1、微生物的分離與純化,指導(dǎo)教師：王海麗,實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹⒁?（1）學(xué)習(xí)并掌握細(xì)菌、放線菌、霉菌和酵母菌等四大類(lèi)微生物的稀釋分離、劃線分離等技術(shù)。 （2）學(xué)習(xí)從樣品中分離、純化出所需菌株。 （3）了解四大類(lèi)微生物的培養(yǎng)條件和培養(yǎng)時(shí)間。 （4）學(xué)習(xí)平板菌落計(jì)數(shù)法（下次實(shí)驗(yàn)）。 以細(xì)菌為例,實(shí)驗(yàn)原理,純種分離技術(shù)是微生物學(xué)中重要的基本技術(shù)之一。分離：從混雜的微生物群體中獲得單一菌株純培養(yǎng)的方法。純種（純培養(yǎng)）：一株菌種或一個(gè)培養(yǎng)物中所有的細(xì)胞或孢子都是由一個(gè)細(xì)胞分裂、繁殖而產(chǎn)生的后代。 微生物的分離與純化技術(shù)的應(yīng)用：分離具有特殊功能的微生物、優(yōu)良菌種及純化被污染的菌種等。 土壤是微生物的大本營(yíng)，混雜著大量

2、的微生物，從中分離可得到只含有這一種微生物的純培養(yǎng)。 稀釋分離法有傾注法和涂布法兩種；菌種被其他雜菌污染時(shí)或混合菌懸液常用劃線法進(jìn)行純種分離。 要獲得某種微生物的純培養(yǎng)，還需提供有利于該微生物生長(zhǎng)繁殖的最適培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件。 微生物四大類(lèi)菌的分離培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間詳見(jiàn)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)書(shū)P67表格。細(xì)菌常用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，在30-37 溫度下培養(yǎng)1-2天。 平板菌落計(jì)數(shù)活菌計(jì)數(shù),0.9,0.1,0.9ml,分離純化基本流程,實(shí)驗(yàn)儀器、材料,實(shí)驗(yàn)材料 菌源:土樣10g; 培養(yǎng)基 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基; 實(shí)驗(yàn)儀器與用具 1)超凈工作臺(tái)、恒溫培養(yǎng)箱、酒精燈 2）1000ul及100ul移液槍、100

3、0ul及100ul槍頭、無(wú)菌1.5ml的離心管、離心管架 3）無(wú)菌平皿、涂布棒、接種環(huán) 實(shí)驗(yàn)試劑:無(wú)菌水;,實(shí)驗(yàn)內(nèi)容,1、采土樣: 選擇肥沃土壤,去表層土,挖520cm深度的土壤數(shù)10g,裝入已滅菌的牛皮紙袋,封好袋口,帶回實(shí)驗(yàn)室。 2、制備土壤稀釋液： 稱(chēng)取土樣1.0g，放入盛99ml無(wú)菌水的三角瓶中，置搖床振蕩20min使土壤均勻分散成為土壤懸液（10-2）。用100ul移液槍從中吸取100ul土壤懸液，注入事先分裝有900ul無(wú)菌水的離心管中，吹吸3次，振蕩均勻（10-3）。然后同樣方法，配置成稀釋度為10-4，10-5的土壤菌懸液。,3、分離1）涂布法 用一支新的無(wú)菌槍頭，由低濃度開(kāi)始

4、，從各濃度土壤稀釋液中各吸取100ul，對(duì)號(hào)較均勻地放入已寫(xiě)好稀釋度的牛肉蛋白胨培養(yǎng)基平板上，用灼燒冷卻后的無(wú)菌玻璃涂棒涂勻。每個(gè)濃度做3個(gè)平板（重復(fù)）。 2）傾注法 用一支新的無(wú)菌槍頭，由低濃度開(kāi)始，從各濃度土壤稀釋液中各吸取100ul，對(duì)號(hào)較均勻地放入已寫(xiě)好稀釋度的空白無(wú)菌平皿中，然后在各平皿中加入已經(jīng)融化并冷卻到45 -50的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（已滅菌）12-15ml，將培養(yǎng)皿在超凈工作臺(tái)面上輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)，使稀釋的菌懸液與融化的培養(yǎng)基混合均勻，直至培養(yǎng)基凝固。 注意：無(wú)菌操作；用槍頭吸取菌懸液時(shí)注意“吹打數(shù)次”確?；靹颉?4、培養(yǎng) 待平板上液體被完全吸收，將平板倒置于370C溫箱中培養(yǎng)24h

5、；,5、菌落計(jì)數(shù)含菌樣品的微生物經(jīng)稀釋分離培養(yǎng)后，每一個(gè)活菌細(xì)胞可在平板上繁殖形成一個(gè)肉眼可見(jiàn)的菌落，故可據(jù)平板上菌落的數(shù)目推算出每克含菌樣品中所含的活菌總數(shù)（菌落形成數(shù)目）。 每克含菌樣品中微生物的活細(xì)胞數(shù)（菌落形成數(shù)，CFU （同一稀釋度平板上菌落平均數(shù) 10稀釋倍數(shù)）/含菌樣品克數(shù),菌落計(jì)數(shù)規(guī)則： 選擇平均菌落數(shù)在30300間的平板 1、只有一個(gè)稀釋度符合，以該稀釋度的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告； 2、有兩個(gè)稀釋度符合，取決于二者比值（高稀釋度的菌落數(shù)除以低稀釋度的菌落數(shù)的值）： 1）若0.5比值2，以?xún)上♂尪鹊木鋽?shù)乘稀釋倍數(shù)所得的值的均值報(bào)告。 2）若2比值或比值 0.5，則取其中較

6、少的菌落總數(shù)進(jìn)行報(bào)告。 3、若所有稀釋度的菌落平均數(shù)均大于300，則按稀釋倍數(shù)最高的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告； 4、若所有稀釋度的菌落平均數(shù)均小于30，則按稀釋倍數(shù)最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告； 所有菌落數(shù)均不在30300間 以最接近30或300的平均菌落數(shù)乘稀釋倍數(shù),6、挑菌劃線分離 挑取單個(gè)菌落（細(xì)菌菌落），分別在平板上做分區(qū)和連續(xù)劃線。 370C培養(yǎng)48h檢查菌落是否單純。 劃線方法：詳見(jiàn)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)書(shū)P72、P237 無(wú)菌操作（ 近火焰處操作）： 接種環(huán)灼燒滅菌、冷卻 左手取涂布分離培養(yǎng)后平板 右手用接種環(huán)挑取涂布分離培養(yǎng)的平板中的目的單菌落 用已經(jīng)粘有菌體的接種環(huán) 于另一新的空白平板中劃線 分區(qū)劃線法：灼燒、冷卻、取菌 區(qū)1劃線 灼燒、冷卻 區(qū)2劃線 區(qū)3劃線 灼燒、冷卻 區(qū)4劃線 完畢、灼燒 連續(xù)劃線法：灼燒、冷卻、取菌 連續(xù)劃線 完畢、灼燒,結(jié)果與討論,計(jì)算含菌樣品中的