì)被稱為電解液。 電解液的實(shí)質(zhì)是自由離子。 分子水解產(chǎn)生帶正電的陽(yáng)離子和帶負(fù)電的陰離子。,電導(dǎo)率,以數(shù)字表示溶液傳導(dǎo)電流的能力。 在國(guó)際單位制中，電導(dǎo)率的單位稱為西門子每米（S/m），其它單位有：mS/m，

2、S/cm，S/cm。 1S/m=1000mS/m =1000000S/m =10mS/cm =10000S/cm 電阻率的倒數(shù)為電導(dǎo)率，用希臘字母表示，=1/ 。除非特別指明，電導(dǎo)率的測(cè)量溫度是標(biāo)準(zhǔn)溫度（ 25 C ）,物理意義,電導(dǎo)率是表示物質(zhì)導(dǎo)電的性能。電導(dǎo)率越大則導(dǎo)電性能越強(qiáng)，反之越小。另外：電導(dǎo)是電阻的倒數(shù)，電導(dǎo)率是電阻率的倒數(shù)。 電導(dǎo)率是以數(shù)字表示溶液傳導(dǎo)電流的能力。水的電導(dǎo)率與其所含無(wú)機(jī)酸、堿、鹽的量有一定的關(guān)系，當(dāng)它們的濃度較低時(shí)，電導(dǎo)率隨著濃度的增大而增加，因此，該指標(biāo)常用于推測(cè)水中離子的總濃度或含鹽量。,應(yīng)用領(lǐng)域,電廠-水處理； 水廠和污水廠-廢水處理； 造紙-生產(chǎn)過(guò)程/廢水

3、處理； 化工煉油-生產(chǎn)過(guò)程/廢水處理； 冶金和采礦-生產(chǎn)過(guò)程/廢水處理； 食品和飲料-生產(chǎn)過(guò)程/廢水處理； 醫(yī)藥行業(yè)-生物反應(yīng)和發(fā)酵/廢水處理； 半導(dǎo)體-生產(chǎn)過(guò)程/廢水處理/高純水生產(chǎn)。,測(cè)量原理 - 電導(dǎo)式測(cè)量原理,將相互平行且距離是固定值L的兩塊極板（或圓柱電極），放到被測(cè)溶液中，在極板的兩端加上一定的電勢(shì)。然后通過(guò)電導(dǎo)儀測(cè)量極板間電導(dǎo)。 電導(dǎo)率的測(cè)量需要兩方面信息。一個(gè)是溶液的電導(dǎo)G，另一個(gè)是溶液的幾何參數(shù)S。電導(dǎo)可以通過(guò)電流、電壓的測(cè)量得到。根據(jù)關(guān)系式S=G可以等到電導(dǎo)率的數(shù)值。,測(cè)量原理,歐姆定律: I = U / R = U G G = 電導(dǎo) S = 1/ 溶液電導(dǎo)率C mS/cm

4、, S/cm: C = G d/A 其中：d為極板間距，A為極板面積 又電極常數(shù) = d/A cm-1 則 C = G 溶液電導(dǎo)率C只與溶液特性有關(guān)而與測(cè)量傳感器幾何尺寸無(wú)關(guān)。,電導(dǎo)率儀,電導(dǎo)率測(cè)定儀是一款多量程儀器，能夠滿足從去離子水到海水等多種應(yīng)用檢測(cè)要求。儀器能夠提供溫度補(bǔ)償，并能設(shè)置溫度系數(shù)，因此能夠用于測(cè)量溫度系數(shù)與水不同的液體樣品。,儀器測(cè)量原理,電導(dǎo)率儀由振蕩器、放大器和指示器等部分組成。電導(dǎo)率儀的工作原理如圖所示。,E為振蕩器產(chǎn)生的交流電壓，Rx為電導(dǎo)池的等效電阻，Rm為分壓電阻，Em為Rm上的交流分壓。由歐姆定律可知： Kcell為電導(dǎo)池常數(shù)，當(dāng)E、Rm和Kcell均為常數(shù)時(shí)

5、，由電導(dǎo)率的變化必將引起Em作相應(yīng)變化，所以測(cè)量Em的大小，也就測(cè)得溶液電導(dǎo)率的數(shù)值。將Em送至交流放大器放大，再經(jīng)過(guò)訊號(hào)整流，以獲得推動(dòng)表頭的直流訊號(hào)輸出，表頭直讀電導(dǎo)率。,1.振蕩器；2.電導(dǎo)池； 3.放大器；4.指示器。,影響因素,溫度：電導(dǎo)率與溫度具有很大相關(guān)性。金屬的電導(dǎo)率隨著溫度的增高而降低。半導(dǎo)體的電導(dǎo)率隨著溫度的增高而增高。在一段溫度值域內(nèi)，電導(dǎo)率可以被近似為與溫度成正比。為了要比較物質(zhì)在不同溫度狀況的電導(dǎo)率，必須設(shè)定一個(gè)共同的參考溫度。電導(dǎo)率與溫度的相關(guān)性，時(shí)?？梢员磉_(dá)為，電導(dǎo)率對(duì)上溫度線圖的斜率。,摻雜程度：固態(tài)半導(dǎo)體的摻雜程度會(huì)造成電導(dǎo)率很大的變化。增加摻雜程度會(huì)造成高電

6、導(dǎo)率。水溶液的電導(dǎo)率高低相依于其內(nèi)含溶質(zhì)鹽的濃度，或其它會(huì)分解為電解質(zhì)的化學(xué)雜質(zhì)。水樣本的電導(dǎo)率是測(cè)量水的含鹽成分、含離子成分、含雜質(zhì)成分等等的重要指標(biāo)。水越純凈，電導(dǎo)率越低（電阻率越高）。水的電導(dǎo)率時(shí)常以電導(dǎo)系數(shù)來(lái)紀(jì)錄；電導(dǎo)系數(shù)是水在 25C 溫度的電導(dǎo)率。,各向異性：有些物質(zhì)會(huì)有異向性(anisotropic) 的電導(dǎo)率，必需用 3 3 矩陣來(lái)表達(dá)（使用數(shù)學(xué)術(shù)語(yǔ)，第二階張量，通常是對(duì)稱的）。,電導(dǎo)率測(cè)量為什么需要溫度補(bǔ)償?,離子的遷移速度與溫度有關(guān) 物質(zhì)的離解程度與溫度有關(guān),T = ref (1 + (T-Tref) with temperature coefficient : =(T -

7、 ref)/ ref(T -Tref) ref= conductivity at reference emperature (e.g. 25 C) T=conductivity atprocesstemperature Tref= reference temperature (e.g. 25 C) T = process temperature,電導(dǎo)率測(cè)量是與溫度相關(guān)的。溫度對(duì)電導(dǎo)率的影響程度依溶液的不同而不同，可以用下面的公式求得： Gt = Gtcal1 + (T-Tcal) 其中： Gt = 某一溫度（C）下的電導(dǎo)率 Gtcal = 標(biāo)準(zhǔn)溫度（C）下的電導(dǎo)率 Tcal = 溫度修正值 =

8、 標(biāo)準(zhǔn)溫度（C）下溶液的溫度系數(shù)。 （DDS-11C型對(duì)被測(cè)液能作標(biāo)準(zhǔn)溫度系數(shù)2%）,下表列出了常用溶液的值。要得到其他溶液的值，只要測(cè)量某個(gè)溫度范圍內(nèi)的電導(dǎo)率，并以溫度為縱軸繪出相應(yīng)的電導(dǎo)率的變化曲線，與標(biāo)準(zhǔn)溫度相對(duì)應(yīng)的曲線點(diǎn)為該溶液的值。,使用方法,開機(jī)：按下電源開關(guān)，預(yù)熱30min。 測(cè)量： （1）調(diào)節(jié)“常數(shù)”補(bǔ)償旋鈕使顯示值與電極上所標(biāo)常數(shù)值一致。 （2）調(diào)節(jié)“溫度”補(bǔ)償旋鈕至待測(cè)溶液實(shí)際溫度值。 （3）先用蒸餾水清洗電極，濾紙吸干，再用被測(cè)溶液清洗一次，把電極浸入被測(cè)溶液中，用玻璃棒攪拌溶液，使溶液均勻，讀出溶液的電導(dǎo)率值。 在測(cè)量過(guò)程中，若顯示屏首位為1（溢出），這表示被測(cè)溶液的電

9、導(dǎo)率值超出量程范圍，此時(shí)應(yīng)將【RANGE】旋鈕旋到高一檔進(jìn)行測(cè)量，或者將樣品稀釋一定倍數(shù)進(jìn)行測(cè)量。 結(jié)束：用蒸餾水清洗電極；關(guān)機(jī)。,電極常數(shù)選擇,電導(dǎo)率范圍及對(duì)應(yīng)電極常數(shù)推薦表,校正方法,精確配置標(biāo)準(zhǔn)溶液； 調(diào)節(jié)標(biāo)準(zhǔn)溶液溫度至參照標(biāo)準(zhǔn)溫度（一般為25），即250.1。 按下式計(jì)算常數(shù)J：J=K/K測(cè)式中K為溶液標(biāo)準(zhǔn)電導(dǎo)率（查下表可得） 測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)液電導(dǎo)率、計(jì)算并修改常數(shù)數(shù)值。 測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)液電導(dǎo)率用以驗(yàn)證。,維護(hù)保養(yǎng)及注意事項(xiàng),電極使用前必須放入在蒸餾水中浸泡數(shù)小時(shí)，經(jīng)常使用的電極應(yīng)放入（貯存）在蒸餾水中。 量程正確設(shè)置方法：置與溢出檔的高一檔量程進(jìn)行測(cè)量，能在低一檔量程內(nèi)測(cè)量的，不放在高一檔量程內(nèi)

10、測(cè)量。 為保證儀器的測(cè)量精度，必要時(shí)在儀器的使用前，用該儀器對(duì)電極常數(shù)進(jìn)行重新標(biāo)定。同時(shí)應(yīng)定期進(jìn)行電導(dǎo)電極常數(shù)標(biāo)定。 盛被測(cè)溶液的容器必須清潔，無(wú)離子玷污。 在測(cè)量高純水時(shí)應(yīng)避免污染，正確選擇電導(dǎo)電極常數(shù)并最好采用密封、流動(dòng)的測(cè)量方式（否則電導(dǎo)率增加很快，因?yàn)榭諝庵械腃O2溶入水里變成碳酸根離子 ）。,儀器內(nèi)置的溫度系數(shù)為2%/，與此溫度系數(shù)不符的溶液使用溫度補(bǔ)償將會(huì)有誤差。因此，進(jìn)行高精度測(cè)量或檢測(cè)高純水時(shí)，應(yīng)采用無(wú)溫度補(bǔ)償方式進(jìn)行，然后查表，或者將被測(cè)溶液恒溫在25，求其在25時(shí)的電導(dǎo)率值。 為保證測(cè)量精度，電極使用前應(yīng)用于小0.5S/cm的去離子水（或蒸餾水）沖洗二次，然后用被測(cè)試樣沖洗

11、后方可測(cè)量。 出現(xiàn)異常情況，聯(lián)系管理員。 測(cè)量時(shí)應(yīng)采用配套使用的，不要采用其它型號(hào)的。,測(cè)量低電導(dǎo)值的溶液時(shí)，請(qǐng)先在超純水中清晰并浸泡2個(gè)小時(shí)以上。 測(cè)量過(guò)程中，從甲溶液轉(zhuǎn)到乙溶液時(shí)，先用蒸餾水清洗后，在用乙溶液清洗，不能用濾紙擦拭。 電極使用完畢后應(yīng)該清洗干凈，甩干后妥善保存（可浸泡在純水中保存），避免碰撞損壞。 防止電極的插頭和引線潮濕，否則將會(huì)出現(xiàn)測(cè)量誤差。 電極長(zhǎng)期使用，電極常數(shù)會(huì)發(fā)生變化，影響測(cè)量準(zhǔn)確性，此時(shí)應(yīng)重新標(biāo)定電極常數(shù)。,電導(dǎo)電極的貯存與清洗,電導(dǎo)電極的清洗 1.可以用含有洗滌劑的溫水清洗電極上有機(jī)成分污垢，也可以用酒精清洗。 2.鈣、鎂沉淀物最好用10檸檬酸。 3.鍍鉑黑的

12、電極，只能用化學(xué)方法清洗，用軟刷子機(jī)械清洗時(shí)會(huì)破壞鍍?cè)陔姌O表面的鍍層（鉑黑）。注意：某些化學(xué)方法清洗可能在生活破壞被輕度污染的鉑黑層。 4.光亮的鉑電極，可以用軟刷子機(jī)械清洗。但在電極表面不可以產(chǎn)生裂痕，絕對(duì)不可以使用螺絲起子之類硬物清理電極表面，甚至在用軟刷子清洗時(shí)也要特別注意。,電導(dǎo)電極的貯存 電極（長(zhǎng)期不用）應(yīng)貯存在干燥的地方。電極使用前必須放入（貯存）在蒸餾水中數(shù)小時(shí)，經(jīng)常使用的電極可以放入（貯存）在蒸餾水中。,二、水的純度測(cè)定,實(shí)驗(yàn)?zāi)康?1.理解電導(dǎo)率儀的工作原理，掌握其使用方法。 2.測(cè)定各種水體的純度。,實(shí)驗(yàn)原理 水的純度取決于水中可溶性電解質(zhì)的含量。由于一般水中含有極其微量的N

13、a+、K+、Ca2+、Mg2+、CO32、Cl、SO42等多種離子，所以，具有導(dǎo)電能力。離子濃度愈大，導(dǎo)電能力越強(qiáng)，電導(dǎo)率越大；反之，水的純度越高，離子濃度愈小，電導(dǎo)率越小。因此通過(guò)測(cè)定電導(dǎo)率可以鑒定水的純度。,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù) 測(cè)量25、40、60的5種水樣的電導(dǎo)率并記錄。,思考與討論 溫度對(duì)電導(dǎo)率測(cè)定值有何影響？為什么？ 各種水樣的純度如何？應(yīng)該如何選用？,高級(jí)儀器分析技術(shù)實(shí)驗(yàn)二,鐵的分光光度計(jì)法測(cè)定,一、722型分光光度計(jì)的使用,1儀器性能的檢查 （1）預(yù)熱：接通電源，讓儀器預(yù)熱至少二十分鐘，使儀器進(jìn)入熱穩(wěn)定工作狀態(tài)。 （2）調(diào)零：儀器接通電源后，即進(jìn)入自檢狀態(tài)。顯示器實(shí)時(shí)顯示儀器的自檢狀態(tài)。當(dāng)

14、儀器發(fā)生故障時(shí)，顯示器會(huì)自動(dòng)顯示故障位置。自檢結(jié)束，儀器自動(dòng)尋找光源最大能量，查找完畢，儀器自動(dòng)停留在420 nm處，并自動(dòng)調(diào)100%T和0%T。顯示器上顯示420 nm和“100.0%T”。儀器此時(shí)進(jìn)入測(cè)試狀態(tài)。,2使用方法 （1）按“方式鍵”（Mode）將測(cè)試方式設(shè)置為吸光度方式。 （2）調(diào)節(jié)波長(zhǎng)設(shè)置想要的分析波長(zhǎng)420nm。 （3）將參比溶液和被測(cè)溶液分別倒入比色皿中。注意比色皿內(nèi)的溶液面高度不應(yīng)低于25毫米，大約2.5毫升；被測(cè)試的樣品中不能有氣泡和漂浮物。,（4）打開樣品室蓋，將盛有溶液的比色皿分別插入比色皿槽中，蓋上樣品室蓋。注意：一般情況下，參比樣品放在樣品架的第一個(gè)槽位中；儀器

15、所附的比色皿，其透視率是經(jīng)過(guò)測(cè)試匹配的，未經(jīng)匹配處理的比色皿將影響樣品的測(cè)試精度；比色皿的透光部分表面不能有指印和溶液痕跡。 （5）將參比溶液推入光路中，按“100%T”鍵調(diào)整零吸光度。 （6）將被測(cè)溶液推或拉入光路中，此時(shí)，顯示器上所顯示的是被測(cè)樣品的吸光度數(shù)值。,二、磺基水楊酸顯色法測(cè)定鐵,實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.掌握用磺基水楊酸顯色法測(cè)定鐵的原理和方法。2.掌握722型分光光度計(jì)的使用方法。,實(shí)驗(yàn)原理 伯朗比爾定律,是摩爾吸光系數(shù)，其大小與入射光波長(zhǎng)、 溶液的性質(zhì)、溫度等有關(guān)。若入射光波長(zhǎng)、比 色皿（溶液）的厚度d一定時(shí)，吸光度只與溶 液的濃度c成正比。,本實(shí)驗(yàn)選用磺基水楊酸（簡(jiǎn)寫為H3R）與 Fe

16、3+形成的配位平衡體系， H3R和Fe3+等試劑 與配合物的吸收光譜不重合，因此可用分光 光度法測(cè)定。因溶液pH的不同，形成配合物 的組成也不同。,2.等摩爾系列法求配合物組成及穩(wěn)定常數(shù),在 pH911.5 的 NH3H2O-NH4Cl 溶液中，F(xiàn)e3+與磺基水楊酸反應(yīng)生成三磺基水楊酸鐵黃色配合物。,該配合物很穩(wěn)定, 試劑用量及溶液酸度略有改變都無(wú)影響。Ca2+、 Mg2+、 Al3+ 等與磺基水楊酸能生成無(wú)色配合物, 在顯色劑過(guò)量時(shí), 不干擾測(cè)定。F-、 NO3-、 PO43- 等離子對(duì)測(cè)定無(wú)影響。Cu2+ 、Co2+、Ni2+、Cr3+ 等離子大量存在時(shí)干擾測(cè)定。由于Fe2+ 在堿性溶液中

17、易被氧化，所以。本法所測(cè)定的鐵實(shí)際上是溶液中鐵的總含量。 磺基水楊酸鐵配合物在堿性溶液中的最大吸收波長(zhǎng)為420nm, 故在此波長(zhǎng)下測(cè)量吸光度。,實(shí)驗(yàn)原理,1.工作曲線的繪制 在6 只 50 mL 容量瓶中, 用吸量管分別加入0.00 、1.00、 2.00、3.00、4.00 、5.00mL濃度為0.1 mg/L的鐵鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液，各加 4 mL 10% NH4Cl溶液和2 mL 20%磺基水楊酸溶液, 滴加氨水(1+1)直到溶液變黃色后, 再多加1mL, 加水稀釋至刻度, 搖勻。（用NH3-NH4Cl作為緩沖溶液）,注意：A.在用磺基水楊酸鐵測(cè)定Fe3+ 時(shí)，在pH=10 時(shí)形成的配合物穩(wěn)定，且

18、不容易受干擾，所以在pH9-11.5下測(cè)定黃色3：1配位比的產(chǎn)物，pH對(duì)實(shí)驗(yàn)成敗很關(guān)鍵，用NH3-NH4Cl作為緩沖溶液。 B. 用移液管移取試劑，注意順序，并且不能混用移液管。 C. 比色皿的使用中，每改變一次試液濃度，比色皿都要洗干凈。應(yīng)該按照濃度從低到高測(cè)量，以減少影響。,用分光光度計(jì)于420 nm波長(zhǎng)下, 以試劑空白作參比溶液, 調(diào)節(jié)透光度為100%, 測(cè)出各標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo), 鐵含量為橫坐標(biāo), 繪制工作曲線。,表1 作工作曲線所配的系列溶液,2.試液中鐵含量的測(cè)定 用吸量管加待測(cè)試液 5.00mL于 50mL容量瓶中, 在與標(biāo)準(zhǔn)溶液相同條件, 按上述方法顯色, 測(cè)量

19、其吸光度。從工作曲線中查得相應(yīng)的鐵含量, 計(jì)算原試液中鐵的含量。 注意：待測(cè)溶液一定要在工作曲線線形范圍內(nèi)，如果濃度超出直線的線形范圍，則有可能偏離朗伯-比耳定律是光吸收的基本定律，就不能使用吸光光度法測(cè)定。,實(shí)驗(yàn)結(jié)果,表2 標(biāo)準(zhǔn)曲線法數(shù)據(jù)記錄及結(jié)果,根據(jù)記錄結(jié)果以吸光度為縱坐標(biāo), 鐵含量為橫坐標(biāo), 繪制工作曲線，從工作曲線上查出原試液中鐵的含量（ ）mg/L。,標(biāo)準(zhǔn)溶液是否要準(zhǔn)確移取？ 加NH4Cl的作用是什么？ 為什么要用氨水滴至溶液呈黃色？ 實(shí)驗(yàn)中若 （1）每個(gè)溶液的濃度都不一樣 （2）溫度有較大的變化 （3）比色皿的透光面不潔凈 將對(duì)測(cè)定穩(wěn)定常數(shù)有何影響？,思考與討論,高級(jí)儀器分析技術(shù)

20、實(shí)驗(yàn)三,瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn),一、瓊脂糖凝膠電泳原理,什么是電泳技術(shù)？,電泳法，是指帶電荷的供試品（蛋白質(zhì)、核苷酸等）在惰性支持介質(zhì)（如紙、醋酸纖維素、瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠等）中，于電場(chǎng)的作用下，向其對(duì)應(yīng)的電極方向按各自的速度進(jìn)行泳動(dòng)，使組分分離成狹窄的區(qū)帶，用適宜的檢測(cè)方法記錄其電泳區(qū)帶圖譜或計(jì)算其百分含量的方法。,電泳技術(shù)的分類,電泳法可分為自由電泳（無(wú)支持體）及區(qū)帶電泳（有支持體）兩大類。 自由電泳包括 Tise-leas式微量電泳、顯微電泳、等電聚焦電泳、等速電泳及密度梯度電泳。 區(qū)帶電泳則包a括濾紙電泳（常壓及高壓）、薄層電泳（薄膜及薄板）、醋酸纖維薄膜電泳、非凝膠性支持體區(qū)帶電

21、泳（支持體有：淀粉，纖維素粉，玻璃粉，硅膠等)、凝膠支持體區(qū)帶電泳（瓊脂、瓊脂糖、淀粉膠、聚丙烯酰胺凝膠）等。,做瓊脂糖凝膠電泳的目的,檢測(cè)所提取的DNA時(shí) 檢驗(yàn)PCR產(chǎn)物 觀察限制性內(nèi)切酶的切割結(jié)果 切膠回收純化某個(gè)片段,瓊脂糖凝膠電泳：實(shí)驗(yàn)原理,瓊脂糖是由瓊脂分離制備的鏈狀多糖。其結(jié)構(gòu)單元是 D-半乳糖和3.6-脫水-L-半乳糖。許多瓊脂糖鏈依氫鍵及其它力的作用使其互相盤繞形成繩狀瓊脂糖束，構(gòu)成大網(wǎng)孔型凝膠。其本身不帶有電荷。因此該凝膠適合于免疫復(fù)合物、核酸與核蛋白的分離、鑒定及純化。,DNA分子在堿性緩沖液中帶負(fù)電荷，在外加電場(chǎng)作用下向正極泳動(dòng)。 DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動(dòng)時(shí)，有電荷效

22、應(yīng)與分子篩效應(yīng)。不同DNA的分子量大小及構(gòu)型不同，電泳時(shí)的泳動(dòng)率就不同，從而分出不同的區(qū)帶。 DNA 分子的遷移速度與相對(duì)分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)值成反比關(guān)系。凝膠電泳不僅可分離不同相對(duì)分子質(zhì)量的DNA ，也可以分離相對(duì)分子質(zhì)量相同，但構(gòu)型不同的DNA 分子。,瓊脂糖凝膠電泳特點(diǎn),瓊脂糖凝膠的配制,1.根據(jù)電泳需要，配置合適濃度的電泳及制膠緩沖液。一般為 1 TAE或0.5TBE。注意：用于電泳的緩沖液和用于制膠的緩沖液必須是相同的。 2.根據(jù)制膠量及凝膠濃度，在加有一定量的電泳緩沖液的三角錐瓶中，加入準(zhǔn)確稱量的瓊脂糖粉。 注意：總液體量不宜超過(guò)三角錐瓶的50%容量 3. 在微波爐中加熱溶解瓊脂糖注意：

23、必須保證瓊脂糖充分完全溶解，否則，會(huì)造成電泳圖像模糊不清。加熱時(shí)如膠液劇烈沸騰發(fā)泡，停止加熱。微波爐中加熱時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)。,4.使溶液冷卻至60左右，如需要可在此時(shí)加入溴化乙錠(EB)溶液使其終濃度為0.5ug/ml，并充分混勻不提倡使用。注意：溴化乙錠是一種致癌物質(zhì)。使用含有溴化乙錠的溶液時(shí)，請(qǐng)戴用手套。溴化乙錠在可見(jiàn)光下會(huì)分解。 5. 將瓊脂糖溶液倒入制膠模中，然后在適當(dāng)位置處插上梳子。凝膠厚度一般在35 mm 之間。 注意：不要產(chǎn)生氣泡，溶液溫度太高(60)，會(huì)使得水分過(guò)分蒸發(fā)，改變凝膠離子濃度，影響電泳效果。 6. 在室溫下使膠凝固（大約30 分鐘），然后放置于電泳槽中進(jìn)行電泳。注意：

24、凝膠不立即使用時(shí)，用保鮮膜將凝膠包好在4下保存，或者放在制膠的緩沖液中，一般可保存25 天。,瓊脂糖凝膠緩沖液,Tris-乙酸鹽和EDTA緩沖液（pH8.0,TAE，也稱為E緩沖液） Tris-硼酸鹽緩沖液(TBE) Tris-磷酸鹽緩沖液(TPE),瓊脂糖凝膠載樣緩沖液,載樣緩沖液是上樣時(shí)與樣品一起加入泳道的。載樣緩沖液有三個(gè)作用： 增加樣品密度以保證DNA沉入加樣孔內(nèi)； 使樣品帶有顏色便于上樣操作； 其中的染料在電場(chǎng)中以可以預(yù)測(cè)的泳動(dòng)速率向陽(yáng)極遷移。 上樣緩沖液有幾種，但基本都包括溴酚藍(lán)和二甲苯氰FF。,溴酚藍(lán)在瓊脂糖凝膠中遷移速率是二甲苯氰FF的2.2倍，這一特性與瓊脂糖凝膠的濃度無(wú)關(guān)；

25、 在0.5TBE瓊脂糖凝膠電泳中溴酚藍(lán)的速率約與長(zhǎng)約300bp的線性雙鏈DNA相同，而二甲苯氰FF約與長(zhǎng)4kb的DNA相同。在0.5%-1.4%濃度的瓊脂糖凝膠中基本不會(huì)變化。,影響電泳遷移率的因素,DNA分子的大小 凝膠的濃度 DNA的構(gòu)象 使用的電壓 瓊脂糖的種類 電泳緩沖液 嵌入染料的存在,DNA分子的大小,DNA分子大小遷移速率U與logN成反比（N為堿基對(duì)數(shù)目）。分子越大，摩擦阻力越大，同時(shí)大分子通過(guò)凝膠孔徑的效率也低于較小的分子，所以分子大的遷移慢。 等量的空間結(jié)構(gòu)，緊密的電泳快（超螺旋線性DNA） 一般來(lái)說(shuō)，分子帶的電荷量越大、直徑越小、形狀越接近球形，則其電泳遷移速度越快。,凝

26、膠的濃度,簡(jiǎn)言之，濃度越大，分子孔徑就越小，DNA遷移速率就越低，反之遷移速率就大。 另外，濃度也跟凝膠的分辨率有關(guān)，濃度越大，分辨率越高，但分離的片段就越小。,DNA的構(gòu)象,一般遷移速率超螺旋環(huán)狀線狀DNA單鏈開環(huán)。,使用的電壓,低電壓時(shí)，線狀DNA片段的遷移速率與所加電壓成正比。使分辨效果好，凝膠上所加電壓不應(yīng)超過(guò)5-8V/cm,DNA電泳常見(jiàn)問(wèn)題分析,二、瓊脂糖凝膠電泳操作,不同電泳儀及水平電泳槽,水平電泳槽和梳子,梳子的作用是制膠時(shí)插入膠中，以便膠凝固后 產(chǎn)生加樣孔。,伯樂(lè)公司（bio-rad）電泳儀,凝膠/電泳槽,凝膠成像系統(tǒng),制膠, 配制5（或10）TBE或TAE或TPE貯存液，分

27、別代表Tris-硼酸、 Tris-乙酸、Tris-磷酸緩沖液 TBE的工作濃度一般為0.5，電泳前將貯存液稀釋至工作濃度。配制凝膠用的TBE和電泳緩沖液應(yīng)濃度一致。 稱取合適重量的瓊脂糖，以便配制成一定濃度的凝膠。如稱取2g瓊脂糖加在100ml 0.5TBE中將制成濃度為2的瓊脂糖凝膠。凝膠濃度越大，剛性越大，一般分辨能力也越強(qiáng)。常用的凝膠濃度在12之間，凝膠濃度太小則凝膠容易太軟而且易碎，不好操作，但有時(shí)候的確需要較小濃度的凝膠。,膠板的制備：將有機(jī)玻璃膠槽兩端分別用橡皮膏緊密封住。將封好的膠槽置于水平支持物上，插上樣品梳子，注意觀察梳子齒下緣應(yīng)與膠槽底面保持1mm左右的間隙。 將配制好的適

28、當(dāng)濃度的凝膠放入微波爐中融解，2分鐘左右即可，需嚴(yán)密觀察，小心操作，戴上微波爐專用手套，隨時(shí)輕輕搖動(dòng)以便瓊脂糖完全融解，均勻分布。（謹(jǐn)防燙傷）,加入EB（可選）：向冷卻至50-60的瓊脂糖膠液中加入溴化乙錠(EB)溶液使其終濃度為0.5g /mL。（貯存液10mg/ml） 倒膠：用移液器吸取少量融化的瓊脂糖凝膠封橡皮膏內(nèi)側(cè)，待瓊脂糖溶液凝固后將剩余的瓊脂糖小心地倒入膠槽內(nèi)，使膠液形成均勻的膠層。 拔梳：待膠完全凝固后撥出梳子，注意不要損傷梳底部的凝膠，然后向槽內(nèi)加入0.5TBE稀釋緩沖液至液面恰好沒(méi)過(guò)膠板上表面。,上樣、電泳,加樣：取10L DNA樣品與2L 6上樣液混勻，用微量移液槍小心加入

29、樣品槽中。若DNA含量偏低，則可依上述比例增加上樣量，但總體積不可超過(guò)樣品槽容量。每加完一個(gè)樣品要更換tip頭，以防止互相污染，注意上樣時(shí)要小心操作，避免損壞凝膠或?qū)悠凡鄣撞磕z刺穿。 電泳：加完樣后,合上電泳槽蓋，立即接通電源?？刂齐妷罕３衷?0-80V（15v/cm），電流在40mA以上。當(dāng)溴酚藍(lán)條帶移動(dòng)到距凝膠前沿約2cm時(shí)，停止電泳。 染色：未加EB的膠板在電泳完畢后移入0.5g/mL的EB溶液中，室溫下染色20-25min。,結(jié)果觀察,觀察和拍照：在波長(zhǎng)為254nm的長(zhǎng)波長(zhǎng)紫外燈下觀察染色后的或已加有EB的電泳膠板。,思考與討論 DNA在電泳槽中泳動(dòng)的原理？ DNA遷移率的影響因素

30、有哪些？,高級(jí)儀器分析技術(shù)實(shí)驗(yàn)四,高效液相色譜法 測(cè)定茶葉中咖啡因,一、高效液相色譜法基礎(chǔ),（一）有機(jī)酸分析系統(tǒng)流程圖,1、2 泵 3 進(jìn)樣器 4 柱溫箱 5 電導(dǎo)檢測(cè)器 6 數(shù)據(jù)處理機(jī) 7 混合室 8 柱子 9 流動(dòng)相 10 緩沖液,分析條件,分離條件 色譜柱：Shim-pack SCR-102H(8mmI.D300mmL.) 1個(gè)或2個(gè)分析柱連接 保護(hù)柱 SCR-102H (6mmI.D.50mmL.) 流動(dòng)相：5mM p-甲苯亞磺酸水溶液 流量 ：0.8mL/min 溫度 ：40或45 檢測(cè)條件 緩沖液：20mM Bis-tris 水溶液 含 5mM p-甲苯亞磺酸和100 EDTA 流

31、量 ：0.8mL/min 檢測(cè)器：電導(dǎo)檢測(cè)器 polarity;+,樣品的分析實(shí)例,食品 啤酒，清酒，葡萄酒，醬油等 體液 血清，尿等 醫(yī)藥品 腎的透析液，鈣制劑等 發(fā)酵 微生物培養(yǎng)液，酸奶等 環(huán)境 工廠廢水等,有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖1,一個(gè)分析柱 1. 磷酸 2. 檸檬酸 3. 丙酮酸 4. 蘋果酸 5. 琥珀酸 6. 乳酸 7. 甲酸 8. 乙酸 9. 乙酰丙酸 10. 焦谷氨酸,啤酒的色譜圖,1. 磷酸 2. 檸檬酸 3. 丙酮酸 4. 蘋果酸 5. 琥珀酸 6. 乳酸 7. 甲酸 8. 乙酸 9. 焦谷氨酸 10. 碳酸 前處理 振蕩除去碳酸氣后， 過(guò)濾10進(jìn)樣,清酒的色譜圖,1. 磷酸

32、 2. 檸檬酸 3. 丙酮酸 4. 蘋果酸 5. 琥珀酸 6. 乳酸 7. 乙酸 8. 焦谷氨酸 前處理 過(guò)濾后，進(jìn)樣10,min.,葡萄酒的色譜圖,1. 磷酸 2. 檸檬酸 3 . 酒石酸 4. 蘋果酸 5. 琥珀酸 6. 乳酸 7. 甲酸 8. 乙酸 9. 焦谷氨酸 前處理 用水稀釋10倍后過(guò)濾 進(jìn)樣量10,min.,醬油的色譜圖,1. 磷酸 2. 檸酸 3. 丙酮酸 4. 蘋果酸 5. 琥珀酸 6. 乳酸 7. 甲酸 8. 乙酸 9. 乙酰丙酸 10. 焦谷氨酸 前處理 用水稀釋10倍后過(guò)濾 進(jìn)樣量10,血清的色譜圖,1. 磷酸 2. 檸檬酸 3. 丙酮酸 4. 乳酸 5. 甲酸 6.

33、乙酸 7. 焦谷氨酸 8. 未知物 前處理 加高氯酸用離心法去沉淀物，取上清液5uL進(jìn)樣,尿樣的色譜圖,1. 磷酸 2. 檸檬酸 3. 乳酸 4. 甲酸 5. 未知物 6. 焦谷氨酸 7 未知物 前處理 過(guò)濾后，進(jìn)樣10,酸奶的色譜圖,1. 磷酸 2. 檸檬酸 3. 琥珀酸 4. 乳酸 5. 甲酸 6. 乙酸 前處理 用水稀釋10倍后過(guò)濾進(jìn)樣量10,工廠廢水的色譜圖,1. 甲酸 2. 乙酸 3. 丙酸 4. 碳酸 5. 丁酸 6. 戊酸 前處理 過(guò)濾后，進(jìn)樣10,（二）氨基酸分析系統(tǒng),氨基酸衍生化方法,柱后衍生 柱前衍生,氨基酸,衍生化后的氨基酸,試劑,色譜柱,檢測(cè)器,色譜柱,檢測(cè)器,氨基酸,

34、試劑,色譜柱,檢測(cè)器,柱后衍生,色譜柱 : 陽(yáng)離子交換柱 試劑 : 茚三酮方法 - UV/VIS 檢測(cè)器 OPA方法 - 熒光檢測(cè)器,柱前衍生 異硫氰酸苯脂（PITC）,Column : Revered Phase Column (ODS) Reagent : OPA (Fluorescence) FMOC (Fluorescence) Fluorescamine (Fluorescence) DANS-Cl (Fluorescence) PITC (UV),柱前衍生步驟,1. 200uL樣品中加入100mM異硫氰酸苯酯 （乙腈溶液）100uL和1M三乙胺（乙腈溶液） 100uL,室溫下放置反

35、應(yīng)1小時(shí) 2. 反應(yīng)液中加入400uL己烷 3. 放置，取下層溶液用一次性濾膜過(guò)濾器 （0 .45um ）過(guò)濾 4. 取濾液4uL注入,（三）液相色譜常見(jiàn)問(wèn)題及故障排除經(jīng)驗(yàn),液相系統(tǒng)維護(hù)流程圖,色譜柱,等度系統(tǒng),儲(chǔ)液瓶,脫氣機(jī),泵單元,手動(dòng)進(jìn)樣器,色譜柱,檢測(cè)器,廢液瓶,1 2 3 4 5 6 7,低壓梯度系統(tǒng),1 2 3 4 5 6 7 8 9,高壓梯度系統(tǒng),1 2 3 4 5 6 7 8,液相色譜故障排除經(jīng)驗(yàn),故障的確定 至少要重復(fù)出現(xiàn)兩次以上 初步判斷故障引起的原因 方法或硬件 由經(jīng)驗(yàn)或平時(shí)的積累確定故障原因 平時(shí)做好觀察和記錄 當(dāng)不能確認(rèn)故障原因時(shí) 采用排除法逐一考察可能引起故障的因素

36、 確定故障能否自行處理 不要貿(mào)然拆卸不熟悉的部件,常見(jiàn)故障因素,儀器環(huán)境： 實(shí)驗(yàn)室的溫度、濕度、酸度等 實(shí)驗(yàn)室震動(dòng)、灰塵等問(wèn)題 電源及地線問(wèn)題 使用條件： 流動(dòng)相（pH值、均勻度、氣泡等） 樣品（樣品分解、氧化、樣品溶劑等） 色譜柱（污染、堵塞、塌陷等） 硬件問(wèn)題： 輸液泵 進(jìn)樣器 檢測(cè)器,平常保養(yǎng),做好平常的保養(yǎng)可以有效的降低故障的發(fā)生率 做好平常的保養(yǎng)可以延長(zhǎng)儀器的使用壽命 常做的保養(yǎng) 保證儀器的使用環(huán)境（經(jīng)常清潔儀器，尤其是灰塵） 泵的保養(yǎng)（使用緩沖鹽時(shí)要清洗柱塞，水和鹽不要長(zhǎng)期 保存在泵里） 進(jìn)樣器要經(jīng)常清洗，避免污染物吸附或堵塞管路 盡量進(jìn)行樣品前處理 色譜柱要定期清洗，保證柱效及使

37、用壽命 系統(tǒng)中不要長(zhǎng)期保存水和鹽，長(zhǎng)時(shí)間不用時(shí)應(yīng)將儀器所 有部分全部更換為70以上的甲醇，避免細(xì)菌的滋生及 鹽的析出。,液相色譜常見(jiàn)問(wèn)題,壓力異常（偏高、波動(dòng)） 漏液 保留時(shí)間漂移 基線問(wèn)題（漂移、噪聲） 峰形異常,壓力是液相色譜中最重要的指標(biāo)，要經(jīng)常關(guān)注壓力的變化。 保留時(shí)間的變化經(jīng)常是由于壓力問(wèn)題引起的。 不同溶劑即使在相同流速和溫度的情況下壓力也是不同的。 記下儀器正常狀態(tài)時(shí)，在固定條件下（流動(dòng)相、流速、溫度等）的壓力顯示值。,壓力過(guò)高時(shí),首先要確認(rèn)是色譜柱堵塞還是系統(tǒng)堵塞 色譜柱堵時(shí)，確認(rèn)可能造成堵塞的樣品的性質(zhì)，相應(yīng)選擇合適的清洗溶劑。 系統(tǒng)堵塞，首先應(yīng)確認(rèn)是哪一部份堵塞，依 據(jù)情況

38、由后向前進(jìn)行排除。,容易發(fā)生堵塞的部件,保護(hù)柱及色譜柱 線路過(guò)濾器 混合器過(guò)濾組件 管路連接處 進(jìn)樣器 檢測(cè)器流通池,壓力過(guò)低,如果壓力為零： 泵頭中沒(méi)有液體，充滿氣泡 單向閥完全堵死 泵的柱塞桿折斷 壓力傳感器損壞(流動(dòng)相流動(dòng)正常，但無(wú)壓力) 如果有壓力但是壓力比正常時(shí)低： 漏液 單向閥堵塞,壓力波動(dòng),壓力在短時(shí)間內(nèi)劇烈波動(dòng)。 泵頭中有氣泡 單向閥臟 柱塞密封圈漏液,經(jīng)常漏液的部件,泵：柱塞密封圈,排液閥 手動(dòng)進(jìn)樣器：轉(zhuǎn)子密封圈磨損 檢測(cè)器： 流通池窗口（墊片損壞、透鏡破碎） 接頭處漏液：（接頭松動(dòng)，接頭臟，接頭磨損，部件不匹配）,保留時(shí)間不穩(wěn)定,吸濾頭臟 泵輸液不正常（壓力波動(dòng)、氣泡等）

39、流動(dòng)相組分變化 流動(dòng)相緩沖能力不夠 色譜柱平衡時(shí)間不夠 柱溫的變化 柱子問(wèn)題,噪音大,流動(dòng)相污染、變質(zhì)或由低品質(zhì)溶劑配成 漏液 流動(dòng)相、泵、檢測(cè)器流通池內(nèi)有氣泡 流動(dòng)相各溶劑不相溶或混和不均勻 檢測(cè)池能量不足 流通池被污染 溫度影響（檢測(cè)器和柱溫差別太大） 其他電子設(shè)備的影響或電源、地線等,基線漂移,流動(dòng)相污染，變質(zhì)或由低品質(zhì)溶劑配成 流動(dòng)相不均勻(脫氣，使用純度更高的溶劑) 溫度波動(dòng) 系統(tǒng)平衡時(shí)間不夠 流通池被污染或有氣泡 流通池窗口破裂,峰形問(wèn)題,死體積太大 柱子被污染或堵塞 色譜柱塌陷 流動(dòng)相緩沖不足或不合適 樣品溶劑選擇不當(dāng)，與流動(dòng)相之間極性差異太大 樣品過(guò)載（濃度或體積） 柱溫過(guò)低,

40、鬼峰,流動(dòng)相被污染 進(jìn)樣閥殘余峰 樣品中未知物 色譜柱中的污染物,死體積,死體積可能會(huì)引起分離度變差和重現(xiàn)性變差等問(wèn)題.,管線,公螺母,死體積,好的連接,差的連接,選擇原則 采用 “HPLC” 級(jí)溶劑 避免使用會(huì)引起柱效損失或保留特性變化的溶劑 對(duì)試樣有適宜的溶解度 溶劑粘度要小 與檢測(cè)器相匹配,流動(dòng)相,水 / 甲醇梯度 ODS 柱,鬼峰,鬼峰的出現(xiàn),流動(dòng)相,水的等級(jí) 純化水 蒸餾水 去離子水,波長(zhǎng) (nm),純化水,去離子水,因?yàn)椴患兾锏拇嬖?，去離子的吸光率較高,純化水中去除了無(wú)機(jī)和有機(jī)的污染物,吸光率,流動(dòng)相,流動(dòng)相的更換,不互溶的流動(dòng)相不能直接更換,緩沖鹽不能直接用有機(jī)溶劑更換,水,正己

41、烷,異丙醇,緩沖鹽,有機(jī)溶劑,水,過(guò)濾：0.45um或更小孔徑濾膜 目的：除去溶劑中的微小顆粒，避免堵塞色譜柱，尤其是使用無(wú)機(jī)鹽配制的緩沖液時(shí)。,溶劑前處理,色譜柱的日常保養(yǎng),購(gòu)買新柱后一定要仔細(xì)閱讀說(shuō)明書，確認(rèn)柱的使用條件以及清洗再生步驟，按照說(shuō)明書條件測(cè)試色譜柱柱效，記錄使用壓力 定期檢測(cè)柱壓和柱效 不同流動(dòng)相之間轉(zhuǎn)換時(shí)應(yīng)注意溶劑的互溶性 確認(rèn)樣品不會(huì)在流動(dòng)相中析出或帶有固體不溶物，請(qǐng)使用0.45um或0.2um的一次性濾膜過(guò)濾樣品，或者進(jìn)行前處理。 為了延長(zhǎng)色譜柱使用壽命，請(qǐng)使用保護(hù)柱。 定期用合適的溶劑清洗或再生色譜柱 長(zhǎng)期不用時(shí)，清洗干凈后，使用柱子說(shuō)明書中指明的溶劑保存。柱子要從儀

42、器上卸下并用堵頭密封后保存。 定期用合適的流動(dòng)相清洗保存的柱子，避免干涸。,二、高效液相色譜法測(cè)定茶葉中咖啡因,實(shí)驗(yàn)?zāi)康?了解高效液相色譜法測(cè)定咖啡因的基本原理 掌握高效液相色譜儀的操作 掌握高效液相色譜法進(jìn)行定性及定量的基本方法 掌握標(biāo)準(zhǔn)曲線定量法,實(shí)驗(yàn)原理 咖啡因（C8H10N4O2）又名咖啡堿，屬甲基黃嘌呤化合物，具有提神醒腦等刺激中樞神經(jīng)的作用，可溶于水、醇、氯仿、二氯甲烷等溶劑。 樣品在堿性條件下，用乙醇抽提，采用反相液相色譜柱進(jìn)行分離，以紫外檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)，以咖啡因標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的色譜峰面積對(duì)其濃度作工作曲線，再根據(jù)樣品中的咖啡因面積，由工作曲線算出濃度。,咖啡因結(jié)構(gòu)式,實(shí)驗(yàn)步驟,1

43、.系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn) 使用咖啡因?qū)φ掌穲D譜驗(yàn)證系統(tǒng)適用性，由圖1所得理論塔板數(shù)為2501.6（大于2000），理論塔板高度為0.099 mm，分離度為6.25（大于1.5），均符合藥典規(guī)定。拖尾因子為1.18（大于1.05）是拖尾峰。,圖1 咖啡因?qū)φ掌啡芤簣D譜,2.色譜條件及溶液制備 （1）色譜條件 色譜柱（TC-C18 Agilent，4.6 mm250 mm，5 m，大連依利特），流動(dòng)相：甲醇-水（29:71），測(cè)定波長(zhǎng)：280 nm(氘燈)，柱溫箱：40 C，流速：1 mL/min，進(jìn)樣體積：10 L。 （2）對(duì)照品儲(chǔ)備液制備 精密稱取干燥至恒重的咖啡因?qū)φ掌?.5 mg于10 mL容量瓶中，加甲醇定容，制成1 mL含咖啡因50 g/mL的對(duì)照品溶液。