1、第八章原生質(zhì)體培養(yǎng)，目的和要求掌握植物細(xì)胞原生質(zhì)體培養(yǎng)的意義，了解原生質(zhì)體分離、純化和活力測(cè)定的方法。掌握植物原生質(zhì)體的培養(yǎng)方法和特性，以及存活率、密度和產(chǎn)量的測(cè)定方法。掌握原生質(zhì)體融合的概念，介紹原生質(zhì)體融合的方法，了解雜交細(xì)胞和雜交植物的篩選和鑒定方法。具備原生質(zhì)體分離和純化的基礎(chǔ)知識(shí)，具備原生質(zhì)體培養(yǎng)的基本能力，能夠理解原生質(zhì)體融合的概念和方法。原生質(zhì)體空細(xì)胞被原生質(zhì)膜包圍，細(xì)胞壁從原生質(zhì)體中去除。原生質(zhì)體無(wú)細(xì)胞壁，有利于細(xì)胞融合、體細(xì)胞雜交、基因轉(zhuǎn)移和單細(xì)胞培養(yǎng)。2.原生質(zhì)體容易吸收外來(lái)遺傳物質(zhì)，并作為理想的受體系統(tǒng)，研究各種遺傳操作，實(shí)現(xiàn)體細(xì)胞雜交在植物遺傳育種中的應(yīng)用。1.植物細(xì)胞

2、壁的結(jié)構(gòu)和化學(xué)組成。植物細(xì)胞壁：初生壁：纖維素，半纖維素，果膠次生壁：纖維素，半纖維素2。相鄰細(xì)胞的初生壁之間有一個(gè)中間層(細(xì)胞間層):果膠酸鈣和果膠酸鎂果膠化合物是一種高度可塑性和親水性的交替，它能使相鄰細(xì)胞粘在一起第1節(jié)原生質(zhì)體的分離和純化(2)細(xì)胞壁降解酶植物原生質(zhì)體分離的酶：纖維素酶：半纖維素酶：果膠酶：(3)物質(zhì)來(lái)源1。源葉、花瓣、果組織、花瓣髓、子葉等。特別是葉肉細(xì)胞、培養(yǎng)細(xì)胞和由不同部分形成的懸浮細(xì)胞。2.預(yù)處理1)低溫處理2)等滲溶液處理、1。機(jī)械分離釋放原生質(zhì)體的缺點(diǎn)：原生質(zhì)體的產(chǎn)量很低；該方法繁瑣、費(fèi)力；由于質(zhì)量與墻體的高度分離，它有很大的局限性。優(yōu)點(diǎn)：可消除外源酶對(duì)分離原

3、生質(zhì)體結(jié)構(gòu)和代謝活性的有害影響。(4)分離方法；(2)酶分離法產(chǎn)量高、活力強(qiáng)、完整性好。原生質(zhì)體的分離是最有效的。(1)酶的類型和特性大多數(shù)用于分離原生質(zhì)體的酶是復(fù)雜的酶制劑，可分為：1。纖維素酶2、半纖維素酶3、果膠酶4、破碎酶5、蝸牛酶；(2)酶溶液1的制備。酶的比例和濃度。滲透壓、穩(wěn)定劑和酸堿度。兩步分離法。用果膠酶分離植物組織，收集細(xì)胞，洗滌后用纖維素酶解離細(xì)胞壁，得到原生質(zhì)體。2.一步分離。一定量的纖維素酶和果膠酶形成混合酶溶液，對(duì)物料進(jìn)行一次處理。葉肉原生質(zhì)體分離純化，純化葉肉原生質(zhì)體，1、沉降法(過(guò)濾離心法):低速離心使原生質(zhì)體沉到底。2.漂浮法：根據(jù)原生質(zhì)體和細(xì)胞或細(xì)胞碎片的不

4、同比重，分離原生質(zhì)體。3.不連續(xù)梯度離心法：首先將不同濃度的Ficoll溶液放入離心管中形成不同的梯度，將1-2ml酶原生質(zhì)體混合物滴入上部，以150g離心5分鐘，不同比重的原生質(zhì)體漂浮在不同濃度梯度的界面上。然后，用吸管處理原生質(zhì)，懸浮并清洗它們以備后用。(2)原生質(zhì)體的純化；(1)熒光素二乙酸法；(2)用0.1%酚藏紅花或伊文思藍(lán)染色。3.形態(tài)識(shí)別在形態(tài)學(xué)上是完全的，包含完整的細(xì)胞質(zhì)，具有新鮮顏色的原生質(zhì)體是活的。(3)原生質(zhì)體活力的測(cè)定。(1)通常，選擇淺黃色和顆粒狀愈傷組織、懸浮細(xì)胞系或繼代培養(yǎng)后健壯植物上的年輕外植體作為試驗(yàn)材料。2.根據(jù)酶的種類、組合和酶解時(shí)間選擇高純度的酶，根據(jù)酶

5、解材料細(xì)胞壁的特性和酶的活性確定合適的酶液組合。酶濃度不應(yīng)過(guò)高，酶解時(shí)間不應(yīng)過(guò)長(zhǎng)，最好不超過(guò)8小時(shí)。木本植物細(xì)胞壁成分較厚，半纖維素較多，應(yīng)適當(dāng)添加半纖維素。滲透壓穩(wěn)定劑主要有兩種類型：一種是目前最常用的由糖醇或可溶性糖組成的有機(jī)溶液。通常使用甘露醇或山梨醇，有些是蔗糖，甘露醇是最常用的。一種是無(wú)機(jī)鹽，由培養(yǎng)基中的氯化鈣、硫酸鎂、氯化鉀或無(wú)機(jī)鹽組成。優(yōu)點(diǎn)是原生質(zhì)體產(chǎn)量高，但缺點(diǎn)是會(huì)降低細(xì)胞壁降解酶的活性，使高濃度無(wú)機(jī)鹽進(jìn)入細(xì)胞，從而影響培養(yǎng)效果。4.影響原生質(zhì)體數(shù)量和活力的因素。4.質(zhì)膜穩(wěn)定劑為了提高質(zhì)膜的穩(wěn)定性和增加原生質(zhì)體的產(chǎn)量，可以在酶溶液中加入聚陽(yáng)離子和無(wú)機(jī)鈣離子作為質(zhì)膜穩(wěn)定劑。一般加

6、入0.5%-1.0%的葡聚糖硫酸鉀或0.1%的氯化鈣。4.影響原生質(zhì)體數(shù)量和活力的因素。酶溶液的酸堿度對(duì)原生質(zhì)體的產(chǎn)量和活力有很大影響，不同的植物材料對(duì)酶溶液的要求也不同，一般為5.5-5.8。如果原生質(zhì)體的供體材料是植物器官，應(yīng)在酶溶液中加入酸堿度緩沖液以保持酶溶液的酸堿度穩(wěn)定，一般加入0.05-0.1%的磷酸鹽或3.0-5.0摩爾/升的MES。第四，影響原生質(zhì)體數(shù)量和活力的因素。培養(yǎng)基1，碳源：葡萄糖2，氮源：谷氨酰胺3，生長(zhǎng)物質(zhì)：生長(zhǎng)素和細(xì)胞。5.滲透壓：高滲溶液，通常在培養(yǎng)過(guò)程中逐漸過(guò)渡。常見(jiàn)的滲透劑是甘露醇和山梨醇。6.PH5.66.0，用醋酸纖維素微孔膜過(guò)濾和滅菌，第二節(jié)原生質(zhì)體培

7、養(yǎng)，第二節(jié)培養(yǎng)方法，1。將液體淺培養(yǎng)原生質(zhì)體(密度約為2105/ml)懸浮在液體培養(yǎng)基中，將懸浮物質(zhì)移至直徑為60厘米(2-3毫米為合適)的平板上，5-10天后開(kāi)始原生質(zhì)體分裂。特點(diǎn)：通風(fēng)良好，原生質(zhì)體代謝。操作簡(jiǎn)單，微培養(yǎng)，細(xì)胞平板種植率高。然而，原生質(zhì)體沉淀和分布不均勻，有許多細(xì)胞團(tuán)，這使得很難形成單一細(xì)胞系。2.平板法培養(yǎng)的原生質(zhì)體(密度為4105/毫升)與相同體積的瓊脂糖培養(yǎng)基均勻混合，置于6厘米培養(yǎng)皿(2-3毫米)中。黑暗培養(yǎng)5-7天后，原生質(zhì)體開(kāi)始分裂。其特點(diǎn)是原生質(zhì)體分布均勻，有利于分裂，易于獲得單細(xì)胞系，可在固定位置觀察到。原生質(zhì)很容易被熱破壞和破碎。原生質(zhì)體在高滲透壓下總是生

8、長(zhǎng)緩慢，而且種植率低。3。懸浮培養(yǎng)將含有一定密度原生質(zhì)體的懸浮液滴在6厘米培養(yǎng)皿蓋的內(nèi)側(cè)，用液體如培養(yǎng)液和滲透劑潤(rùn)濕培養(yǎng)皿底部，同時(shí)將培養(yǎng)液滴懸浮在培養(yǎng)皿蓋中。特點(diǎn)：用料少，培養(yǎng)液消耗少，有利于通風(fēng)和觀察?？捎糜诓煌芏仍|(zhì)體培養(yǎng)和單細(xì)胞培養(yǎng)的對(duì)比試驗(yàn)。4.雙層培養(yǎng)、固體培養(yǎng)、液體培養(yǎng)和淺層培養(yǎng)相結(jié)合效果最好。用平板培養(yǎng)法將原生質(zhì)體包埋在培養(yǎng)皿底部，然后加入相同組成的液體培養(yǎng)基進(jìn)行暗培養(yǎng)。需要更換新鮮的液體培養(yǎng)基。特點(diǎn)：原生質(zhì)體分布均勻，有利于分裂，易于獲得單細(xì)胞系，能清除抑制分裂的有害物質(zhì)，細(xì)胞平板種植率高。原生質(zhì)很容易被熱破壞和破碎。5.飼養(yǎng)培養(yǎng)方法飼養(yǎng)的細(xì)胞用作帶有培養(yǎng)基的平板。這種平

9、板被稱為飼養(yǎng)層，通過(guò)x光或紫外線照射使細(xì)胞核失活但保持細(xì)胞存活，然后通過(guò)液體淺層培養(yǎng)或平板技術(shù)將原生質(zhì)體鋪在飼養(yǎng)層上。特征：由一種植物細(xì)胞制成的平板支持另一種植物原生質(zhì)體的生長(zhǎng)。飼養(yǎng)層沒(méi)有物種特異性。，原生質(zhì)體培養(yǎng)程序示意圖，3。確定原生質(zhì)體存活率、密度和產(chǎn)量，(1)通過(guò)二乙酸熒光素染色確定存活率=存活的原生質(zhì)體數(shù)量/總原生質(zhì)體100，(2)確定原生質(zhì)體密度(原生質(zhì)體數(shù)量/毫升)=(原生質(zhì)體數(shù)量/1個(gè)區(qū)域)104倍稀釋，(3)確定原生質(zhì)體產(chǎn)量Y=DV/FW Y(個(gè)體/克)原生質(zhì)體產(chǎn)量d(個(gè)體/毫升)存活的原生質(zhì)體密度V(毫升)原生質(zhì)體懸浮液的總體積FW(克)用于原生質(zhì)體制備的材料的鮮重；4.影

10、響原生質(zhì)體培養(yǎng)的因素：1.選擇健康植物或具有旺盛分裂的愈傷組織上的外植體用于原生質(zhì)體活力2。原生質(zhì)體初始密度一般為5000-10000個(gè)細(xì)胞/毫升，護(hù)理培養(yǎng)可降低培養(yǎng)密度。3.滲透穩(wěn)定劑在原生質(zhì)體培養(yǎng)中，除了2-3%的蔗糖作為穩(wěn)定劑外，還使用0.3-0.5毫升/升的甘露醇。有些人用葡萄糖完全或部分代替甘露醇，效果也很高。5.影響原生質(zhì)體培養(yǎng)的因素。培養(yǎng)基成分1)基本培養(yǎng)基：MS、B5、Nitsch、N6、KM-8P 2)碳源：葡萄糖(最常用)3)無(wú)機(jī)鹽濃度和氮形式：無(wú)機(jī)鹽濃度不應(yīng)太高，尤其是銨態(tài)氮濃度不應(yīng)太高。4)植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的濃度比為5。培養(yǎng)條件光照：原生質(zhì)體在培養(yǎng)的初始階段不需要光照，而

11、是在黑暗中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞團(tuán)形成時(shí)，它們?cè)诠庀屡囵B(yǎng)。強(qiáng)光抑制：261 6的細(xì)胞分裂溫度，植物材料和基因型。第三部分是原生質(zhì)體融合，也稱為體細(xì)胞雜交，即不同親本雜交的分離原生質(zhì)體在人工控制下像有性細(xì)胞受精一樣相互融合。在自然條件下，原生質(zhì)體自然融合的頻率極低，必須使用某些方法來(lái)誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合。原生質(zhì)體融合，甘薯原生質(zhì)體融合植物2。原生質(zhì)體融合的方法和過(guò)程。無(wú)機(jī)鹽誘導(dǎo)硝酸鈉。聚乙二醇誘導(dǎo)劑與高鈣1。聚乙二醇誘導(dǎo)劑溶液制備：分子量4000-6000。2.高鈣高酸堿度溶液3。原生質(zhì)體培養(yǎng)基：NT和MS，4。融合過(guò)程(1)原生質(zhì)體收集(2)將150微升混合親本的原生質(zhì)體懸浮液滴在載體玻璃上形成薄層。(3)

12、吸收450微升聚乙二醇融合誘導(dǎo)液，使聚乙二醇溶液逐漸與原生質(zhì)體接觸，促進(jìn)原生質(zhì)體粘附。(4)保溫后，取0.5毫升高鈣高酸堿度溶液，滴入原生質(zhì)體懸浮液和聚乙二醇的混合溶液中。(5)吸收2ml原生質(zhì)體培養(yǎng)基，洗滌經(jīng)聚乙二醇處理的原生質(zhì)體5次。(6)在載玻片上添加一層原生質(zhì)體生長(zhǎng)所需的培養(yǎng)基(7)計(jì)算融合率=融合數(shù)/雙親原生質(zhì)體總數(shù)100%，完全洋蔥原生質(zhì)體(40)，完全煙草原生質(zhì)體(40)，(3)電融合技術(shù)1。離心原生質(zhì)體懸浮液，除去上清液，用電擊溶液(10%甘露醇0.5摩爾/升醋酸鎂)2。對(duì)電融合儀的交變電場(chǎng)頻率、高壓方波幅度、持續(xù)時(shí)間、頻率和間隔進(jìn)行預(yù)設(shè)測(cè)試。3.取1-2滴電熔儀電極間的懸浮液。4.1-2分鐘后，給出瞬時(shí)高電平電脈沖。雜交細(xì)胞的篩選和鑒定(1)互補(bǔ)篩選1。白化互補(bǔ)選擇2。營(yíng)養(yǎng)缺陷型互補(bǔ)選擇3?？剐曰パa(bǔ)選擇4。代謝互補(bǔ)選擇2。雜交細(xì)胞的機(jī)械分離。雙熒光標(biāo)記選擇和雙熒光標(biāo)記。作業(yè)：1。