1、建立PCR實驗室的基本條件臨床基因擴增實驗室采用PCR技術用于臨床基因診斷，由于PCR技術對所檢測的核酸模板進行大量擴增，容易出現實驗室污染導致臨床檢測標本假陽性結果；另外由于PCR技術要求高、影響因素多（特別是RNA標本），實驗過程處理不當易導致核酸模板無擴增現象，導致臨床標本假陰性結果。因此臨床基因擴增檢驗實驗室技術驗收和規(guī)范化管理是PCR技術本身需要，也是在臨床上順利應用該技術前提。 二、PCR實驗室驗收準備工作 （一） 硬件準備實驗室基本建設 1. 根據文件要求，臨床基因擴增檢驗實驗室原則上分為四個單獨的工作區(qū)域：試劑貯存和準備區(qū)；標本制備區(qū)；擴增反應混合物配制和擴增區(qū)；擴增產物分析區(qū)

2、，如使用全自動封閉分析儀器檢測，此區(qū)域可不設。 2. 各工作區(qū)域必須有明確的標記，避免不同工作區(qū)域內的設備、物品混用。 3. 進入各工作區(qū)域必須嚴格按照單一流向進行，即試劑貯存和準備區(qū)標本制備區(qū)擴增反應混合物配制和擴增區(qū)擴增產物分析區(qū)。 4. 不同的工作區(qū)域使用不同的工作服（不同的顏色）。工作人員離開各工作區(qū)域時，不得將工作服帶出。 5. 工作區(qū)域儀器設備配置標準n 試劑貯存和準備區(qū) 28和-15冰箱：混勻器；微量加樣器（覆蓋11000l）；移動紫外燈（近工作臺面）；消耗品：一次性手套、一次性吸水紙、耐高壓處理的離心管和加樣器吸頭（帶濾心）；專用工作服和工作鞋；專用辦公用品等。n 標本制備區(qū)

3、28冰箱，-20或-80冰箱；高速臺式冷凍離心機；混勻器；水浴箱或加熱模塊；微量加樣器（覆蓋11000l）；可移動紫外燈（近工作臺面）；超凈工作臺，消耗品；一次性手套、一次性吸水紙、耐高壓處理的離心管和加樣器吸頭（帶濾心）；專用工作服和工作鞋；專用辦公用品等。n 擴增反應混合物配制和擴增區(qū)核酸擴增儀；微量加樣器（覆蓋11000l）；可移動紫外燈（近工作臺面）；消耗品：一次性手套、一次性吸水紙、耐高壓處理的離心管和加樣器吸頭（帶濾心）；專用工作服和工作鞋；專用辦公用品等。n 擴增產物分析區(qū)視檢測方法不同而定。基本儀器設備如下：微量加樣器（覆蓋1200l）；可移動紫外燈（近工作臺面）；消耗品：一次

4、性手套、一次性吸水紙、耐高壓處理的離心管和加樣器吸頭（帶濾心）；專用工作服和工作鞋；專用辦公用品等。（二）軟件建設質量手冊編寫與實施、人才資源（上崗證培訓與相關知識學習） 1.臨床基因擴增檢驗實驗室的質量手冊編寫質量手冊是闡明臨床基因擴增檢驗實驗室的質量方針，并描述過其質量體系的文件。質量手冊規(guī)定了質量體系的基本結構，是實施和保持質量體系應長期遵循的文件。臨床基因擴增檢驗實驗室質量手冊編寫應依照衛(wèi)生部下發(fā)兩個文件，并結合本實驗室實際情況編寫適合本實驗室的切實可行的質量手冊。質量手冊的提綱應包括三部分：質量方針和宗旨；工作制度；標準操作文件（SOP）（1）質量方針和宗旨制定臨床基因擴增檢驗實驗室

5、的質量管理目標和質量保證體系的結構體系和總方針。（2）工作制度一般應包括以下文件：實驗室的設置、布局及組織結構；實驗室內務管理制度；實驗室的人員配置及管理制度；生物的防護與安全制度；實驗室廢棄物處理制度；實驗室清潔消毒制度；儀器設備的管理制度；儀器、試劑、耗材購置程序及管理制度；臨床標本的管理制度；實驗室記錄的管理制度；質量控制工作管理制度；結果報告管理制度；抱怨的內部處理制度；負責人及質檢員職責；崗位設置和責任制等 （3）標準操作程序（SOP）一般包括：消毒液配制標準操作程序：消毒標準操作程序；超凈工作臺使用標準操作程序；超凈工作臺維護和保養(yǎng)標準操作文件；PCR儀使用標準操作程序；PCR儀維

6、護和保養(yǎng)標準操作程序；高速低溫離心機使用標準操作程序；移液器使用標準操作程序；冰箱維護和保養(yǎng)標準操作程序；電熱恒溫水浴箱操作程序；電子天平使用和校正操作程序；可移動紫外消毒車使用操作程序；加樣器校準標準操作程序；離心機維護保養(yǎng)操作程序；溫度計校準程序；試劑的質檢操作程序；標本唯一標識編號編制規(guī)則；臨床標本的采集及處理操作程序；臨床標本的保存程序；乙肝病毒核酸擴增熒光檢測標準操作程序；丙肝病毒核酸擴增熒光檢測標準操作程序；結核分枝桿菌核酸擴增熒光檢測標準操作程序；沙眼衣原體核酸擴增熒光檢測標準操作程序等 （4）引用圖表：PCR擴增可接受標本記錄表；PCR擴增拒收標本記錄表；室內質控結果記錄表；室

7、間質控記錄表；消耗性材料驗收記錄表；試劑驗收記錄表；故障處理表；臺階式高速離心機使用記錄表；臺式高速冷凍離心機使用記錄表；擴增儀維護保養(yǎng)記錄表；人員培訓計劃及培訓記錄表；實驗室工作人員一覽表；主要設備一覽表；實驗室清潔消毒記錄表；工作區(qū)溫度、濕度記錄表；抱怨記錄表；標本超低溫保存記錄表；應急處理記錄表；垃圾處理記錄表；冰箱溫度記錄表；水浴箱溫度記錄表；移動紫外消毒車記錄表；設備校正記錄表；檢測結果報告流程；報告單樣張；臨床送檢標本流程圖；實驗室組織結構圖。為了對以個特定序列進行PCR做重復檢測,需要三個不同的區(qū)域,每一個區(qū)域的具體技術操作和試劑在下面詳細列出. 1、樣品準備區(qū)這個區(qū)域專門用作樣

8、品的準備，在制備和操作用于核酸提取的試劑時應該采取預防措施：1）PCR產物和帶有要擴增序列的DNA克隆不能在這個房間操作。2）組織培養(yǎng)物、組織標本和血清樣品都帶進樣品準備間處理，以根據應用的需要提取DNA或RNA。3）用于樣品處理的工具不能被用作普通分子克隆的工具，也不能用作操作靶序列。4）DNA樣品應該用有專門的防護或正壓活塞式移液管操作，以防止在吸取樣品時有氣溶膠遺留。5）大體積樣品應該用單獨包裝的無菌一次性移液管吸取。6）管子打開前都要簡短離心以減少氣溶膠的產生，而且管子不能用力崩開，這樣會產生氣溶膠。7）任何時候都應該穿實驗服和帶手套，手套要經常更換，尤其在抽提過程中每一步之間都要更換

9、。實驗服要專門用于樣品準備間，經常清洗。2、樣品準備和RNA-PCR RNA-PCR的額外步驟需要額外的樣品操作，這樣增加了樣品之間污染的機會。為了避免這一問題，反轉錄一步可以在樣品準備區(qū)進行。在RNA-PCR中應用UNG以防止污染的方法也有報道。3、前PCR區(qū)必須有專門用于準備各種反應的區(qū)域，這個區(qū)域必須保持干凈，而且沒有來自克隆和樣品準備的污染。前PCR區(qū)必須要有試劑和準備，特別是專門用于前PCR區(qū)的正壓活塞式移液管。4、PCR實驗室試劑的操作1）所用的所有溶液都應該沒有核酸和（或）核酸酶（DNase和RNase）污染。2）所有PCR試劑中使用的水都應該是高質量的新鮮蒸餾的去離子水，用0.

10、22m過濾的，并且是高壓滅菌。3）在20到25貯存的試劑建議加點像疊氮鈉一類的抗微生物劑，在擴增試劑或樣品制備試劑中加入0.025%的疊氮鈉不抑制擴增反應。4）所用試劑都應該以大體積配制，實驗一下看試劑是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量進行貯存。5）所有試劑和樣品準備過程中都要使用一次性滅菌的瓶子和管子。6）新配制的試劑在用于準備新的標本之前應該加以檢驗。7）樣品準備和前PCR區(qū)所使用的移液管在不使用時都應該小心保存。5、在前PCR區(qū)建立PCR混合物1）可以把即刻可用的“主混合物”溶液配好、分裝并保存在-20或4，在實驗室只涉及到擴增一種或少數幾種特異序列時這樣做很有用。2）如果你的實驗室使

11、用多套引物，以致于配制包括所有試劑的單一反應混合物不夠經濟，可以考慮分裝保存夠一天的PCR成分。3）作為一個規(guī)則，應該保存一套陰性、弱陽性和強陽性對照樣品來分析樣品配制和PCR前過程的效率和潔凈程度。而且，你也希望通過使用一個已知的弱陽性樣品來驗證你的樣品緩沖液以證明里面不含擴增抑制物。4）陰性樣品要與每組樣品同時做，以分析是否存在樣品與樣品之間的污染以及是否存在PCR產物的污染，陰性對照應該包括核酸以外的所有試劑。5）當做陽性對照時，有兩個理由決定了應該使用最少數量的核酸。6）由于必須有對照反應，對照模板的特點應該予以考慮。6、控制污染的方法已設計出很有力的酶學方法用來消除一種形式的污染使用

12、UNG，這一技術能有效地消除由PCR產物引起的污染。另一種控制污染的方法是使用紫外線，這種方法不能完全消除污染問題，但可以將污染降低幾個數量級。7、PCR儀的位置8、后PCR區(qū)PCR完成以后，需要分析樣品并解釋數據，應該留出一個專門用于反應后處理樣品的地方。后PCR活動中使用的所用試劑、一次性耗材和儀器都必須是專門用于這一目的，決不能把實驗室這一區(qū)域的試劑或儀器用于任何前PCR活動。n 熒光定量PCR實驗室所需儀器設備清單 （衛(wèi)生部推薦）序號 儀器設備、輔助材料名稱 放置地點 1 冰箱 試劑準備區(qū) 2 紫外線消毒燈 試劑準備區(qū) 3 混勻器 試劑準備區(qū) 4 可調式移液器（1-10l），(5-40

13、ul)，(20-200ul)一套三把 試劑準備區(qū) 5 高速臺式離心機 試劑準備區(qū) 6 專用工作服和衣柜 試劑準備區(qū) 7 冰箱 樣品準備區(qū) 8 紫外線消毒燈 樣品準備區(qū) 9 生物安全柜B2級 樣品準備區(qū) 10 冷凍高速離心機（丙肝專用） 樣品準備區(qū) 11 恒溫金屬浴 樣品準備區(qū) 12 混勻器 樣品準備區(qū) 13 可調式移液器(5-40ul)， (20-200ul) ，(200-1000ul)一套 樣品準備區(qū) 14 專用工作服和衣柜 樣品準備區(qū) 15 紫外線消毒燈 PCR擴增區(qū)和產物分析區(qū) 16 可調式移液器（1-10l），(5-40ul)， (20-200ul)一套 PCR擴增區(qū)和產物分析區(qū) 17 專用工作服和衣柜 PCR擴增區(qū)和產物分析區(qū) 18 熒光定量PCR檢測儀 PCR擴增區(qū)和產物分析區(qū) n 所有四區(qū)均需準備的儀器設備為： 專用工作服和工作鞋 專用辦公用品 一次性手套、一次性吸水紙 可移動紫外燈（近工作臺面） 微量加樣器一套（覆蓋11000ul） 以上物品各一套。 l 試劑貯存和準備區(qū)28和-15冰箱混勻器（可加熱）耐高壓處理的離心管和加樣器